Գենետիկական փոխակերպումը բույսերի բջիջներում ուլտրաձայնային օգնությամբ
Sonication-Assisted Agrobacterium Mediated Transformation (SAAT) արդյունավետ մեթոդ է բույսերի բջիջները վարակելու օտար գեներով՝ օգտագործելով Agrobacterium-ը որպես փոխադրող: Ուլտրաձայնային կավիտացիան առաջացնում է սոնոպորացիա, որը կարելի է բնութագրել որպես բույսերի հյուսվածքի նպատակային միկրո վերք: Այս ուլտրաձայնային միկրովերքերի միջոցով ԴՆԹ-ի և ԴՆԹ-ի վեկտորները կարող են արդյունավետ կերպով տեղափոխվել բջջային մատրիցա:
sonoporation – Ուլտրաձայնային ուժեղացված բջիջների փոխակերպում
Երբ ցածր հաճախականության ուլտրաձայնը (մոտ 20 կՀց) կիրառվում է բջիջների կախոցների վրա, ակուստիկ կավիտացիայի հետևանքները առաջացնում են բջիջների հյուսվածքների վրա մեմբրանի անցողիկ թափանցելիություն: Այս ուլտրաձայնային ազդեցությունը հայտնի է որպես սոնոպորացիա և օգտագործվում է բջիջների կամ հյուսվածքների մեջ գեների փոխանցման համար:
Ultrasonication-ի առավելությունները հիմնված են դրա ոչ ջերմային մեխանիկական աշխատանքի սկզբունքի վրա, որը ստիպում է sonication-ը հաճախ ավելի բազմակողմանի լինել և ավելի քիչ կախված լինել բջիջների տեսակներից: Սոնոպորացիայի բազմակողմանի կիրառումը հնարավորություն է բացում տրանսգենային բույսերի օգտագործման համար, որոնք զգալի ներուժ ունեն մարդկային բարդ թերապևտիկ սպիտակուցների կենսաարտադրության մեջ: Բույսերի վրա հիմնված նման կենսառեակտորները կարող են հեշտ գենետիկորեն մանիպուլյացիայի ենթարկվել, կանխել պոտենցիալ աղտոտումը մարդու պաթոգեններով, չեն վնասում վերափոխման միջնորդ բակտերիաներին (օրինակ՝ Ագրոբակտերիում) և հանդիսանում են կենսասինթեզի էժան, արդյունավետ մեթոդ:
Ուլտրաձայնային սարք UP200St (200W, 26kHz) ձայնային պարիսպով
Ուլտրաձայնային օգնությամբ բջիջների փոխակերպում
Sonication-ը տեխնիկա է, որը կիրառում է ցածր հաճախականության ուլտրաձայնային ալիքներ՝ լուծույթում մասնիկները խառնելու, լուծույթները խառնելու համար՝ դրանով իսկ մեծացնելով զանգվածի փոխանցման և տարրալուծման արագությունը: Միաժամանակ, sonication-ը կարող է հեռացնել լուծված գազերը հեղուկներից: Բույսերի փոխակերպման ժամանակ ձայնային ախտահանումը կառաջացնի միկրովերքերի ձևավորում բույսերի հյուսվածքի վրա և կուժեղացնի մերկ ԴՆԹ-ի առաքումը բույսի պրոտոպլաստ:
Գենետիկ փոխակերպման համար Sonication-Assisted Agrobacterium-ի միջնորդավորված տրանսֆորմացիան (SAAT) նախընտրելի մեթոդ է և ունի զգալիորեն ավելի բարձր արդյունավետություն, քան մերկ ԴՆԹ-ի և ԴՆԹ-ի վեկտորները ուղղակիորեն պրոտոպլաստ տեղափոխելու համար օգտագործվող հնչյունավորումը: Բազմաթիվ ուսումնասիրություններ ցույց են տվել, որ Agrobacterium-ի միջնորդավորված տրանսֆորմացիան (SAAT) կարող է օգտագործվել ուլտրաձայնային ալիքների միջոցով բույսերի բջիջների վրա մեխանիկական խանգարումների և վերքերի ձևավորման համար և արդյունքում առաջացած ակուստիկ կավիտացիայի միջոցով: Կարճ ուլտրաձայնային բուժումը միկրովերքեր է ստեղծում