Գենետիկական տրանսֆորմացիան բույսերի բջիջներում ուլտրաձայնի միջոցով
Սոնիկացիայով օժանդակվող՝ Agrobacterium-ի միջնորդությամբ տրանսֆորմացիան (SAAT) արդյունավետ մեթոդ է՝ օտար գեներով բույսերի բջիջները վարակելու համար, որտեղ Agrobacterium-ը հանդես է գալիս որպես փոխադրիչ։ Ուլտրաձայնային կավիտացիան առաջացնում է սոնոպորացիա, որը կարելի է նկարագրել որպես բուսական հյուսվածքի նպատակային միկրովնավորում։ Այս ուլտրաձայնով ստեղծված միկրովնաների միջոցով ԴՆԹ-ն և ԴՆԹ-վեկտորները կարող են արդյունավետորեն տեղափոխվել բջջային մատրիքս։
Սոնոպորացիա – ուլտրաձայնով ուժեղացված բջջային տրանսֆորմացիա
Մոտ 20kHz հաճախության ցածրահաճախ ուլտրաձայնը բջջային կախույթներին կիրառելիս ակուստիկ կավիտացիայի ազդեցություններն առաջացնում են մեմբրանների ժամանակավոր թափանցելիություն բջջային հյուսվածքներում։ Այս ուլտրաձայնային ազդեցությունը հայտնի է որպես սոնոպորացիա և կիրառվում է գեները բջիջների կամ հյուսվածքների մեջ փոխանցելու համար։
Ուլտրաձայնային մշակման առավելությունները բխում են դրա ոչ ջերմային մեխանիկական աշխատանքային սկզբունքից, որի շնորհիվ սոնիկացիան հաճախ ավելի բազմակողմանի է և պակաս կախված բջիջների տիպերից։ Սոնոպորացիայի բազմակողմանի կիրառումը հնարավորություն է բացում տրանսգեն բույսերի կիրառման համար, որոնք զգալի ներուժ ունեն մարդու բուժիչ սպիտակուցների բարդ բիոարտադրության մեջ։ Նման բուսական բիոռեակտորները հեշտությամբ են գենետիկորեն ձևափոխվում, կանխում են մարդկային ախտածիններով հնարավոր աղտոտումը, չեն վնասում տրանսֆորմացիան միջնորդող բակտերիաներին (օրինակ՝ Agrobacterium-ը) և էժան ու արդյունավետ կենսասինթեզի մեթոդ են։
UP200St ուլտրաձայնային սարք (200W, 26kHz) ձայնամեկուսիչ պատյանով
Ուլտրաձայնով օժանդակվող բջջային տրանսֆորմացիա
Սոնիկացիան տեխնիկա է, որը ցածրահաճախ ուլտրաձայնային ալիքներ է կիրառում՝ լուծարքի մասնիկները տատանելու և լուծույթները խառնելու համար՝ դրանով մեծացնելով նյութերի փոխադրման և լուծվելու արագությունը։ Միաժամանակ սոնիկացիան կարող է հեղուկներից հեռացնել լուծված գազերը։ Բույսերի տրանսֆորմացիայի ժամանակ սոնիկացիան միկրովնաներ է առաջացնում բուսական հյուսվածքի վրա և ուժեղացնում «մերկ» ԴՆԹ-ի ներթափանցումը բուսական պրոտոպլաստ։
Գենետիկական տրանսֆորմացիայի համար նախընտրելի մեթոդը սոնիկացիայով օժանդակվող՝ Agrobacterium-ի միջնորդությամբ տրանսֆորմացիան է (SAAT), որի արդյունավետությունը զգալիորեն բարձր է, քան «մերկ» ԴՆԹ-ն ու ԴՆԹ-վեկտորներն ուղղակիորեն պրոտոպլաստ փոխանցելու համար կիրառվող սոնիկացիայինը։ Բազմաթիվ հետազոտություններ ցույց են տվել, որ սոնիկացիայով օժանդակվող՝ Agrobacterium-ի միջնորդությամբ տրանսֆորմացիան (SAAT) կարող է կիրառվել ուլտրաձայնային ալիքների և դրանց հետևանքով առաջացող ակուստիկ կավիտացիայի միջոցով բուսական բջիջներում մեխանիկական քայքայում և վնասների ձևավորում ստանալու նպատակով։ Կարճատև ուլտրաձայնային մշակումը էքսպլանտների մակերևույթին միկրովնաներ է ստեղծում։ Վնասված բջիջները Agrobacterium-ին թույլ են տալիս ներթափանցել բուսական հյուսվածքի ավելի խոր մասերը՝ դրանով մեծացնելով բուսաբջիջների վարակվելու հավանականությունը։ Բացի այդ՝ արտազատվող ֆենոլային միացություններն ուժեղացնում են տրանսֆորմացիան։ Ուլտրաձայնով առաջացած միկրովնաները բակտերիաների՝ էքսպլանտ ներթափանցելուն նաև ավելի իրագործելի են դարձնում։ SAAT-ն հաջողությամբ է կիրառվել այն բուսատեսակների գենետիկական տրանսֆորմացիայի համար, որոնք հատկապես համարվում են դիմադող Agrobacterium-ին։
