Ekstrakcija beta-glukana iz gljiva pomoću ultrazvučne obrade
Materijali i oprema
- Gljive (npr. 100 g usitnjenih ili narezanih gljiva)
- Hladna destilirana voda (npr. 500 ml)
- Blender ili mlinac
- Staklene čaše ili tikvice
- Filter papir ili uređaj za vakuumsku filtraciju
- Centrifuga (opcionalno)
- Alkohol (npr. etanol) za taloženje
- Hladnjak
- Peć za sušenje
Protokol ekstrakcije beta-glukana
- Sameljite ili zdrobite gljive (npr. Chaga ili Lion’ Mane gljive) u grube čestice cca. 1 do 3 milimetra. Na primjer, upotrijebite 100 g suhih čestica gljiva.
- Zatim dodajte čestice gljiva u staklenu čašu ili tikvicu.
- Zatim dodajte 500 mL destilirane vode u čašu koja sadrži čestice gljive koje želite ekstrahirati. Omjer vode i gljive može varirati ovisno o specifičnoj vrsti gljive i veličini čestica.
- Nakon što ste promiješali kašu, sonicirate smjesu pomoću ultrazvučnog laboratorijskog homogenizatora (npr. UP400St sa sonotrodom od 22 mm pri 100% amplitudi ili UP200Ht sa sonotrodom od 14 mm pri 100% amplitudi) i održavajte temperaturu ispod 90°C. Niže temperature pomažu u očuvanju spojeva osjetljivih na toplinu, poput beta-glukana tijekom ekstrakcije. Sonicirati cca. 5 do 10 minuta kada koristite UP400St odnosno 10 do minuta kada koristite UP200Ht. Imajte na umu da temperatura i vrijeme ekstrakcije mogu varirati ovisno o korištenoj ultrazvučnoj snazi. Naravno, veće količine će zahtijevati duže vrijeme sonikacije.
- Filtrirajte sonicirano obrađenu smjesu kroz filter papir ili upotrijebite vakuumsku filtraciju za odvajanje tekućine (koja sadrži ekstrahirane beta-glukane) od krutog ostatka gljive.
- Zatim istaložite beta-glukane iz tekućine dodavanjem alkohola (npr. etanola). Obično možete koristiti 2-3 volumena alkohola za taloženje.
- Nakon toga smjesu stavite u hladnjak na nekoliko sati kako bi se beta-glukani istaložili.
- Nakon taloženja, možete pažljivo dekantirati tekućinu i prikupiti talog beta-glukana.
- Na kraju, osušite beta-glukane u pećnici na niskoj temperaturi (npr. 40-50°C) dok se sav alkohol ne ukloni i ne dobijete suhi prah.
Gljive pokazuju varijacije u svojim karakteristikama. Stoga se proces ekstrakcije beta-glukana može razlikovati ovisno o čimbenicima kao što su specifične vrste gljiva, stanje gljiva (suhe ili svježe), veličina čestica i temperatura ekstrakcije. Kako biste optimizirali svoj postupak ekstrakcije, razmislite o eksperimentiranju s različitim parametrima, uključujući mijenjanje omjera krutine i tekućine, podešavanje temperatura, istraživanje različitih otapala i testiranje različitih trajanja sonikacije i postavki amplitude.
Ultrazvučno potpomognuta enzimska ekstrakcija beta-glukana
Ultrazvučno potpomognuta enzimska ekstrakcija je metoda koja se koristi za ekstrakciju beta-glukana iz gljiva pomoću kombinacije enzima i ultrazvučnih valova. Ovaj proces povećava učinkovitost ekstrakcije razbijanjem staničnih stijenki gljiva i olakšavanjem oslobađanja beta-glukana.
Povećanje ekstrakcije beta-glukana iz gljiva
Nakon što uspostavite protokol ekstrakcije beta-glukana koji ispunjava vaše zahtjeve, povećanje procesa ekstrakcije može biti jednostavan pothvat.
Povećanje povećanja skupne ekstrakcije
Ako planirate proširiti korištenje metode šaržne ekstrakcije, preporučujemo povećanje volumena šarže uz zadržavanje omjera čvrstog i tekućeg i svih ostalih parametara konstantnim. Ako nastavite koristiti isti ultrazvučni homogenizator, svakako proporcionalno povećajte vrijeme sonikacije. Za šarže veće od 1 litre, razmislite o ugradnji spore miješalice za održavanje suspenzije čestica i poboljšanje ujednačenosti ekstrakcije. Slika u nastavku prikazuje 8-litrenu postavku šaržne ekstrakcije koja koristi ultrazvučni homogenizator UP400St u kombinaciji s laboratorijskom miješalicom.
Inline ekstrakcija gljiva
Za one koji su zainteresirani za kontinuiranu ekstrakciju većih količina beta-glukana iz gljiva, Hielscher Ultrasonics nudi reaktore s protočnim ćelijama dizajnirane za ekstrakciju botaničkog materijala. Ako se ovo odnosi na vas, potičemo vas da nam se izravno obratite za više informacija. Naš tehnički tim rado će vam pomoći u određivanju najprikladnijeg postava za vaše specifične potrebe. Međutim, provođenje ranije spomenutog laboratorijskog eksperimenta s vašom specifičnom vrstom gljiva može biti neprocjenjivo u razumijevanju točnih zahtjeva procesa. Slika ispod prikazuje veliki reaktor s protočnom ćelijom s ultrazvučnim homogenizatorom UIP4000hdT za ekstrakciju beta-glukana pri približno 50 do 200 litara kaše otapala gljiva na sat.
Empirijska koncentracija beta-glukana u vrstama gljiva
U nastavku ćete pronaći popis empirijskih koncentracija beta-glukana koji je ekstrahiran iz različitih vrsta gljiva.
Vrste gljiva | Ukupno 1,3-1,6-β-D-glukan (g/100g suhe mase) |
---|---|
Boletus pinophilus | 9,8% |
Suillus granulatus | 13,3% |
Craterellus cornucopioides | 4,5% |
Suillus variegatus | 13,7% |
Hydnum repandum | 4,1% |
Gyroporus cyanescens | 14,3% |
Tricholomopsis rutilans | 10,2% |
Agaricus bisporus (portobello) | 4% |
Agaricus bisporus (cremini) | 4% |
Auricularia auricular-judae | 16,8% |
Sadržaj 1,3-1,6-β-D-glukana u analiziranim samoniklim i uzgojenim gljivama, Izvor: Mirończuk-Chodakowska et al. (2017): Kvantitativna procjena sadržaja 1,3-1,6-Β-D-glukana u samoniklim vrstama jestivih poljskih gljiva. Rocz Panstw Zakl Hig 2017;68(3):281-290.

SonoStation: Mobilni sustav "ključ u ruke" za ultrazvučnu obradu – koji se sastoji od ultrazvučnih raspršivača, pumpe, miješalice i spremnika

UIP4000hdT ultrazvučni homogenizator za preradu otprilike 50 do 200 litara kaše otapala gljiva na sat
Kvantifikacija koncentracije ekstrakta beta-glukana u gljivama
Koncentracija beta-glukana nakon ekstrakcije može se kvantificirati različitim metodama, ovisno o vrsti beta-glukana i specifičnim zahtjevima analize. Uobičajene metode za kvantificiranje koncentracije beta-glukana navedene su u nastavku. Naravno, izbor metode ovisi o čimbenicima kao što su potrebna točnost i dostupna oprema.
-
Gravimetrijska metoda
- Princip: Ova se metoda temelji na taloženju beta-glukana etanolom, nakon čega slijedi sušenje i vaganje taloga.
- Postupak: Uzorak se otopi u vodi, tretira etanolom kako bi se istaložili beta-glukani, a zatim se talog sakupi, osuši i izvaže.
- Prednosti: Jednostavan i široko korišten.
- Ograničenja: Manje precizna u usporedbi s drugim metodama.
-
Kolorimetrijske metode
- Princip: Ove metode uključuju reakcije boja sa specifičnim reagensima koji proizvode promjenu boje proporcionalnu koncentraciji beta-glukana.
-
Primjeri:
- Metoda fenol-sumporna kiselina: ova metoda uključuje tretiranje uzorka koncentriranom sumpornom kiselinom i fenolom, što otopinu oboji u narančasto. Intenzitet boje proporcionalan je koncentraciji beta-glukana.
- Anthrone metoda: Anthrone reagens reagira s beta-glukanima da proizvede plavo-zelenu boju, a intenzitet boje se mjeri.
- Prednosti: osjetljiv i pogodan za analizu velikog protoka.
- Ograničenja: smetnje drugih spojeva i potreba za određenim reagensima.
-
Enzimski testovi
- Princip: Enzimske analize koriste enzime kao što je β-glukanaza za razgradnju beta-glukana u jednostavnije šećere, a otpušteni šećeri se kvantificiraju.
- Prednosti: Vrlo specifičan i točan.
- Ograničenja: Zahtijeva specijaliziranu opremu i reagense.
-
Tekuća kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC)
- Princip: HPLC odvaja i kvantificira spojeve na temelju njihovih interakcija s kromatografskom kolonom.
- Postupak: Beta-glukani se hidroliziraju u monosaharide, a dobiveni šećeri se odvajaju i kvantificiraju HPLC-om.
- Prednosti: Vrlo precizan i pogodan za složene uzorke.
- Ograničenja: Zahtijeva specijaliziranu opremu i stručnost.
-
Specifični imunotestovi
- Princip: Imunotestovi koriste antitijela specifična za beta-glukane za kvantificiranje njihove koncentracije.
-
Primjeri:
- ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): U ovoj metodi, enzimski vezana antitijela proizvode promjenu boje kada se vežu na beta-glukane.
- Testovi bočnog protoka: Ovo su brzi testovi koji daju vidljiv rezultat na test traci.
- Prednosti: Visoka specifičnost i osjetljivost.
- Ograničenja: Zahtijeva specifična antitijela i može biti skuplje.