Գենետիկական փոխակերպումը բույսերի բջիջներում ուլտրաձայնային օգնությամբ

Sonication-Assisted Agrobacterium Mediated Transformation (SAAT) արդյունավետ մեթոդ է բույսերի բջիջները վարակելու օտար գեներով՝ օգտագործելով Agrobacterium-ը որպես փոխադրող: Ուլտրաձայնային կավիտացիան առաջացնում է սոնոպորացիա, որը կարելի է բնութագրել որպես բույսերի հյուսվածքի նպատակային միկրո վերք: Այս ուլտրաձայնային միկրովերքերի միջոցով ԴՆԹ-ի և ԴՆԹ-ի վեկտորները կարող են արդյունավետ կերպով տեղափոխվել բջջային մատրիցա:

sonoporation – Ուլտրաձայնային ուժեղացված բջիջների փոխակերպում

Երբ ցածր հաճախականության ուլտրաձայնը (մոտ 20 կՀց) կիրառվում է բջիջների կախոցների վրա, ակուստիկ կավիտացիայի հետևանքները բջջային հյուսվածքների վրա առաջացնում են թաղանթների անցողիկ թափանցելիություն: Այս ուլտրաձայնային ազդեցությունը հայտնի է որպես սոնոպորացիա և օգտագործվում է բջիջների կամ հյուսվածքների մեջ գեների փոխանցման համար:
Ultrasonication-ի առավելությունները հիմնված են դրա ոչ ջերմային մեխանիկական աշխատանքի սկզբունքի վրա, որը ստիպում է sonication-ը հաճախ ավելի բազմակողմանի լինել և ավելի քիչ կախված լինել բջիջների տեսակներից: Սոնոպորացիայի բազմակողմանի կիրառումը հնարավորություն է բացում տրանսգենային բույսերի օգտագործման համար, որոնք զգալի ներուժ ունեն մարդկային բարդ բուժական սպիտակուցների կենսաարտադրության մեջ: Նման բույսերի վրա հիմնված կենսառեակտորները կարող են հեշտությամբ գենետիկորեն մանիպուլյացիայի ենթարկվել, կանխել պոտենցիալ աղտոտումը մարդու հարուցիչներով, չեն վնասում փոխակերպման միջնորդ բակտերիաներին (օրինակ՝ Ագրոբակտերիում) և հանդիսանում են կենսասինթեզի էժան, արդյունավետ մեթոդ:

Ուլտրաձայնային օգնությամբ բջիջների փոխակերպում

Sonication-ը տեխնիկա է, որը կիրառում է ցածր հաճախականության ուլտրաձայնային ալիքներ՝ լուծույթում մասնիկները խառնելու, լուծույթները խառնելու համար՝ դրանով իսկ մեծացնելով զանգվածի փոխանցման և տարրալուծման արագությունը: Միաժամանակ, sonication-ը կարող է հեռացնել լուծված գազերը հեղուկներից: Բույսերի փոխակերպման ժամանակ ձայնային ախտահանումը կառաջացնի միկրովերքերի ձևավորում բույսերի հյուսվածքի վրա և կուժեղացնի մերկ ԴՆԹ-ի առաքումը բույսի պրոտոպլաստ:

Գենետիկ փոխակերպման համար Sonication-Assisted Agrobacterium-ի միջնորդավորված տրանսֆորմացիան (SAAT) նախընտրելի մեթոդ է և ունի զգալիորեն ավելի բարձր արդյունավետություն, քան մերկ ԴՆԹ-ի և ԴՆԹ-ի վեկտորները ուղղակիորեն պրոտոպլաստ տեղափոխելու համար օգտագործվող ձայնային ապարատը: Բազմաթիվ ուսումնասիրություններ ցույց են տվել, որ Agrobacterium-ի միջնորդավորված տրանսֆորմացիան (SAAT) կարող է օգտագործվել ուլտրաձայնային ալիքների միջոցով բույսերի բջիջների վրա վերքերի մեխանիկական խանգարման և ձևավորման համար և արդյունքում առաջացող ակուստիկ կավիտացիան: Կարճ ուլտրաձայնային բուժումը միկրովերքեր է ստեղծում արտամղակների մակերեսին: Քանի որ վիրավոր բջիջները թույլ կտան Agrobacterium-ը ներթափանցել բույսերի հյուսվածքների խորը հատված՝ դրանով իսկ մեծացնելով բույսերի բջիջների վարակվելու հավանականությունը։ Բացի այդ, արտազատվող ֆենոլային միացությունները ուժեղացնում են փոխակերպումը: Ուլտրաձայնային եղանակով առաջացած միկրովերքերը նաև ավելի իրական են դարձնում մանրէների ներթափանցումը: SAAT-ը հաջողությամբ կիրառվել է գենետիկական փոխակերպման համար բույսերի տեսակների մեջ, որոնք, մասնավորապես, համարվում են կայուն Agrobacterium-ի նկատմամբ:
Լինելով շատ պարզ և էժան մեթոդ, ինչպես նաև Agrobacterium միջնորդավորված գեների փոխանցման զգալի բարելավումը SAAT-ի հիմնական առավելություններն են: Բացի SAAT-ի հաջող կիրառումից Chenopodium rubrum L.-ի և Beta vulgaris L.-ի փոխակերպման մեջ, այս մոտեցումը կիրառվել է նաև ռեկոմբինանտ Escherichia coli վայրի տիպի ջերմակայուն հոլոտոքսինի և Escherichia coli մուտանտ LT պատվաստանյութի ադյուվանտների արտադրության մեջ Nicotiana tabacum-ում: , որի դեպքում LT-B-ին բնորոշ ամենաբարձր IgG տիտրերը հայտնաբերվել են թռչունների մոտ:
(տես Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014):

Բույսերի բջիջներում գեների փոխանցման ընդհանուր ընթացակարգը Սոնոպորացիայի միջոցով

1. Գենետիկական նյութի պատրաստում. Սկսեք պատրաստել գենետիկական նյութը, որը ցանկանում եք ներմուծել բույսերի բջիջների մեջ: Սա կարող է լինել պլազմիդային ԴՆԹ, ՌՆԹ կամ այլ նուկլեինաթթուներ:
2. Բույսերի բջիջների մեկուսացում. Մեկուսացրեք այն բուսական բջիջները, որոնք ցանկանում եք թիրախավորել: Կախված ձեր փորձից, այս բջիջները կարող են մեկուսացված լինել բույսերի հյուսվածքներից կամ մշակույթներից:
3. Բջջային կասեցում. Կասեցնել բույսերի բջիջները հարմար միջավայրում կամ բուֆերի մեջ: Սա անհրաժեշտ է ապահովելու համար, որ բջիջները առողջ են և գեների կլանման համար նպաստավոր վիճակում:
4. Կարգավորեք ձեր Sonicator-ը. Պատրաստեք ձեր զոնդային տիպի sonicator-ը ձայնագրման միջոցով նախապես կարգավորելով պարամետրերը, ինչպիսիք են ամպլիտուդը, ժամանակը, էներգիան և ջերմաստիճանը: Ընկղմեք ուլտրաձայնային զոնդը բջջային կախոցի մեջ:
5. Sonication: Սկսեք ձայնագրման ընթացակարգը: Զոնդի ծայրի արագ տատանումը հեղուկում առաջացնում է կավիտացիոն փուչիկներ: Այս փուչիկները ընդլայնվում և փլվում են ուլտրաձայնային ալիքների պատճառով՝ ստեղծելով մեխանիկական ուժեր և միկրոհոսանք կախոցում:
6. Սոնոպորացիա: Կավիտացիայի արդյունքում առաջացած մեխանիկական ուժերը և միկրոհոսքը ժամանակավորապես ծակոտիներ և անցքեր են ստեղծում բույսերի բջիջների թաղանթներում: Կախոցում առկա գենետիկական նյութը կարող է մտնել բույսերի բջիջներ այս ծակոտիների միջով:
7. Ինկուբացիա: Սոնոպորացիայի բուժումից հետո ինկուբացրեք բույսերի բջիջները՝ թույլ տալու նրանց վերականգնել և կայունացնել իրենց թաղանթները: Սա վճռորոշ քայլ է բջիջների գոյատևման և հաջող գեների փոխանցման ապահովման համար:

Գենի փոխանցում ագրոբակտերիումի կամ լիպոսոմների միջոցով

Բուսական բջիջը փոխակերպելու երկու ընդհանուր ձև կա. Նրանք օգտագործում են կա՛մ ագրոբակտերիա՝ գրամ-բացասական բակտերիաների սեռ, կա՛մ լիպոսոմներ՝ որպես գենետիկ նյութի կրող։

