Ultrazvučna proizvodnja visoko pročišćenih shizofilan beta-glukana

Schizophyallan je gljivični β-glukan s imunomodulatornim svojstvima. Za visoko aktivne medicinske učinke, schizophyllan mora imati nisku molekularnu težinu kako bi pokazao poboljšanu bioraspoloživost. Dokazano je da ultrazvuk smanjuje molekularnu težinu schizophyllana. Kao pouzdana i učinkovita metoda, ultrazvuk se može lako primijeniti za proizvodnju shizofilana niske molekularne težine.

Schizophyllum gljive i ultrazvučna ekstrakcija beta-glukana

Vrste gljive Schizophyllum rastu u prirodi na raspadnutim stablima nakon kišnih sezona. Plodovi se skupljaju u sljedećoj sušnoj sezoni. Schizophyllum vrste su bogate biokemijskim spojevima kao što su glukani i stoga se konzumiraju posebno u tropskim zemljama kao hrana i lijekovi. Zbog svojih imunomodulatornih, antifungalnih, antineoplastičnih i antivirusnih svojstava, Schizophyllum commune, također poznata kao gljiva Splitgill, privukla je biotehnološke i farmaceutske tvrtke.
Polisaharid schizophyllan, također poznat kao sizofiran, sonifilan ili sizofilan, glavni je β-glukan pronađen u gljivama Schizophyllum, koje nude vrlo učinkovit bioaktivni β-glukan schizophyllan.
Schizophyllum commune gljive rastu u prirodi na drveću, micelij se također može uzgajati u fermentacijskoj juhi. Za farmaceutske i kozmetičke primjene, schizophyllan niske molekularne težine je mnogo učinkovitiji od schizophyllana visoke molekularne težine. To je zbog činjenice da schizophyllan niske molekularne težine pokazuje znatno bolju bioraspoloživost i stopu apsorpcije. Osim toga, shizofilan visoke molekularne težine često je problematičan u primjenama budući da rezultira visokom viskoznošću njegovih vodenih otopina.
Ultrazvučno smanjenje veličine vrlo je učinkovita i pouzdana tehnika za smanjenje molekularne težine schizophyllana, čime se povećava kvaliteta molekule β-glukana.

Protokol za proizvodnju shizofilana niske molekularne težine

Budući da schizophyllan molekularne težine pokazuje drastično bolju bioraspoloživost i svojstva primjene, istraživački tim Smirnoua istraživao je ultrazvuk za cijepanje i smanjenje veličine molekule β-glukana schizophyllan.

Ultrazvučna obrada Schizophyllana

β-1.3(1.6)-Glucan schizophyllan (SPG) proizveden je potopljenim uzgojem gljivice S. commune u bioreaktoru koristeći saharozu kao supstrat.
Nakon završetka uzgoja, bujon kulture razrijeđen je demineraliziranom vodom do koncentracije shizofilana od 2 g/L i ultrazvučno obrađen s ultrazvučni procesor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Njemačka) u načinu rada za recikliranje pri sljedećim parametrima i uvjetima: srednji protok 50 mL/s, frekvencija 20 kHz, izlaz 2000 W, tip sonotrode BS2d22, tip pojačivača B2-1.4 i amplituda 100%. Temperatura bujona kulture na početku sonikacije bila je 25°C. Ultrazvučni bujon kulture (specifični unos energije 100 Ws/mL) je filtriran kroz Seitz HS800 dubinski filter pod pritiskom od 1,5 bara na 40°C. Ultrazvučni schizophyllan (uSPG) za kemijsku karakterizaciju istaložen je iz filtrata s trostrukom količinom izopropilnog alkohola na laboratorijskoj temperaturi i sušen na 60°C tijekom 12 sati. USPG otopine za imunološka ispitivanja pripremljene su na sljedeći način: (1) ultrazvučni filtrat bujona kulture je dijafiltriran kroz 0,1 m2 Pall Centramate T-serije PES kazete (100 kDa cut-off) na 0,8 bara i dijafiltracija je nastavljena dok vodljivost retentata nije bila 20 μS/cm; (2) otopina je koncentrirana dijafiltracijom do uSPG koncentracije od 1 g/L i sterilizirana autoklavom na 120°C/20 min. Denaturirani uSPG pripremljen je na sličan način, osim što je NaOH dodan u filtrat bujona kulture u koncentraciji od 0,2 M, a alkalizirana otopina je inkubirana 30 minuta na laboratorijskoj temperaturi prije dijafiltracije.

