Ekstrakcija beta-glukana iz gljiva pomoću ultrazvuka
Materijali i oprema
- Gljive (npr. 100 g nasjeckanih ili narezanih gljiva)
- Hladna destilirana voda (npr. 500mL)
- Miješalica ili brusilica
- Staklene čaše ili tikvice
- Filtarski papir ili postavljanje vakuumske filtracije
- Centrifuga (neobavezno)
- Alkohol (npr. etanol) za oborine
- Hladnjak
- Pećnica za sušenje
Protokol ekstrakcije beta-glucan
- Samljeti ili zgnječiti gljive (npr. Chaga ili Lav’ Griva gljiva) u grube čestice od približno 1 do 3 milimetra. Na primjer, koristite 100 g sušenih čestica gljiva.
- Zatim dodajte čestice gljiva u staklenu čašu ili tikvicu.
- Zatim dodajte 500mL destilirane vode u čašu koja sadrži čestice gljiva koje treba izvaditi. Omjer vode i gljiva može varirati ovisno o vrsti gljiva i veličini čestica.
- Nakon što ste promiješali kašu, sonificirajte smjesu pomoću ultrazvučnog laboratorijskog homogenizatora (npr. UP400St s 22mm sonotrode na 100% amplitudi ili UP200Ht s 14mm sonotrode na 100% amplituda) i održavati temperaturu ispod 90 ° C. Niže temperature pomažu u očuvanju spojeva osjetljivih na toplinu, kao što su beta-glukani tijekom ekstrakcije. Sonificirajte otprilike 5 do 10 minuta kada koristite UP400St i 10 do minuta kada koristite UP200Ht. Imajte na umu da temperatura i vrijeme ekstrakcije mogu varirati ovisno o ultrazvučnoj snazi koja se koristi. Naravno, veće količine će zahtijevati duže vrijeme ultrazvukom.
- Filtrirajte sonificiranu smjesu kroz filtarski papir ili upotrijebite postavku vakuumske filtracije za odvajanje tekućine (koja sadrži ekstrahirane beta-glukane) od ostataka čvrste gljive.
- Zatim taložite beta-glukane iz tekućine dodavanjem alkohola (npr. Etanol). Obično možete koristiti 2-3 volumena alkohola za oborine.
- Nakon toga smjesu čuvajte u hladnjaku nekoliko sati kako bi se beta-glukani taložili.
- Nakon oborina možete pažljivo dekantirati tekućinu i sakupiti talogu beta-glukana.
- Na kraju osušite beta-glukane u pećnici na niskoj temperaturi (npr. 40-50 °C) dok se sav alkohol ne ukloni i dobijete suhi prah.
Gljive pokazuju varijacije u svojim karakteristikama. Stoga se proces ekstrakcije beta-glukana može razlikovati ovisno o čimbenicima kao što su specifične vrste gljiva, stanje gljiva (sušeno ili svježe), veličina čestica i temperatura ekstrakcije. Da biste optimizirali postupak ekstrakcije, razmislite o eksperimentiranju s različitim parametrima, uključujući promjenu omjera krutine i tekućine, podešavanje temperatura, istraživanje različitih otapala i testiranje različitih trajanja ultrazvukom i postavki amplitude.
Ultrazvučno potpomognuta enzimska ekstrakcija beta-glukana
Ultrazvučno potpomognuta enzimska ekstrakcija je metoda koja se koristi za ekstrakciju beta-glukana iz gljiva kombinacijom enzima i ultrazvučnih valova. Ovaj proces povećava učinkovitost ekstrakcije razbijanjem staničnih stijenki gljiva i olakšavanjem oslobađanja beta-glukana.
Povećanje ekstrakcije beta-glukana iz gljiva
Nakon što uspostavite protokol ekstrakcije beta-glukana koji zadovoljava vaše zahtjeve, povećanje procesa ekstrakcije može biti jednostavan pothvat.
Skaliranje skupnog izdvajanja
Ako planirate povećati metodom ekstrakcije serije, preporučujemo povećanje volumena serije, a omjer krutine i tekućine i svih ostalih parametara ostao je konstantan. Ako nastavite koristiti isti ultrazvučni homogenizator, budite sigurni da proporcionalno povećati vrijeme ultrazvukom. Za serije veće od 1 litre, možda biste trebali razmisliti o ugradnji sporog miješalice kako biste održali suspenziju čestica i poboljšali ujednačenost ekstrakcije. Slika ispod prikazuje postavku ekstrakcije serije od 8 litara pomoću ultrazvučnog homogenizatora UP400St u kombinaciji s laboratorijskom miješalicom.
Postava ekstrakcije gljiva serije 8L s UP400St Sonicatorom
Vakuumska filtracija ekstrakta beta-glukana nakon ultrazvuka
Inline ekstrakcija gljiva
Za one koji su zainteresirani za kontinuirano vađenje većih količina beta-glukana iz gljiva, Hielscher Ultrasonics nudi reaktore stanica protoka dizajnirane za ekstrakciju botaničkog materijala. Ako se to odnosi na vas, preporučujemo vam da nam se obratite izravno za više informacija. Naš tehnički tim rado će vam pomoći u određivanju najprikladnijih postavki za vaše specifične potrebe. Međutim, provođenje ranije spomenutog eksperimenta laboratorijskih razmjera s vašim specifičnim vrstama gljiva može biti neprocjenjivo u razumijevanju preciznih zahtjeva procesa. Donja slika prikazuje reaktor velikih stanica protoka s ultrazvučnim homogenizatorom UIP4000hdT za ekstrakciju beta-glukana na približno 50 do 200 litara gnojnice i otapala na sat.
UIP4000hdT ultrazvučni homogenizator za 50 do 200L kaše od gljiva i otapala na sat
Empirijska beta-glucan koncentracija vrsta gljiva
U nastavku ćete pronaći popis empirijske koncentracije beta-glukana koja je izvađena iz različitih vrsta gljiva.
| Vrste gljiva | Sadržaj beta glukana (% težine) |
|---|---|
| Termitomyces fuliginosus R. Heim | 1% |
| Vrganj kolos R. Heim | 3% |
| Russula densifolia Secr. ex Gillet | 25% |
| Russula cyanoxantha (Schaeff.) Fr. | 29% |
| Russula alboareolata Hongo | 42% |
| Russula emetica (Schaeff.) Pers. | 10% |
| Russula delica Fr. | 38% |
| Pycnoporus cinnabarinus (Jacq.) P. Krš. | 35% |
| Amanita hemibapha (Berk. & Broome) Sacc. | 5% |
| Kutak za prinčeve Amanita & Bas | 9% |
| Amanita caesarea (Scop.) Pers. | 4% |
| Heimiella retispora (Pat. & C.F. Baker) Boedijn | 19% |
| Cortinarius claricolor var. turmalis (Fr.) Quadr | 13% |
| Termitomyces tylerianus Otieno | 12% |
| Termitomyces microcarpus (Berk. & Broome) R. Heim | 8% |
| Termitomyces eurhizus (Berk.) R. Heim | 7% |
| Polyporellus varius (Pers.) P. Krš. | 2% |
| Pycnoporus coccineus (Fr.) Bondartsev & Pjevač | 45% |
| Lentinus squarrosulus Mont. | 2% |
| Daedaleopsis confragosa (Bolton) J. Schröt | 3% |
| Pycnoporus sanguineus (L.) Fr. | 35% |
| Amanita hemibapha (Berk. & Broome) Sacc. | 5% |
| Amanita virgineoides Bas | 1% |
| Agaricus silvaticus Schaeff. | 3% |
| Klorofilum molibditi (G. Mey.) Massee | 3% |
| Ganoderma lucidum (Curtis) P. Krš. | 33% |
| Amauroderma rugosum (Blume & T. Nees, Torrend | 4% |
| Suillus bovinus var. bovinus (Pers.) Kuntze | 1% |
| Clitocybe suaveolens (Schumach.) P. Kumm. S | 9% |
| Cleroderma verrucosum (Bull.) Pers. | 9% |
| Heimiella retispora (Pat. & C.F. Baker) | 19% |
| Lentinula edodes (Berk.) Pegler | 34% |
| Pycnoporus cinnabarinus (Jacq.) P. Krš. | 35% |
beta-glucan koncentracija divljih vrsta gljiva, Izvor: Boonyanuphap, Jaruntorn & Hansawasdi, Chanida. (2010). Prostorna raspodjela Beta glukana koji sadrži zajednice divljih gljiva u suptropskoj suhoj šumi, Tajland. Gljivična raznolikost. 46. 29-42. 10.1007/s13225-010-0067-8,
Kvantifikacija koncentracije ekstrakta beta-glukana gljiva
Koncentracija beta-glukana nakon ekstrakcije može se kvantificirati različitim metodama, ovisno o vrsti beta-glukana i specifičnim zahtjevima analize. Uobičajene metode za kvantificiranje koncentracije beta-glukana navedene su u nastavku. Naravno, izbor metode ovisi o čimbenicima kao što su potrebna točnost i dostupna oprema.
-
Gravimetrijska metoda
- Princip: Ova metoda se temelji na taloženju beta-glukana s etanolom, nakon čega slijedi sušenje i vaganje taloga.
- Postupak: Uzorak se otopi u vodi, tretira etanolom kako bi se taložili beta-glukani, a zatim se talog skuplja, suši i važe.
- Prednosti: Jednostavne i široko korištene.
- Ograničenja: Manje precizno u usporedbi s drugim metodama.
-
Korimetrijske metode
- Princip: Ove metode uključuju reakcije boja sa specifičnim reagensima koji proizvode promjenu boje proporcionalnu koncentraciji beta-glukana.
-
Primjeri:
- Metoda fenol-sumporne kiseline: Ova metoda uključuje tretiranje uzorka koncentriranom sumpornom kiselinom i fenolom, koji otopinu pretvara u narančastu. Intenzitet boje proporcionalan je koncentraciji beta-glukana.
- Anthrone metoda: Anthrone reagens reagira s beta-glukanom kako bi proizveo plavo-zelenu boju, a intenzitet boje se mjeri.
- Prednosti: Osjetljive i prikladne za analizu visoke propusnosti.
- Ograničenja: Smetnje drugih spojeva i potreba za specifičnim reagensima.
-
Enzimski assays
- Princip: Enzimski testovi koriste enzime kao što je β-glukanaza za razgradnju beta-glukana u jednostavnije šećere, a oslobođeni šećeri su kvantificirani.
- Prednosti: Vrlo specifične i točne.
- Ograničenja: Zahtijeva specijaliziranu opremu i reagense.
-
Tekuća kromatografija visokih performansi (HPLC)
- Princip: HPLC razdvaja i kvantificira spojeve na temelju njihovih interakcija s kromatografskim stupcem.
- Postupak: Beta-glukani se hidroliziraju u monosaharide, a dobiveni šećeri se odvajaju i kvantificiraju HPLC-om.
- Prednosti: Vrlo precizan i prikladan za složene uzorke.
- Ograničenja: Zahtijeva specijaliziranu opremu i stručnost.
-
Specifični imunosni testovi
- Princip: Imunoanalize koriste antitijela specifična za beta-glukane kako bi kvantificirala njihovu koncentraciju.
-
Primjeri:
- ELISA (Test imunosorbenta povezan s enzimima): U ovoj metodi antitijelo povezano s enzimima proizvodi promjenu boje kada se veže za beta-glukane.
- Testovi bočnog protoka: To su brzi testovi koji daju vidljiv rezultat na testnoj traci.
- Prednosti: Visoka specifičnost i osjetljivost.
- Ograničenja: Zahtijeva određena antitijela i može biti skuplja.