• Agrobacterium միջնորդավորված Sonoporation: Agrobacterium tumefaciens-ը բակտերիա է, որը սովորաբար օգտագործվում է բույսերի գենետիկական ճարտարագիտության մեջ: Այս մեթոդով ցանկալի գենը պարունակող պլազմիդային ԴՆԹ-ն ներմուծվում է Ագրոբակտերիում, որն այնուհետև խառնվում է բույսերի բջիջների հետ։ Բջջային կասեցումը ենթարկվում է սոնոպորացիայի՝ օգտագործելով զոնդ տիպի sonicator: Ուլտրաձայնային էներգիան ուժեղացնում է գենետիկ նյութի փոխանցումը Agrobacterium-ից դեպի բույսերի բջիջներ: Այս մեթոդը լայնորեն կիրառվում է բույսերի գենետիկական ձևափոխման համար։
• Լիպոսոմային միջնորդավորված սոնոպորացիա. Լիպոսոմները լիպիդների վրա հիմնված վեզիկուլներ են, որոնք կարող են կրել գենետիկ նյութ: Այս մեթոդով պլազմիդային ԴՆԹ-ով կամ այլ նուկլեինաթթուներով բեռնված լիպոսոմները խառնվում են բուսական բջիջների հետ։ Բուսական բջիջների կողմից լիպոսոմների կլանումը հեշտացնելու համար օգտագործվում է սոնոպորացիա՝ օգտագործելով զոնդային տիպի sonicator: Ուլտրաձայնը խաթարում է լիպոսոմների լիպիդային երկշերտերը՝ գենետիկ նյութն ազատելով բույսերի բջիջների մեջ։ Այս մոտեցումը օգտակար է բույսերի բջիջներում անցողիկ գենային արտահայտման ուսումնասիրությունների համար:

Ագրոբակտերիումի միջոցով միջնորդավորված փոխակերպման (SAAT) գիտականորեն ապացուցված առավելությունները

Ագրոբակտերիումի միջնորդավորված փոխակերպումը (SAAT) կիրառվել է բազմաթիվ բույսերի տեսակների վրա: Բուսական բջիջների կուլտուրաների կարճ և համեմատաբար մեղմ ուլտրաձայնային բուժումը առաջացնում է սոնոպորացիա, որը հետագայում թույլ է տալիս խորը ներթափանցել Ագրոբակտերիումը՝ որպես գենի փոխադրող: Ստորև կարող եք կարդալ օրինակելի ուսումնասիրություններ, որոնք ցույց են տալիս SAAT-ի օգտակար ազդեցությունը:

Աշվագանդայի ուլտրաձայնային օգնությամբ փոխակերպումը

W. somnifera-ում (հայտնի է որպես ashwagandha կամ ձմեռային բալ) տրանսֆորմացիայի արդյունավետությունը բարելավելու համար Դեհդաշտին և գործընկերները (2016) ուսումնասիրել են ացետոսիրինգոնի (AS) և sonication-ի օգտագործումը:
Acetosyringone (AS) ավելացվել է երեք փուլով. Agrobacterium հեղուկ կուլտուրա, Agrobacterium ինֆեկցիա և արտամղիչների համատեղ մշակում Agrobacterium-ի հետ: Պարզվել է, որ 75 μM AS-ի ավելացումը Agrobacterium հեղուկ մշակույթին օպտիմալ է vir գեների ինդուկցիայի համար:
Sonication-ի (SAAT) լրացուցիչ կիրառումը հանգեցրեց գենի ամենաբարձր արտահայտմանը: Պարզվել է, որ մազոտ արմատներում gusA գենի արտահայտությունը լավագույնն է, երբ տերևները և բողբոջների ծայրերը համապատասխանաբար 10 և 20 վայրկյան են հնչեցրել: Բարելավված արձանագրության փոխակերպման արդյունավետությունը տերևների և ընձյուղների ծայրամասերի դեպքում գրանցվել է համապատասխանաբար 66,5 և 59,5%: Երբ համեմատվում է այլ արձանագրությունների հետ, այս բարելավված արձանագրության փոխակերպման արդյունավետությունը պարզվել է, որ 2,5 անգամ ավելի բարձր է տերևների համար և 3,7 անգամ ավելի բարձր ընձյուղների համար: Southern blot-ի անալիզները հաստատել են gusA տրանսգենի 1-2 օրինակ W1-W4 տողերում, մինչդեռ 1-4 տրանսգենային պատճեններ հայտնաբերվել են բարելավված արձանագրության միջոցով ստեղծված W5 տողում:

Ագրոբակտերիումի միջնորդավորված տրանսֆորմացիայի (SAAT) տևողության ազդեցությունը W. somnifera տերևի (ա) և ընձյուղի ծայրի (բ) արտանետումների փոխակերպման հաճախականության վրա
(ուսումնական և գրաֆիկական՝ © Dehdashti et al., 2016)

Բամբակի ուլտրաձայնային օգնությամբ փոխակերպում

Հուսեյնը և այլք. (2007 թ.) ցույց են տալիս բամբակի վերափոխման ազդեցությամբ օժտված ձայնային ազդեցությամբ: Ցածր հաճախականության ուլտրաձայնի հետևանքով առաջացած ակուստիկ կավիտացիան ստեղծում է միկրովերքեր բույսերի հյուսվածքի մակերևույթի վրա և ներքևում (սոնոպորացիա) և թույլ է տալիս Agrobacterium-ին ավելի խորը և ամբողջությամբ շրջել բույսերի հյուսվածքով: Այս վիրավորական ձևը մեծացնում է հյուսվածքների մեջ ավելի խորը ընկած բույսերի բջիջները վարակելու հավանականությունը: SAAT-ի փոխակերպման արդյունավետությունը գնահատելու համար չափվել է GUS գենի էքսպրեսիան: GUS-ի թղթակցային համակարգը ռեպորտաժային գենային համակարգ է, որը հատկապես օգտակար է բույսերի մոլեկուլային կենսաբանության և մանրէաբանության մեջ: Կարգավորելով SAAT-ի տարբեր պարամետրերը, GUS-ի անցողիկ արտահայտությունը բամբակի մեջ, օգտագործելով հասուն սաղմերը որպես արտամղիչ, զգալիորեն բարելավվեց: GUS-ն առաջին անգամ հայտնաբերվեց արտանետումների ինկուբացիայից 24 ժամ հետո, իսկ 48 ժամվա ընթացքում GUS-ի արտահայտությունը շատ ինտենսիվ էր, ինչը ծառայեց որպես բամբակի արտանետումների հաջող փոխակերպման օգտակար ցուցիչ՝ Agrobacterium-ի միջնորդավորված փոխակերպումից հետո (SAAT) ձայնագրման միջոցով: Տարբեր փոխակերպման տեխնիկայի (այսինքն՝ կենսաբանական, Ագրո, BAAT, SAAT) համեմատությունը, ագրոբակտերիումի միջնորդավորված տրանսֆորմացիան (SAAT) ցույց է տվել փոխակերպման ամենալավ արդյունքները:

Փոխակերպման ընթացակարգի ընտրություն GUS-ի անցողիկ արտահայտման հիման վրա: Sonication-ի օգնությամբ Agrobacterium-ի միջնորդավորված փոխակերպումը (SAAT) ցույց է տալիս զգալիորեն ավելի բարձր անցողիկ արտահայտություն:
(ուսումնական և գրաֆիկական. © Hussain et al., 2007)

Բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային լուծումներ Sonoporation-ի և SAAT-ի համար

Hielscher Ultrasonics-ը երկարամյա փորձ ունի լաբորատորիաների, հետազոտական օբյեկտների, ինչպես նաև արդյունաբերական արտադրության բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային սարքերի մշակման և արտադրության մեջ՝ շատ բարձր թողունակությամբ: Մանրէաբանության և կենսաբանության համար Hielscher-ն առաջարկում է տարբեր լուծումներ՝ բավարարելու որոշակի հյուսվածքների և դրանց բուժման համար անհրաժեշտ տարբեր պահանջներ: Բազմաթիվ նմուշների միաժամանակյա ուլտրաձայնային ախտորոշման համար Hielscher-ն առաջարկում է UIP400MTP՝ բազմաբնույթ ափսեների համար, VialTweeter՝ մինչև 10 սրվակների (օր.՝ Eppendorf խողովակներ) կամ ուլտրաձայնային CupHorn-ի ձայնագրման համար: Զոնդի տիպի ուլտրաձայնային սարքերը հասանելի են 50-ից մինչև 400 վտ հզորությամբ որպես լաբորատոր հոմոգենիզատորներ, մինչդեռ արդյունաբերական համակարգերը ընդգրկում են հզորության միջակայքը 500 Վտ-ից մինչև 16 կՎտ:
Խնդրում ենք կապ հաստատել մեզ հետ և տեղեկացնել մեզ ձեր դիմումի և գործընթացի պահանջների մասին: Մեր փորձառու անձնակազմը սիրով կառաջարկի ձեր կենսաբանական գործընթացի համար ամենահարմար ուլտրաձայնային սարքը:
Ստորև բերված աղյուսակը ցույց է տալիս մեր ուլտրաձայնային սարքերի մոտավոր մշակման հզորությունը.