արտամղակների մակերեսին: Քանի որ վիրավոր բջիջները թույլ կտան Agrobacterium-ին ներթափանցել բույսերի հյուսվածքների խորը հատված՝ դրանով իսկ մեծացնելով բույսերի բջիջների վարակվելու հավանականությունը։ Բացի այդ, արտազատվող ֆենոլային միացությունները ուժեղացնում են փոխակերպումը: Ուլտրաձայնային եղանակով առաջացած միկրովերքերը նաև ավելի իրական են դարձնում մանրէների ներթափանցումը: SAAT-ը հաջողությամբ կիրառվել է գենետիկական փոխակերպման համար բույսերի տեսակների մեջ, որոնք, մասնավորապես, համարվում են կայուն Agrobacterium-ի նկատմամբ:
Լինելով շատ պարզ և էժան մեթոդ, ինչպես նաև Agrobacterium միջնորդավորված գեների փոխանցման զգալի բարելավումը SAAT-ի հիմնական առավելություններն են: Բացի SAAT-ի հաջող կիրառումից Chenopodium rubrum L.-ի և Beta vulgaris L.-ի փոխակերպման մեջ, այս մոտեցումը կիրառվել է նաև ռեկոմբինանտ Escherichia coli վայրի տիպի ջերմակայուն հոլոտոքսինի և Escherichia coli մուտանտ LT պատվաստանյութի ադյուվանտների արտադրության մեջ Nicotiana tabacum-ում: , որի դեպքում LT-B-ին բնորոշ ամենաբարձր IgG տիտրերը հայտնաբերվել են թռչունների մոտ:
(տես Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014):
VialTweeter- ը բազմակի նմուշառող խողովակների միաժամանակյա ձայնագրման համար, օրինակ՝ ագրոբակտերիումի միջնորդավորված փոխակերպման (SAAT) միջոցով ձայնային ախտահանման միջոցով:
Ագրոբակտերիումի միջոցով միջնորդավորված փոխակերպման (SAAT) գիտականորեն ապացուցված առավելությունները
Ագրոբակտերիումի միջնորդավորված փոխակերպումը (SAAT) կիրառվել է բազմաթիվ բույսերի տեսակների վրա: Բուսական բջիջների կուլտուրաների կարճ և համեմատաբար մեղմ ուլտրաձայնային բուժումը առաջացնում է սոնոպորացիա, որը հետագայում թույլ է տալիս խորը ներթափանցել Ագրոբակտերիումը՝ որպես գենի փոխադրող: Ստորև կարող եք կարդալ օրինակելի ուսումնասիրություններ, որոնք ցույց են տալիս SAAT-ի օգտակար ազդեցությունը:
Աշվագանդայի ուլտրաձայնային օգնությամբ փոխակերպումը
W. somnifera-ում (հայտնի է որպես ashwagandha կամ ձմեռային բալ) տրանսֆորմացիայի արդյունավետությունը բարելավելու համար Դեհդաշտին և գործընկերները (2016) ուսումնասիրել են ացետոսիրինգոնի (AS) և sonication-ի օգտագործումը:
Acetosyringone (AS) ավելացվել է երեք փուլով. Agrobacterium հեղուկ կուլտուրա, Agrobacterium ինֆեկցիա և արտամղիչների համատեղ մշակում Agrobacterium-ի հետ: Պարզվել է, որ 75 μM AS-ի ավելացումը Agrobacterium հեղուկ մշակույթին օպտիմալ է vir գեների ինդուկցիայի համար:
Sonication-ի (SAAT) լրացուցիչ կիրառումը հանգեցրեց գենի ամենաբարձր արտահայտմանը: Պարզվել է, որ մազոտ արմատներում gusA գենի արտահայտությունը լավագույնն է, երբ տերևները և բողբոջների ծայրերը համապատասխանաբար 10 և 20 վայրկյան են հնչեցրել: Բարելավված արձանագրության փոխակերպման արդյունավետությունը տերևների և ընձյուղների ծայրամասերի դեպքում գրանցվել է համապատասխանաբար 66,5 և 59,5%: Երբ համեմատվում է այլ արձանագրությունների հետ, այս բարելավված արձանագրության փոխակերպման արդյունավետությունը պարզվել է, որ 2,5 անգամ ավելի բարձր է տերևների համար և 3,7 անգամ ավելի բարձր ընձյուղների համար: Southern blot-ի անալիզները հաստատել են gusA տրանսգենի 1-2 օրինակ W1-W4 տողերում, մինչդեռ 1-4 տրանսգենային պատճեններ հայտնաբերվել են բարելավված արձանագրության միջոցով ստեղծված W5 տողում:
Ագրոբակտերիումի միջնորդավորված տրանսֆորմացիայի (SAAT) տևողության ազդեցությունը W. somnifera տերևի (ա) և ընձյուղի ծայրի (բ) արտանետումների փոխակերպման հաճախականության վրա
(ուսումնական և գրաֆիկական՝ © Dehdashti et al., 2016)
Բամբակի ուլտրաձայնային օգնությամբ փոխակերպում
Հուսեյնը և այլք: (2007 թ.) ցույց են տալիս բամբակի վերափոխման ազդեցությամբ օժտված ձայնային ազդեցությամբ: Ցածր հաճախականության ուլտրաձայնի հետևանքով առաջացած ակուստիկ կավիտացիան ստեղծում է միկրովերքեր բույսերի հյուսվածքի մակերևույթի վրա և ներքևում (սոնոպորացիա) և թույլ է տալիս Agrobacterium-ին ավելի խորը և ամբողջությամբ շրջել բույսերի հյուսվածքով: Այս վիրավորական ձևը մեծացնում է հյուսվածքների մեջ ավելի խորը ընկած բույսերի բջիջները վարակելու հավանականությունը: SAAT-ի փոխակերպման արդյունավետությունը գնահատելու համար չափվել է GUS գենի էքսպրեսիան: GUS-ի թղթակցի համակարգը ռեպորտաժային գենային համակարգ է, որը հատկապես օգտակար է բույսերի մոլեկուլային կենսաբանության և մանրէաբանության մեջ: Կարգավորելով SAAT-ի տարբեր պարամետրերը, GUS-ի անցողիկ արտահայտությունը բամբակի մեջ, օգտագործելով հասուն սաղմերը որպես արտամղիչ, զգալիորեն բարելավվեց: GUS-ն առաջին անգամ հայտնաբերվեց արտանետումների ինկուբացիայից 24 ժամ հետո, իսկ 48 ժամվա ընթացքում GUS-ի արտահայտությունը շատ ինտենսիվ էր, ինչը ծառայեց որպես բամբակի արտանետումների հաջող փոխակերպման օգտակար ցուցիչ՝ Agrobacterium-ի միջնորդավորված տրանսֆորմացիան (SAAT) հետևանքով: Տարբեր փոխակերպման տեխնիկայի (այսինքն՝ կենսաբանական, Ագրո, BAAT, SAAT) համեմատությունը, ագրոբակտերիումի միջնորդավորված տրանսֆորմացիան (SAAT) ազդեցությամբ, ցույց տվեց փոխակերպման ամենալավ արդյունքները:
Փոխակերպման ընթացակարգի ընտրություն GUS-ի անցողիկ արտահայտման հիման վրա: Sonication-ի օգնությամբ Agrobacterium-ի միջնորդավորված փոխակերպումը (SAAT) ցույց է տալիս զգալիորեն ավելի բարձր անցողիկ արտահայտություն:
(ուսումնական և գրաֆիկական. © Hussain et al., 2007)
Բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային լուծումներ Sonoporation-ի և SAAT-ի համար
Hielscher Ultrasonics-ը երկարամյա փորձ ունի լաբորատորիաների, հետազոտական օբյեկտների, ինչպես նաև շատ բարձր թողունակությամբ արդյունաբերական արտադրության բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային սարքերի մշակման և արտադրության մեջ: Մանրէաբանության և կենսաբանության համար Hielscher-ն առաջարկում է տարբեր լուծումներ՝ բավարարելու որոշակի հյուսվածքների և դրանց բուժման համար անհրաժեշտ տարբեր պահանջներ: Բազմաթիվ նմուշների միաժամանակյա ուլտրաձայնային ախտորոշման համար Hielscher-ն առաջարկում է UIP400MTP՝ բազմաբնույթ ափսեների համար, VialTweeter՝ մինչև 10 սրվակների (օրինակ՝ Էպենդորֆյան խողովակներ) կամ ուլտրաձայնային CupHorn-ի համար: Զոնդի տիպի ուլտրաձայնային սարքերը հասանելի են 50-ից մինչև 400 վտ հզորությամբ որպես լաբորատոր հոմոգենիզատորներ, մինչդեռ արդյունաբերական համակարգերը ընդգրկում են հզորության միջակայքը 500 Վտ-ից մինչև 16 կՎտ:
Խնդրում ենք կապ հաստատել մեզ հետ և տեղեկացնել մեզ ձեր դիմումի և գործընթացի պահանջների մասին: Մեր փորձառու անձնակազմը սիրով կառաջարկի ձեր կենսաբանական գործընթացի համար ամենահարմար ուլտրաձայնային սարքը:
Ստորեւ ներկայացված աղյուսակը ձեզ ցույց է տալիս մեր ultrasonicators- ի մոտավոր մշակման հզորությունը:
| խմբաքանակի Volume | Ծախսի Rate | Առաջարկվող սարքեր |
|---|---|---|
| բազմաբնակարան / միկրոտիտրային թիթեղներ | na | UIP400MTP |
| մինչև 10 սրվակ | na | VialTweeter- ը |
| մինչև 5 սրվակ/խողովակ կամ 1 ավելի մեծ անոթ | na | Cuphorn |
| 1-ից 500 մլ | 10-ից մինչեւ 200 մլ / վրկ | UP100H |
| 10-ից մինչեւ 2000 մլ | 20-ից 400 մլ / վրկ | Uf200 ः տ,, UP400St |
| 01-ից մինչեւ 20 լ | 02-ից 4 լ / րոպե | UIP2000hdT |
| 10-ից 100 լ | 2-ից 10 լ / րոպե | UIP4000hdT |
| na | 10-ից 100 լ / րոպե | UIP16000 |
| na | ավելի մեծ | Կլաստերի UIP16000 |
Կապ մեզ հետ | / Հարցրեք մեզ!
Hielscher Ultrasonics- ը արտադրում է բարձրորակ ուլտրաձայնային համասեռացուցիչներ `լաբորատոր, պիլոտային և արդյունաբերական մասշտաբով ծրագրերը խառնելու, ցրելու, էմուլգացման և արդյունահանման համար:
Գրականություն / Հղումներ
- Klimek-Chodacka, Magdalena & Baranski, Rafal (2014): A protocol for sonication-assisted Agrobacterium rhizogenesmediated transformation of haploid and diploid sugar beet (Beta vulgaris L.) explants. Acta biochimica Polonica 2014. 13-17.
- Bing-fu GUO, Yong GUO, Jun WANG, Li-juan ZHANG, Long-guo JIN, Hui-long HONG, Ru-zheng CHANG, Li-juan QIU (2015): Co-treatment with surfactant and sonication significantly improves Agrobacterium-mediated resistant bud formation and transient expression efficiency in soybean. Journal of Integrative Agriculture, Volume 14, Issue 7, 2015. 1242-1250.
- Dehdashti, Sayed Mehdi; Acharjee, Sumita; Kianamiri, Shahla; Deka, Manab (2016): An efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation protocol of Withania somnifera. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 128(1), 2016. 55–65.
- Syed Sarfraz Hussain; Tayyab Husnain; S. Riazuddin (2007): Sonication Assisted Agrobacterium Mediated Transformation (Saat): An Alternative Method For Cotton Transformation. Pak. J. Bot., 39(1), 2007. 223-230.
Hielscher Ultrasonics- ը արտադրում է բարձրորակ ուլտրաձայնային հոմոգենացնողներից ` Լաբորատորիա դեպի արդյունաբերական չափը