Շատ պարզ և էժան մեթոդ լինելու հետ մեկտեղ՝ Agrobacterium-ի միջնորդությամբ գեների փոխանցման զգալի ուժեղացումը SAAT-ի հիմնական առավելություններն են։ Բացի Chenopodium rubrum L.-ի և Beta vulgaris L.-ի տրանսֆորմացիայի մեջ իր հաջող կիրառությունից՝ այս մոտեցումը կիրառվել է նաև Nicotiana tabacum-ում ռեկոմբինանտ վայրի տիպի Escherichia coli ջերմալաբիլ հոլոտոքսինի և Escherichia coli մուտանտ LT պատվաստանյութի ադյուվանտների արտադրության մեջ, որտեղ թռչունների մոտ հայտնաբերվել են LT-B-սպեցիֆիկ IgG տիտրերի ամենաբարձր համակարգային արժեքները։
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka և R. Baranski, 2014)
VialTweeter մի քանի նմուշային փորձանոթների միաժամանակյա ուլտրաձայնային մշակման համար, օրինակ՝ սոնիկացիայով օժանդակվող՝ Agrobacterium-ի միջնորդությամբ տրանսֆորմացիայի (SAAT) դեպքում
Գեների փոխանցման ընդհանուր ընթացակարգը բույսերի բջիջներում՝ սոնոպորացիայի միջոցով
- Գենետիկական նյութի պատրաստում՝ Սկսեք այն գենետիկական նյութի պատրաստումից, որը ցանկանում եք ներմուծել բույսերի բջիջներ։ Դա կարող է լինել պլազմիդային ԴՆԹ, ՌՆԹ կամ այլ նուկլեինաթթուներ։
- Բուսաբջիջների մեկուսացում՝ Մեկուսացրեք այն բուսաբջիջները, որոնց վրա ցանկանում եք աշխատել։ Ձեր փորձից կախված՝ այս բջիջները կարող են մեկուսացվել բուսական հյուսվածքներից կամ կուլտուրաներից։
- Բջջային կախույթ՝ Բուսաբջիջները կախեք հարմար միջավայրում կամ բուֆերում։ Սա անհրաժեշտ է՝ ապահովելու համար, որ բջիջներն առողջ են և գենի ընդունմանը նպաստող վիճակում։
- Կարգավորեք ձեր սոնիկատորը՝ Նախապատրաստեք ձեր զոնդային տիպի սոնիկատորը՝ նախապես տալով ամպլիտուդի, ժամանակի, էներգիայի և ջերմաստիճանի արժեքները։ Ուլտրաձայնային զոնդն ընկղմեք բջջային կախույթի մեջ։
- Ուլտրաձայնային մշակում՝ Սկսեք սոնիկացիայի ընթացակարգը։ Զոնդի ծայրի արագ տատանումները հեղուկում կավիտացիոն պղպջակներ են առաջացնում։ Այդ պղպջակներն ընդարձակվում ու կործանվում են ուլտրաձայնային ալիքների ազդեցությամբ՝ ստեղծելով մեխանիկական ուժեր և միկրոհոսք կախույթում։
- Սոնոպորացիա՝ Կավիտացիայի առաջացրած մեխանիկական ուժերն ու միկրոհոսքը բույսերի բջիջների մեմբրաններում ժամանակավոր ծակոտիներ ու անցքեր են ստեղծում։ Կախույթում առկա գենետիկական նյութը այդ ծակոտիներով կարող է ներթափանցել բույսերի բջիջներ։
- Ինկուբացիա՝ Սոնոպորացիայի մշակումից հետո ինկուբացրեք բուսաբջիջները՝ դրանց վերականգնվելու և մեմբրաններն ամրապնդելու համար։ Սա վճռորոշ քայլ է բջիջների կենսունակության և գենի հաջող փոխանցման համար։
Գեների փոխանցում Agrobacterium-ի կամ լիպոսոմների միջոցով
Բուսաբջիջների տրանսֆեկցիայի երկու տարածված եղանակ կա։ Դրանք որպես գենետիկական նյութի փոխադրիչ կիրառում են Agrobacterium-ին՝ գրամ-բացասական բակտերիաների մի ցեղ, կամ լիպոսոմները։
- Agrobacterium-ի միջնորդությամբ սոնոպորացիա՝ Agrobacterium tumefaciens-ը բակտերիա է, որը լայնորեն կիրառվում է բույսերի գենետիկական ճարտարագիտության մեջ։ Այս եղանակով ցանկալի գենը կրող պլազմիդային ԴՆԹ-ն ներմուծվում է Agrobacterium-ի մեջ, որն ապա խառնվում է բույսերի բջիջներին։ Բջջային կախույթը ենթարկվում է սոնոպորացիայի՝ զոնդային տիպի սոնիկատորի միջոցով։ Ուլտրաձայնային էներգիան ուժեղացնում է գենետիկական նյութի փոխանցումը Agrobacterium-ից բույսերի բջիջներին։ Այս եղանակը լայնորեն կիրառվում է բույսերի գենետիկական ձևափոխման համար։
- Լիպոսոմներով միջնորդվող սոնոպորացիա՝ Լիպոսոմները լիպիդային բնույթի վեզիկուլներ են, որոնք կարող են կրել գենետիկական նյութ։ Այս եղանակով պլազմիդային ԴՆԹ կամ այլ նուկլեինաթթուներ կրող լիպոսոմները խառնվում են բույսերի բջիջներին։ Սոնոպորացիան՝ զոնդային տիպի սոնիկատորով, կիրառվում է՝ հեշտացնելու բուսաբջիջների կողմից լիպոսոմների ընդունումը։ Ուլտրաձայնը քայքայում է լիպոսոմների լիպիդային երկշերտը՝ գենետիկական նյութն ազատելով բույսերի բջիջների մեջ։ Այս մոտեցումը բուսաբջիջներում գեների ժամանակավոր էքսպրեսիայի հետազոտությունների համար օգտակար է։
Սոնիկացիայով օժանդակվող՝ Agrobacterium-ի միջնորդությամբ տրանսֆորմացիայի (SAAT) գիտականորեն ապացուցված առավելությունները
Սոնիկացիայով օժանդակվող՝ Agrobacterium-ի միջնորդությամբ տրանսֆորմացիան (SAAT) կիրառվել է բույսերի բազմաթիվ տեսակների վրա։ Բուսական բջջային կուլտուրաների կարճատև և համեմատաբար մեղմ ուլտրաձայնային մշակումը սոնոպորացիա է առաջացնում, ինչը գենի փոխադրիչ Agrobacterium-ին հնարավորություն է տալիս խոր ներթափանցել հյուսվածք։ Ստորև կարող եք կարդալ SAAT-ի բարենպաստ ազդեցությունները ցույց տվող օրինակային հետազոտություններ։
UP200Ht ուլտրաձայնային սարք գեների փոխանցման համար՝ սոնոպորացիայի միջոցով
Ashwagandha-ի ուլտրաձայնով օժանդակվող տրանսֆորմացիա
W. somnifera-ում (հայտնի որպես աշվագանդա կամ winter cherry) տրանսֆորմացիայի արդյունավետությունը բարելավելու համար Dehdashti-ն և գործընկերները (2016) ուսումնասիրել են ացետոսիրինգոնի (AS) և սոնիկացիայի կիրառումը։
Ացետոսիրինգոնը (AS) ավելացվել է երեք փուլում՝ Agrobacterium-ի հեղուկ կուլտուրայում, բույսերի վարակման համար Agrobacterium-ի կիրառման ժամանակ և էքսպլանտները Agrobacterium-ի հետ համատեղ կուլտիվացման ժամանակ։ Agrobacterium-ի հեղուկ կուլտուրային 75 μM AS-ի ավելացումը ճանաչվել է օպտիմալ՝ vir գեների ինդուկցիայի համար։
Սոնիկացիայի լրացուցիչ կիրառումը (SAAT) հանգեցրել է գենի էքսպրեսիայի ամենաբարձր մակարդակին։ Մազոտ արմատներում gusA գենի էքսպրեսիան լավագույնն է դրսևորվել, երբ տերևները և ընձյուղների գագաթները սոնիկացվել են միմյանցից անկախ՝ 10 և 20 վայրկյան։ Կատարելագործված արձանագրության տրանսֆորմացիայի արդյունավետությունը գրանցվել է տերևի և ընձյուղի գագաթի ընձյուղի գագաթի էքսպլանտների դեպքում՝ 66,5 և 59,5%։ Այլ արձանագրությունների համեմատության ժամանակ այս կատարելագործված արձանագրության արդյունավետությունը պարզվել է 2,5 անգամ բարձր՝ տերևների, և 3,7 անգամ բարձր՝ ընձյուղների գագաթների դեպքում։ Southern blot-ի վերլուծությունները հաստատել են gusA տրանսգենի 1–2 պատճենների առկայությունը W1-W4 գծերում, մինչդեռ 1–4 տրանսգենի պատճեններ հայտնաբերվել են կատարելագործված արձանագրությամբ ստացված W5 գծում։
Սոնիկացիայով օժանդակվող՝ Agrobacterium-ի միջնորդությամբ տրանսֆորմացիայի (SAAT) տևողության ազդեցությունը W. somnifera-ի տերևի (a) և ընձյուղի գագաթի (b) էքսպլանտների տրանսֆորմացիայի հաճախականության վրա
(հետազոտությունն ու գրաֆիկը՝ © Dehdashti et al., 2016)
Զոնդային տիպի UP200St հոմոգենիզատոր սոնոպորացիայի և գեների փոխանցման համար
Բամբակի ուլտրաձայնով օժանդակվող տրանսֆորմացիա
Hussain-ը և գործընկերները (2007) ցույց են տալիս սոնիկացիայով օժանդակվող բամբակի տրանսֆորմացիայի բարենպաստ ազդեցությունները։ Ցածրահաճախ ուլտրաձայնի առաջացրած ակուստիկ կավիտացիան միկրովնաներ է առաջացնում բուսական հյուսվածքի մակերևույթին ու դրա տակ (սոնոպորացիա), ինչը Agrobacterium-ին թույլ է տալիս ավելի խորը և ամբողջապես տարածվել բուսական հյուսվածքում։ Վնասման այս եղանակը հյուսվածքի ավելի խոր շերտերում գտնվող բուսաբջիջների վարակման հավանականությունը մեծացնում է։ SAAT-ի տրանսֆորմացիայի արդյունավետության գնահատման համար չափվել է GUS գենի էքսպրեսիան։ GUS ռեպորտեր համակարգը ռեպորտեր գենի համակարգ է, որն առանձնապես օգտակար է բույսերի մոլեկուլային կենսաբանության և միկրոբիոլոգիայի մեջ։ Մի քանի SAAT պարամետրեր կարգավորելիս, բամբակում՝ հասուն սաղմերը որպես էքսպլանտ կիրառելիս, GUS-ի ժամանակավոր էքսպրեսիան զգալիորեն ուժեղացել է։ GUS-ն առաջին անգամ հայտնաբերվել է էքսպլանտների ինկուբացիայից 24ժ հետո, իսկ 48ժ-ի դրությամբ GUS-ի էքսպրեսիան շատ ինտենսիվ էր, ինչը հանդես եկավ որպես սոնիկացիայով օժանդակվող՝ Agrobacterium-ի միջնորդությամբ տրանսֆորմացիայի (SAAT) դեպքում բամբակի էքսպլանտի հաջող տրանսֆորմացիայի օգտակար ցուցանիշ։ Տրանսֆորմացիայի տարբեր տեխնիկաների (բիոլիստիկ, Agro, BAAT, SAAT) համեմատության ժամանակ սոնիկացիայով օժանդակվող՝ Agrobacterium-ի միջնորդությամբ տրանսֆորմացիան (SAAT) ամենալավ տրանսֆորմացիայի արդյունքներն է ցույց տվել։
Տրանսֆորմացիայի ընթացակարգի ընտրությունը GUS-ի ժամանակավոր էքսպրեսիայի հիման վրա։ Սոնիկացիայով օժանդակվող՝ Agrobacterium-ի միջնորդությամբ տրանսֆորմացիան (SAAT) զգալիորեն ավելի բարձր ժամանակավոր էքսպրեսիա է ցույց տալիս։
(հետազոտությունն ու գրաֆիկը՝ © Hussain et al., 2007)
Բարձր արտադրողականության ուլտրաձայնային լուծումներ՝ սոնոպորացիայի և SAAT-ի համար
Hielscher Ultrasonics-ը բազմամյա փորձ ունի լաբորատորիաների, հետազոտական օբյեկտների, ինչպես նաև շատ բարձր թողունակությամբ արդյունաբերական արտադրության համար նախատեսված բարձր արտադրողականության ուլտրաձայնային սարքերի մշակման ու արտադրության բնագավառում։ Միկրոբիոլոգիայի և կենսագիտության համար Hielscher-ն առաջարկում է տարբեր լուծումներ՝ հատուկ հյուսվածքներին ու դրանց մշակմանը անհրաժեշտ տարբեր պահանջները հոգալու համար։ Բազմաթիվ նմուշների միաժամանակյա ուլտրաձայնային մշակման համար Hielscher-ն առաջարկում է UIP400MTP-ն՝ բազմահոր թիթեղների, VialTweeter-ը՝ մինչև 10 սրվակների (օրինակ՝ Eppendorf փորձանոթների) ուլտրաձայնային մշակման, կամ ուլտրաձայնային CupHorn-ը։ Զոնդային տիպի ուլտրաձայնային սարքերի հզորությունը տատանվում է 50-ից մինչև 400 վատտ՝ լաբորատոր հոմոգենիզատորների համար, և 500 վատտից մինչև 16 kW՝ արդյունաբերական համակարգերի համար։
Խնդրում ենք կապվել մեզ հետ և պատմել ձեր կիրառության ու գործընթացի պահանջների մասին։ Մեր փորձառու մասնագետները հաճույքով կառաջարկեն ձեր կենսաբանական գործընթացի համար առավել հարմար ուլտրաձայնային սարքը։
Ստորև ներկայացված աղյուսակը պատկերացում է տալիս մեր ուլտրաձայնային սարքերի մոտավոր մշակման հզորության մասին՝
| Խմբաքանակի ծավալը | Ծավալային հոսքի արագությունը | Առաջարկվող սարքերը |
|---|---|---|
| բազմափոսիկ / միկրոտիտրային թիթեղներ | n.a. | UIP400MTP |
| մինչև 10 սրվակ | n.a. | VialTweeter |
| մինչև 5 սրվակ/փորձանոթ կամ 1 ավելի մեծ անոթ | n.a. | CupHorn |
| 1–500mL | 10–200mL/min | UP100H |
| 10–2000mL | 20–400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1–20L | 0,2–4L/min | UIP2000hdT |
| 10–100L | 2–10L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10–100L/min | UIP16000 |
| n.a. | ավելի մեծ | սարքերի համախումբ՝ UIP16000 |
Կապվեք մեզ հետ։ / Հարցրեք մեզ։
Hielscher Ultrasonics ընկերությունն արտադրում է բարձր արտադրողականությամբ ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ՝ լաբորատոր, փորձնական և արդյունաբերական մասշտաբներով խառնման, դիսպերսման, էմուլգացման և արդյունահանման համար։
Գրականություն / Հղումներ
- Klimek-Chodacka, Magdalena & Baranski, Rafal (2014): A protocol for sonication-assisted Agrobacterium rhizogenesmediated transformation of haploid and diploid sugar beet (Beta vulgaris L.) explants. Acta biochimica Polonica 2014. 13-17.
- Bing-fu GUO, Yong GUO, Jun WANG, Li-juan ZHANG, Long-guo JIN, Hui-long HONG, Ru-zheng CHANG, Li-juan QIU (2015): Co-treatment with surfactant and sonication significantly improves Agrobacterium-mediated resistant bud formation and transient expression efficiency in soybean. Journal of Integrative Agriculture, Volume 14, Issue 7, 2015. 1242-1250.
- Dehdashti, Sayed Mehdi; Acharjee, Sumita; Kianamiri, Shahla; Deka, Manab (2016): An efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation protocol of Withania somnifera. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 128(1), 2016. 55–65.
- Syed Sarfraz Hussain; Tayyab Husnain; S. Riazuddin (2007): Sonication Assisted Agrobacterium Mediated Transformation (Saat): An Alternative Method For Cotton Transformation. Pak. J. Bot., 39(1), 2007. 223-230.
Hielscher Ultrasonics ընկերությունն արտադրում է բարձր արտադրողականության ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ՝ լաբորատոր չափերից մինչև արդյունաբերական չափերը։