Analitičke metode

Prinos micelija je procijenjen gravimetrijski: bujon kulture je razrijeđen vodom 1:4, centrifugiran 10000 x g na 25°C 20 minuta, talog je ispran trostrukom količinom vode, osušen na 60°C i izvagan. Schizophyllan je istaložen iz supernatanta s trostrukom količinom izopropilnog alkohola, osušen na 60°C 24 sata i njegov prinos je određen gravimetrijski. pO2 u bujonu kulture mjeren je optičkom sondom Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Švicarska).
Dinamička viskoznost bujona kulture mjerena je na HAAKE Visco Testeru 6L s osovinama od 1L i 2L pri 4°C i brzini rotacije od 30 okretaja u minuti. Brzina filtracije izračunata je iz vremena filtracije 500 mL bujona kulture kroz 200 × 200 mm dubinski filtar Seitz HS800 (Pall, SAD) pri tlaku od 1,5 bara i 40°C.
Molekularna težina uSPG izmjerena je pomoću SEC-MALLS na HPLC sustavu Alliance (Waters) sa serijski spojenim kolonama PL aquagel OH60 i PL aquagel OH40, a detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) je koncentriran dijafiltracijom do koncentracije uSPG 1 g/L i steriliziran pomoću autoklaviranje na 120°C/20 min. Denaturirani uSPG pripremljen je na sličan način, osim što je NaOH dodan u filtrat bujona kulture u koncentraciji od 0,2 M, a alkalizirana otopina je inkubirana 30 minuta na laboratorijskoj temperaturi prije dijafiltracije.

Rezultati:
Tretman ultrazvukom primijenjen je izravno na 144-satni bujon kulture S. commune s micelijem kako bi se olakšala obrada SPG-a nizvodno.
 
Karakteristike sonificiranog Schizophyllana: Ultrazvučni schizophyllan (uSPG) je istaložen iz filtrata bujona kulture alkoholom i karakteriziran. SEC-MALLS procjenjuje da je Mw uSPG oko 1 MDa. Prosječna molekularna težina shizofilana iz tekuće fermentacije je približno 5 MDa, dok u uzgoju u čvrstom stanju može doseći i do 10 MDa. Uspoređujući molekularnu težinu ultrazvučno obrađenog schizophyllana s molekularnim težinama prirodnog netretiranog schizophyllana, može se primijetiti 5 do 10 puta smanjena molekularna težina zbog ultrazvučne obrade.
Ultrazvukom obrađeni polisaharid uSPG sadržavao je 0,7% w/w proteina i 1,0% w/w ostatka nakon paljenja. uSPG hidrolizat sastojao se od glukoze s više od 99%. Analitički rezultati pokazuju da sonikacija nasumično cijepa okosnicu β-glukana, a bočne grane ostaju netaknute čime se smanjuje veličina i molekularna težina shizofilana. Imunološke studije o uSPG-u bez proteina i endotoksina pokazale su da ultrazvučni shizofilan s niskim Mw ima izraženo imunomodulatorno djelovanje.

 
Smanjena viskoznost: Ultrazvučna obrada rezultirala je značajnim smanjenjem viskoznosti bujona kulture. Tijekom ultrazvučne obrade, viskoznost bujona kulture mijenjala se nelinearno: smanjenje viskoznosti bilo je brzo na početku ultrazvučne obrade, ali kasnije je usporilo. Specifični unos energije od 100 Ws/mL bio je dovoljan za smanjenje viskoznosti bujona kulture gotovo 7 puta.

Poboljšana filtracija: Ultrazvukom tretirana juha kulture protjecala je kroz filtar brže od neobrađene juhe kulture (specifični unos energije 0 Ws/mL) s visokomolekularnim SPG-om. Osim toga, ultrazvuk je značajno smanjio gubitak proizvoda tijekom filtracije. Filtrat netretirane juhe kulture s visokomolekularnim SPG-om (specifični unos energije 0 Ws/mL) sadržavao je 0,3 ± 0,07 g/L SPG-a, dok je koncentracija SPG-a prije dubinske filtracije bila 2 g/L. Nasuprot tome, filtrat kulture obrađene ultrazvukom od 100 Ws/mL sadržavao je SPG u koncentraciji od 2,2 ± 0,2 g/L, što odgovara gotovo nultom gubitku proizvoda.

Zaključak: U svom zaključku istraživački tim rezimira da je ultrazvučna obrada učinkovita tehnologija za proizvodnju shizofilana niske molekularne težine, koji se potom može koristiti u kozmetici i medicini. Ultrazvučna obrada, kada se primjenjuje na potpunu juhu kulture s micelijem, donosi određene prednosti proizvodnji shizofilana. Smanjuje gubitke proizvoda tijekom daljnje obrade i omogućuje proizvodnju visoko pročišćenog polisaharida zahvaljujući učinkovitoj upotrebi ultrafiltracije.
Osim toga, istraživači su otkrili da je ultrazvučna obrada schizophyllana lako skalabilna. Jedna jedinica ultrazvučnog dezintegratora pilot postrojenja UIP2000hdT obradila je 1 litru bujona kulture u 110 s u načinu protoka. Produktivnost sustava može se lako povećati sekvencijalnim spajanjem dodatnih ultrazvučnih jedinica.

 
Pročitajte više o jednostavnom povećanju ekstrakcije gljiva!
 

Visokoučinkovita ultrazvučna oprema za preradu gljivičnog glukana

Fragmentacija polisaharida kao što su glukani kao i drugi bioaktivni spojevi kao što su hitin i hitozan mogu se pouzdano procesirati s Hielscher ultrazvučnom opremom visokih performansi. Naši ultrazvučni uređaji mogu isporučiti visoke amplitude, nude preciznu kontrolu nad procesnim parametrima i mogu raditi 24/7 pod velikim opterećenjem iu zahtjevnim okruženjima. Asortiman opreme Hielscher Ultrasonics pouzdano ispunjava ove zahtjeve. Osim izvanrednih ultrazvučnih performansi, Hielscher ultrasonicators ima visoku energetsku učinkovitost, što je značajna ekonomska prednost – osobito kada se zapošljava u komercijalnoj velikoj proizvodnji.
Hielscher ultrasonicators su sustavi visokih performansi koji se mogu opremiti priborom kao što su sonotrode, pojačivači, reaktori ili protočne ćelije kako bi se na optimalan način uskladili s vašim potrebama procesa. S digitalnim zaslonom u boji, opcijom unaprijed postavljenih pokreta ultrazvuka, automatskim snimanjem podataka na integriranu SD karticu, daljinskim upravljanjem preglednikom i mnogim drugim značajkama, osigurana je najviša kontrola procesa i lakoća korištenja. U kombinaciji s robusnošću i velikim kapacitetom nosivosti, Hielscher ultrazvučni sustavi vaš su pouzdan radni konj u proizvodnji. Smanjenje molekularne težine β-glukana kao što je schizophyllan zahtijeva snažan ultrazvuk kako bi se dobilo ciljano cijepanje i konačni proizvod schizophyllan visoke kvalitete, koji se može koristiti za farmaceutske primjene.
 
Pronađite više informacija o ultrazvučnoj ekstrakciji beta-glukana iz gljiva, uključujući upute korak po korak ovdje!
 
Donja tablica daje vam naznaku približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih uređaja: