Ultrazvučna proizvodnja visokopročišćenih beta-glukana shizofilana

Shizofilan je gljivični β-glukan s imunomodulacijskim svojstvima. Za vrlo snažne ljekovite učinke shizofilan mora imati nisku molekularnu masu kako bi pokazao poboljšanu bioraspoloživost. Dokazano je da ultrazvučna obrada smanjuje molekularnu masu shizofilana. Kao pouzdana i učinkovita metoda, sonikacija se može jednostavno primijeniti za proizvodnju shizofilana niske molekularne mase.

Gljive roda Schizophyllum i ultrazvučna ekstrakcija beta-glukana

Vrste gljiva roda Schizophyllum u prirodi rastu na trulim stablima nakon kišnih razdoblja. Plodišta se prikupljaju tijekom sljedećeg sušnog razdoblja. Vrste roda Schizophyllum bogate su biokemijskim spojevima poput glukana te se stoga osobito u tropskim zemljama konzumiraju kao hrana i lijek. Zbog svojih imunomodulacijskih, protugljivičnih, antineoplastičnih i antivirusnih svojstava, Schizophyllum commune, poznat i kao obična dvolisnica, privukao je pozornost biotehnoloških i farmaceutskih tvrtki.
Polisaharid shizofilan, poznat i kao sizofiran, sonifilan ili sizofilan, glavni je β-glukan prisutan u gljivama roda Schizophyllum, koje su izvor vrlo učinkovitog bioaktivnog β-glukana shizofilana.
Gljive Schizophyllum commune u prirodi rastu na stablima, a micelij se može uzgajati i u fermentacijskoj podlozi. Za farmaceutske i kozmetičke primjene shizofilan niske molekularne mase znatno je učinkovitiji od shizofilana visoke molekularne mase. Razlog je to što shizofilan niske molekularne mase pokazuje znatno bolju bioraspoloživost i brzinu apsorpcije. Osim toga, shizofilan visoke molekularne mase često je problematičan u primjeni jer uzrokuje visoku viskoznost svojih vodenih otopina.
Ultrazvučno smanjenje veličine vrlo je učinkovita i pouzdana tehnika za smanjenje molekularne mase shizofilana, čime se povećava kvaliteta molekule β-glukana.

Protokol za proizvodnju shizofilana niske molekularne mase

Budući da shizofilan molekularne mase pokazuje drastično bolju bioraspoloživost i svojstva pri primjeni, istraživački tim Smirnoua istražio je ultrazvučnu obradu za cijepanje i smanjenje veličine molekule β-glukana shizofilana.

Ultrazvučna obrada shizofilana

β-1.3(1.6)-glukan shizofilan (SPG) proizveden je submerznim uzgojem gljive S. commune u bioreaktoru uz uporabu saharoze kao supstrata.
Nakon završetka uzgoja, tekuća hranjiva podloga razrijeđena je demineraliziranom vodom do koncentracije shizofilana od 2 g/L i ultrazvučno obrađena s pomoću ultrazvučnog procesora UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Njemačka) u recirkulacijskom načinu rada pri sljedećim parametrima i uvjetima: protok medija 50 mL/s, frekvencija 20 kHz, izlazna snaga 2000 W, sonotroda tipa BS2d22, pojačivač amplitude tipa B2-1.4 i amplituda 100%. Temperatura tekuće hranjive podloge na početku sonikacije iznosila je 25°C. Ultrazvučno obrađena tekuća hranjiva podloga (specifični unos energije 100 Ws/mL) filtrirana je kroz dubinski filtar Seitz HS800 pod tlakom od 1,5 bar pri 40°C. Ultrazvučno obrađeni shizofilan (uSPG) za kemijsku karakterizaciju istaložen je iz filtrata trostrukom količinom izopropilnog alkohola pri laboratorijskoj temperaturi i sušen pri 60°C tijekom 12h. Otopine uSPG-a za imunološka ispitivanja pripremljene su na sljedeći način: (1) filtrat ultrazvučno obrađene tekuće hranjive podloge podvrgnut je dijafiltraciji kroz PES kasetu Pall Centramate T-series površine 0,1m2 (granična molekularna masa 100 kDa) pri 0,8 bar, a dijafiltracija je nastavljena dok vodljivost retentata nije iznosila 20 μS/cm; (2) otopina je koncentrirana dijafiltracijom do koncentracije uSPG-a od 1 g/L i sterilizirana autoklaviranjem pri 120°C/20 min. Denaturirani uSPG pripremljen je na sličan način, osim što je filtratu tekuće hranjive podloge dodan NaOH u koncentraciji od 0,2 M, a alkalizirana otopina inkubirana je 30 min pri laboratorijskoj temperaturi prije dijafiltracije.

Analitičke metode

Prinos micelija procijenjen je gravimetrijski: kultivacijska juha razrijeđena je vodom u omjeru 1:4, centrifugirana pri 10.000 × g na 25°C tijekom 20 min, talog je ispran trostrukom količinom vode, osušen na 60°C i izvagan. Shizofilan je istaložen iz supernatanta trostrukom količinom izopropilnog alkohola, osušen na 60°C tijekom 24h, a njegov je prinos određen gravimetrijski. pO2 u kultivacijskoj juhi mjeren je optičkom sondom Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Švicarska).
Dinamička viskoznost kultivacijske juhe mjerena je uređajem HAAKE Visco Tester 6L s vretenima 1L i 2L na 4°C i pri brzini vrtnje od 30 rpm. Brzina filtracije izračunata je iz vremena filtracije 500 mL kultivacijske juhe kroz dubinski filtar Seitz HS800 (Pall, SAD) dimenzija 200 × 200 mm pri tlaku od 1,5 bar i na 40°C.
Molekulska masa uSPG-a mjerena je metodom SEC-MALLS na sustavu HPLC Alliance (Waters) sa serijski povezanim kolonama PL aquagel OH60 i PL aquagel OH40, a detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) koncentriran je dijafiltracijom do koncentracije uSPG-a od 1 g/L i steriliziran autoklaviranjem pri 120°C/20 min. Denaturirani uSPG pripremljen je na sličan način, osim što je filtratu kultivacijske juhe dodan NaOH u koncentraciji od 0,2 M, a alkalizirana otopina inkubirana je 30 min na laboratorijskoj temperaturi prije dijafiltracije.

Rezultati:
Ultrazvučna obrada primijenjena je izravno na kultivacijsku juhu S. commune staru 144 h, koja je sadržavala micelij, kako bi se olakšala daljnja obrada SPG-a.
 
Svojstva soniciranog shizofilana: Ultrazvučno obrađeni shizofilan (uSPG) istaložen je alkoholom iz filtrata kultivacijske juhe i karakteriziran. Metodom SEC-MALLS procijenjeno je da Mw uSPG-a iznosi oko 1 MDa. Prosječna molekulska masa shizofilana dobivenog fermentacijom u tekućem mediju iznosi približno 5 MDa, dok pri uzgoju na čvrstoj podlozi može doseći i do 10 MDa. Usporedbom molekulske mase ultrazvučno obrađenog shizofilana s molekulskim masama nativnog neobrađenog shizofilana može se uočiti smanjenje molekulske mase od 5 do 10 puta uslijed ultrazvučne obrade.
Sonicirani polisaharid uSPG sadržavao je 0,7%w/w proteina i 1,0%w/w ostatka nakon žarenja. Hidrolizat uSPG-a sastojao se od više od 99% glukoze. Analitički rezultati pokazuju da sonikacija nasumično cijepa glavnu okosnicu β-glukana, dok bočni ogranci ostaju netaknuti, čime se smanjuju veličina i molekulska masa shizofilana. Imunološka istraživanja uSPG-a koji je bio gotovo bez proteina i endotoksina pokazala su da ultrazvučno obrađeni shizofilan niske Mw ima izraženu imunomodulacijsku aktivnost.

 
Smanjena viskoznost: Ultrazvučna obrada dovela je do znatnog smanjenja viskoznosti kultivacijske juhe. Tijekom ultrazvučne obrade viskoznost kultivacijske juhe mijenjala se nelinearno: smanjenje viskoznosti bilo je brzo na početku ultrazvučne obrade, ali se kasnije usporilo. Specifični unos energije od 100 Ws/mL bio je dovoljan za smanjenje viskoznosti kultivacijske juhe gotovo 7 puta.

Poboljšana filtracija: Hranjiva podloga kulture obrađena ultrazvukom prolazila je kroz filtar brže od neobrađene hranjive podloge kulture (specifični unos energije 0 Ws/mL) sa SPG-om velike molekulske mase. Osim toga, ultrazvučna obrada znatno je smanjila gubitak proizvoda tijekom filtracije. Filtrat neobrađene hranjive podloge kulture sa SPG-om velike molekulske mase (specifični unos energije 0 Ws/mL) sadržavao je 0,3 ± 0,07 g/L SPG-a, dok je koncentracija SPG-a prije dubinske filtracije iznosila 2 g/L. Nasuprot tome, filtrat hranjive podloge kulture obrađene ultrazvukom uz unos energije od 100 Ws/mL sadržavao je SPG u koncentraciji od 2,2 ± 0,2 g/L, što odgovara gotovo nikakvom gubitku proizvoda.

Zaključak: U svojem zaključku istraživački tim sažima da je ultrazvučna obrada učinkovita tehnologija za proizvodnju šizofilana male molekulske mase, koji se zatim može upotrebljavati u kozmetici i medicini. Primjena ultrazvučne obrade na cjelokupnu hranjivu podlogu kulture s micelijem donosi određene prednosti u proizvodnji šizofilana. Smanjuje gubitke proizvoda tijekom daljnje obrade i omogućuje proizvodnju visoko pročišćenog polisaharida zahvaljujući učinkovitoj primjeni ultrafiltracije.
Osim toga, istraživači su utvrdili da se ultrazvučna obrada šizofilana lako može prenijeti na veće proizvodno mjerilo. Jedna jedinica ultrazvučnog dezintegratora UIP2000hdT u pilotnom postrojenju obradila je 1 litru hranjive podloge kulture za 110 s u protočnom načinu rada. Produktivnost sustava lako se može povećati serijskim povezivanjem dodatnih ultrazvučnih jedinica.

 
Pročitajte više o jednostavnom povećanju mjerila ekstrakcije gljiva!
 

Ultrazvučna oprema visokih performansi za obradu gljivičnih glukana

Fragmentacija polisaharida poput glukana, kao i drugih bioaktivnih spojeva poput hitina i hitozana, može se pouzdano provoditi ultrazvučnom opremom visokih performansi tvrtke Hielscher. Naši ultrazvučni uređaji mogu postići visoke amplitude, omogućuju preciznu kontrolu procesnih parametara i mogu raditi 24/7 pod velikim opterećenjem i u zahtjevnim okruženjima. Asortiman opreme Hielscher Ultrasonics pouzdano ispunjava te zahtjeve. Uz izvanredne ultrazvučne performanse, ultrazvučni uređaji Hielscher odlikuju se visokom energetskom učinkovitošću, što predstavlja znatnu ekonomsku prednost – osobito pri primjeni u komercijalnoj proizvodnji velikih razmjera.
Ultrazvučni uređaji Hielscher sustavi su visokih performansi koji se mogu opremiti priborom poput sonotroda, pojačivača amplitude, reaktora ili protočnih ćelija kako bi se optimalno prilagodili potrebama vašeg procesa.
Digitalni zaslon u boji, mogućnost prethodnog zadavanja ciklusa sonikacije, automatsko bilježenje podataka na ugrađenu SD karticu, daljinsko upravljanje putem preglednika i brojne druge značajke osiguravaju najvišu razinu kontrole procesa i jednostavnosti uporabe. U kombinaciji s robusnošću i sposobnošću podnošenja velikih opterećenja, ultrazvučni sustavi Hielscher vaš su pouzdan radni oslonac u proizvodnji.
Smanjenje molekulske mase β-glukana poput šizofilana zahtijeva snažan ultrazvuk kako bi se postiglo ciljano cijepanje i dobio visokokvalitetan konačni proizvod šizofilana koji se može upotrebljavati u farmaceutske svrhe.
 
Ovdje pronađite više informacija o ultrazvučnoj ekstrakciji beta-glukana iz gljiva, uključujući upute korak po korak!
 
Tablica u nastavku daje pregled približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih uređaja: