Ekstrakcija beta-glukana iz gljiva primjenom ultrazvuka

Ekstrakcija beta-glukana iz gljiva za laboratorijska ispitivanja ili proizvodnju uključuje kombinaciju sjeckanja, mljevenja ili usitnjavanja gljiva, ekstrakcije potpomognute ultrazvukom i taloženja beta-glukana. U nastavku je pojednostavljeni pregled postupka ekstrakcije beta-glukana s primjerima volumena i masa za pokus u laboratorijskom mjerilu. Imajte na umu da se konkretni uvjeti i mjerne vrijednosti mogu razlikovati ovisno o vrsti gljive i potrebnoj čistoći beta-glukana.

Materijali i oprema

• Gljive (npr. 100g nasjeckanih gljiva ili gljiva narezanih na ploške)
• Hladna destilirana voda (npr. 500mL)
• Blender ili mlin
• Staklene laboratorijske čaše ili tikvice
• Filtarski papir ili sustav za vakuumsku filtraciju
• Centrifuga (opcionalno)
• Alkohol (npr. etanol) za taloženje
• Hladnjak
• Sušionik

Protokol ekstrakcije beta-glukana

1. Sameljite ili usitnite gljive (npr. čagu ili lavlju grivu) u grube čestice veličine približno 1 do 3 milimetra. Primjerice, upotrijebite 100g osušenih čestica gljiva.
2. Zatim dodajte čestice gljiva u staklenu laboratorijsku čašu ili tikvicu.
3. Potom dodajte 500mL destilirane vode u čašu koja sadržava čestice gljiva namijenjene ekstrakciji. Omjer vode i gljiva može se razlikovati ovisno o konkretnoj vrsti gljive i veličini čestica.
4. Nakon što promiješate suspenziju, sonicirajte smjesu ultrazvučnim laboratorijskim homogenizatorom (npr. UP400St sa sonotrodom od 22mm pri amplitudi od 100% ili UP200Ht sa sonotrodom od 14mm pri amplitudi od 100%) i održavajte temperaturu ispod 90°C. Niže temperature pomažu očuvati spojeve osjetljive na toplinu, poput beta-glukana, tijekom ekstrakcije. Sonicirajte približno 5 do 10 minuta pri uporabi uređaja UP400St, odnosno 10 do … minuta pri uporabi uređaja UP200Ht. Imajte na umu da temperatura i vrijeme ekstrakcije mogu varirati ovisno o primijenjenoj ultrazvučnoj snazi. Naravno, veći volumeni zahtijevat će dulje vrijeme sonikacije.
5. Filtrirajte soniciranu smjesu kroz filtarski papir ili upotrijebite sustav za vakuumsku filtraciju kako biste odvojili tekućinu (koja sadržava ekstrahirane beta-glukane) od čvrstog ostatka gljiva.
6. Zatim istaložite beta-glukane iz tekućine dodavanjem alkohola (npr. etanola). Za taloženje obično možete upotrijebiti 2–3 volumena alkohola.
7. Nakon toga ostavite smjesu u hladnjaku nekoliko sati kako bi se beta-glukani istaložili.
8. Nakon taloženja možete pažljivo dekantirati tekućinu i prikupiti talog beta-glukana.
9. Na kraju sušite beta-glukane u sušioniku na niskoj temperaturi (npr. 40–50°C) dok se sav alkohol ne ukloni i ne dobijete suhi prah.

Ovaj videozapis prikazuje visokoučinkovitu ekstrakciju gljive lavlja griva ultrazvučnim homogenizatorom Hielscher UP200Ht.

Gljive se razlikuju po svojim svojstvima. Stoga se postupak ekstrakcije beta-glukana može razlikovati ovisno o čimbenicima kao što su konkretna vrsta gljive, stanje gljiva (sušene ili svježe), veličina čestica i temperatura ekstrakcije. Kako biste optimizirali postupak ekstrakcije, razmotrite ispitivanje različitih parametara, uključujući promjenu omjera čvrste i tekuće faze, prilagodbu temperatura, ispitivanje različitih otapala te različitih trajanja sonikacije i postavki amplitude.

Enzimska ekstrakcija beta-glukana potpomognuta ultrazvukom

Enzimska ekstrakcija potpomognuta ultrazvukom metoda je za ekstrakciju beta-glukana iz gljiva primjenom kombinacije enzima i ultrazvučnih valova. Ovaj postupak povećava učinkovitost ekstrakcije razgradnjom staničnih stijenki gljiva i olakšavanjem oslobađanja beta-glukana.

Povećanje mjerila ekstrakcije beta-glukana iz gljiva

Nakon što uspostavite protokol ekstrakcije beta-glukana koji zadovoljava vaše zahtjeve, povećanje mjerila postupka ekstrakcije može biti jednostavno.

Povećanje mjerila šaržne ekstrakcije

Ako planirate povećati mjerilo primjenom metode šaržne ekstrakcije, preporučujemo povećanje volumena šarže uz zadržavanje nepromijenjenih omjera čvrste i tekuće faze i svih ostalih parametara. Ako nastavite upotrebljavati isti ultrazvučni homogenizator, svakako razmjerno produljite vrijeme sonikacije. Za šarže veće od 1 litre možete razmotriti uključivanje sporohodne miješalice kako biste čestice održavali u suspenziji i poboljšali ujednačenost ekstrakcije. Slika u nastavku prikazuje sustav za šaržnu ekstrakciju volumena 8 litara s ultrazvučnim homogenizatorom UP400St u kombinaciji s laboratorijskom miješalicom.

Ekstrakcija gljiva u protočnom sustavu

Za one koji su zainteresirani za kontinuiranu ekstrakciju većih količina beta-glukana iz gljiva, Hielscher Ultrasonics nudi reaktore s protočnim ćelijama namijenjene ekstrakciji biljnog materijala. Ako ste među njima, potičemo vas da nam se izravno obratite za više informacija. Naš tehnički tim rado će vam pomoći odabrati najprikladniji sustav za vaše specifične potrebe. Međutim, provođenje prethodno opisanog pokusa u laboratorijskom mjerilu s vašom konkretnom vrstom gljive može biti neprocjenjivo za razumijevanje točnih zahtjeva postupka. Slika u nastavku prikazuje veliki reaktor s protočnom ćelijom i ultrazvučnim homogenizatorom UIP4000hdT za ekstrakciju beta-glukana pri protoku od približno 50 do 200 litara suspenzije gljiva u otapalu na sat.

Empirijski utvrđene koncentracije beta-glukana u vrstama gljiva

U nastavku se nalazi popis empirijski utvrđenih koncentracija beta-glukana ekstrahiranog iz različitih vrsta gljiva.

Mushroom Species	Total 1,3-1,6-β-D-glucan (g/100g dry mass)
Boletus pinophilus	9,8%
Suillus granulatus	13,3%
Craterellus cornucopioides	4,5%
Suillus variegatus	13,7%
Hydnum repandum	4,1%
Gyroporus cyanescens	14,3%
Tricholomopsis rutilans	10,2%
Agaricus bisporus (portobello)	4%
Agaricus bisporus (cremini)	4%
Auricularia auricular-judae	16,8%

1,3-1,6-β-D-glucan content in the analyzed wild-growing and cultivated mushrooms, Source:Mirończuk-Chodakowska et al. (2017): Quantitative Evaluation of 1,3-1,6-Β-D-Glucan Contents in Wild–Growing Species of Edible Polish Mushrooms. Rocz Panstw Zakl Hig 2017;68(3):281-290.