Ultrazvučna sinteza peptida tehnikom TAGGING

Sinteza peptida temelj je farmaceutskog istraživanja i razvoja, no konvencionalne metode – sinteza peptida na čvrstoj fazi (SPPS) i klasično sprezanje u otopini – i dalje zahtijevaju mnogo rada, rasipaju reagense i teško se prenose na veće proizvodne razmjere. Učinkovitija alternativa pojavila se kombiniranjem dviju međusobno neovisnih strategija: tehnike TAGGING (privremena sidrena skupina) za sastavljanje peptida u otopini i ultrazvučne (sonokemijske) obrade za ubrzavanje koraka sprezanja, deprotekcije i obrade reakcijske smjese. Zajedno omogućuju proizvodnju terapijskih peptida – poput lipopeptida lipobactina s antibiotskim i antitumorskim djelovanjem – od gramskih količina do masovne proizvodnje, uz visoku čistoću, smanjene zahtjeve za pročišćavanjem i drastično manje ručnih postupaka.

Koje prednosti donosi ultrazvučna sinteza peptida?

Ekonomičnost sinteze u otopini: Reakcije se odvijaju u otopini uz znatno manju potrošnju aminokiselina nego pri sintezi peptida na čvrstoj fazi
Pročišćavanje filtracijom: Peptid vezan za TAG taloži se u polarnim otapalima pa se međuprodukti izoliraju jednostavnom filtracijom – nisu potrebne kromatografija na koloni ni karakterizacija nakon svakog koraka.
Iznimne uštede rada: Izostavljanjem pročišćavanja međuprodukata i spektroskopskih provjera štedi se znatan broj radnih sati tijekom cjelokupne sinteze.
Sonokemijsko ubrzavanje: Sonikacija skraćuje svaki ključni korak – deprotekciju skupine Fmoc, sprezanje bočnih lanaca, ciklizaciju i globalnu deprotekciju – bez narušavanja selektivnosti.
Visoka iskorištenja, visoka čistoća: Svako sprezanje fragmenata i završno sastavljanje lipobactina odvijaju se uz visoko iskorištenje; globalnom deprotekcijom dobiva se ciljni spoj uz iskorištenje od ~83 %.
Spremnost za masovnu proizvodnju: Tehnika TAGGING izričito je opisana kao tehnika koja omogućuje pripravu peptida najviše čistoće u velikim količinama, što je čini praktičnim putem do gramskih i kilogramskih količina terapijski važnih lipopeptida.
Potpuna kompatibilnost metoda: Pristup je potpuno kompatibilan s konvencionalnim SPPS-om i kemijskim postupcima u otopini pa se postojeće strategije zaštitnih skupina (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) i reagensi za sprezanje (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) primjenjuju bez promjena.

Bez kolona, bez otpada: poboljšajte sintezu peptida sonikacijom i tehnikom TAGGING!
Opišite nam izazove u svojem postupku sinteze peptida. Naši stručnjaci za sonikaciju preporučuju vam idealnu konfiguraciju sonikatora za vaše ciljeve proizvodnje peptida!

Industrijski sonikator UIP2000hdT s farmaceutskim šaržnim reaktorom za sintezu peptida u kilogramskom mjerilu tehnikom TAGGING. Sonikacija se primjenjuje za sintezu različitih peptidnih fragmenata i kondenzaciju fragmenata, uklanjanje zaštitne skupine Alloc, spajanje trimera, odcjepljivanje TAG-a, ciklizaciju i uklanjanje svih zaštitnih skupina.

Industrijski sonikator UIP2000hdT sa šaržnim reaktorom za farmaceutsku primjenu za poboljšanu sintezu peptida

Što je tehnika TAGGING?

U pristupu TAG peptidni fragment kovalentno je vezan za uklonjivu sidrenu skupinu (TAG), nalik smoli, koja ostaje u otopini. Time se omogućuje rukovanje rastućim lancem kao peptidom na čvrstoj fazi, ali u tekućoj fazi:

Nakon svakog sprezanja ili deprotekcije peptid vezan za TAG izdvaja se u čvrstom obliku jednostavnom filtracijom ili taloženjem u polarnim medijima ili medijima s antiotapalom, dok se topljive nečistoće i nusprodukti uklanjaju ispiranjem.
Budući da peptid ostaje vezan za poveznicu, kromatografija na koloni i potpuna karakterizacija svakog međuprodukta uglavnom se izostavljaju, čime se znatno štede vrijeme i ljudski rad.
Reakcije se mogu provoditi u otopini uz znatno manju potrošnju aminokiselina nego pri SPPS-u, a konačni se proizvod oslobađa odcjepljivanjem skupine TAG pri kraju sinteze.

Za lipobactin su u retrosintezi upotrijebljena tri fragmenta – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH i lipidni fragment C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH – koji su spojeni strategijom kondenzacije fragmenata kako bi se dobio dugi peptid uz vrlo visoka iskorištenja. (usp. Ramya i sur., 2025)

Potpuna sinteza peptida lipobactin uz pomoć TAG-a ubrzava se sonikacijom. Sonikacija se primjenjuje za sintezu različitih peptidnih fragmenata i kondenzaciju fragmenata, uklanjanje zaštitne skupine Alloc, spajanje trimera, odcjepljivanje TAG-a, ciklizaciju i uklanjanje svih zaštitnih skupina. Ova ultrazvučna tehnika sinteze lipopeptida vrlo je ekonomična i rezultira visokom čistoćom peptida. Njome se postižu izvrsni prinosi u usporedbi s uobičajenom sintezom peptida u otopini i sintezom peptida na čvrstoj fazi.

Potpuna sinteza peptida lipobactina uz pomoć skupine TAG ubrzava se sonikacijom.
(Studija: Ramya i sur., 2025)

Kombinirajte uklonjivu organsku sidrenu skupinu (TAG) s fokusiranom ultrazvučnom energijom i dobit ćete postupak sinteze peptida koji je istodobno brži, čišći i lakše skalabilan – smanjuje količinu otpadnih otapala, uklanja potrebu za ponovljenom obradom na kromatografskim kolonama i otvara realan put prema industrijskoj proizvodnji složenih cikličkih lipopeptida kao što je lipobactin.

Kako sonikacija poboljšava sintezu peptida u otopini

Ultrazvučna obrada primjenjuje se za intenziviranje i skraćivanje ključnih koraka u otopini. U sintezi lipobactina koju su opisali Ramya i sur. (2025), sonikacija se primjenjuje za:

Aktivaciju/esterifikaciju – npr. zaštita Alloc-Thr-OH pomoću pMB-Cl (DIPEA, DCM) uz 1 h sonikacije pri 2–8°C.

Uklanjanje zaštitnih skupina s fragmenata – uklanjanje skupine Fmoc s Ala-Arg vezanog na TAG primjenom piperidina/DBU u THF-u, uz sonikaciju tijekom 30 min.

Spajanje bočnih lanaca i fragmenata – npr. spajanje Fmoc-Ile-OH s H₂N-Ser(OᵗBu)-OMe pomoću HATU/TEA, uz sonikaciju tijekom 30 min.

Odvajanje skupine TAG – uklanjanje sidrene skupine smjesom DCM:TFE:TFA pri 0 °C, nakon čega slijedi 45 min sonikacije.

Ciklizaciju – ciklizacija posredovana sustavom HATU/DIPEA u DCM-u, uz sonikaciju tijekom 1 h.

Uklanjanje svih zaštitnih skupina – uklanjanje zaštitnih skupina tBu i Pbf smjesom TFA:TIPS:H₂O (95:2,5:2,5) uz 1 h sonikacije, čime se dobiva konačni proizvod uz iskorištenje od ~83%.

Budući da kemija skupine TAG već daje međuprodukte u obliku krutina koje se mogu filtrirati, ultrazvučna obrada i tehnika TAGGING međusobno se nadopunjuju: ultrazvuk ubrzava prijenos tvari, miješanje i kinetiku reakcije, dok sidrena skupina održava peptid u obliku krutine koja se može izdvojiti, omogućujući čist radni postupak s malo kromatografskih koraka.

Reaktor s ultrazvučnim miješanjem za poboljšanu sintezu peptida.

Sonikator UP200St: Ultrazvučno miješani reaktor za ubrzanu sintezu peptida.

Jednostavno povećanje mjerila sinteze peptida visoke čistoće uz sonikaciju

Čest izazov pri prijelazu postupaka proizvodnje peptida i peptidnih lijekova iz laboratorija u proizvodnju jest očuvanje sonokemijskog učinka pri većim volumenima i kontinuiranom protoku. Hielscher to rješava cjelovitom paletom ultrazvučnih procesora od laboratorijskog do punog industrijskog mjerila, koji osiguravaju validiranu, ponovljivu snagu i dokumentiranu kontrolu procesa.

Industrijski ultrazvučni homogenizator UIP4000hdT (4000W, 20kHz) za učinkovitu obradu u protočnoj liniji, npr. sintezu peptida uz pomoć TAG-a (TAPS)

Industrijski sonikator UIP4000hdT (4000W, 20kHz) za ultrazvučno poboljšanu sintezu peptida

Sonikator UIP1000hdT, snažan ultrazvučni homogenizator snage 1000 vata, za obradu hrane

Sonikator UIP1000hdT, snažan stolni ultrazvučni homogenizator snage 1000 vata

Povezane teme

Često postavljana pitanja o sintezi peptida uz pomoć skupine TAG i sonikacije

Što je sinteza peptida u tekućoj fazi (LPPS)?

Sinteza peptida u tekućoj fazi (LPPS) metoda je postupne izgradnje peptida u otopini primjenom klasičnih postupaka organske kemije. Jedna je od četiri glavne metode za dobivanje peptida, a poznata je po isplativosti, skalabilnosti i najmanjem utjecaju na okoliš među pristupima sintezi peptida. Posebno je prikladna za kraće peptide, iako se kod duljih sekvenci mogu pojaviti poteškoće zbog izazova u održavanju ujednačenog odvijanja reakcija i topljivosti te uklanjanju neželjenih nusproizvoda.

Kako ultrazvuk poboljšava sintezu peptida u tekućoj fazi?

Ultrazvuk (sonikacija) poboljšava LPPS ubrzavanjem koraka spajanja i uklanjanja zaštitnih skupina. Ultrazvučni valovi poboljšavaju prijenos tvari i kinetiku reakcije, što dovodi do:

Skraćenih vremena reakcije: ciklusi spajanja i uklanjanja zaštitnih skupina mogu se znatno skratiti
Većih iskorištenja: potpunija konverzija u svakom koraku
Poboljšane čistoće sirovog proizvoda: manje nusproizvoda nepotpunog spajanja
Manje potrošnje reagensa: zbog bržih i učinkovitijih reakcija potrebno je manje ekvivalenata reagensa za spajanje i aminokiselina

Što je sinteza peptida uz pomoć skupine TAG (TAPS)?

Sinteza peptida uz pomoć skupine TAG (TAPS) poseban je oblik sinteze peptida u tekućoj fazi u kojem se peptidi postupno izgrađuju u otopini primjenom topljivih organskih sidrenih skupina umjesto čvrstog nosača. Te skupine, analogne čvrstim nosačima u SPPS-u, pojednostavljuju izolaciju nakon svakog koraka sinteze jer omogućuju odvajanje taloženjem, filtracijom ili ekstrakcijom. Skupine se moraju otapati u organskim otapalima, a pritom ostati različite od drugih materijala.

Kako ultrazvuk poboljšava postupak TAGGING?

Kada se ultrazvučna obrada kombinira sa sintezom uz pomoć TAG-a, prednosti uključuju:

Brže cikluse spajanja i uklanjanja zaštitnih skupina – ultrazvuk ubrzava reakcije u otopini, skraćujući vrijeme svakog koraka
Poboljšanu topljivost i prijenos mase – ultrazvučna kavitacija pomaže održavati homogenost peptida s vezanim TAG-om u otopini, što je ključno jer je topljivost glavna prednost TAPS-a u odnosu na SPPS
Smanjenu količinu reagensa – veća učinkovitost reakcije znači da je potrebno manje ekvivalenata aminokiselina i reagensa za spajanje
Potpunije reakcije – manje nusproizvoda nepotpunog spajanja, što dovodi do veće čistoće sirovog proizvoda i jednostavnijeg naknadnog pročišćavanja

Istaknut primjer je totalna sinteza peptida lipobactin uz pomoć TAG-a i posredovanjem ultrazvučne obrade, koja je pokazala da je tehnika TAGGING potpuno kompatibilna s metodama u otopini te da ultrazvučna obrada omogućuje visoke prinose u svakom koraku. (usp. Ramya et al., 2025)

Koje su duljine peptida dostupne TAPS-om uz pomoć ultrazvuka?

Kratki do srednje dugi peptidi (~5–20 ostataka) optimalno su područje primjene, u kojem TAPS daje visoku čistoću i pouzdane rezultate.
Dulji peptidi mogu se dobiti strategijom kondenzacije fragmenata: manji fragmenti (6–10-meri) sintetiziraju se vezani na TAG, a zatim se međusobno spajaju kako bi se dobio ciljni peptid pune duljine.
Za vrlo duge ili složene ciljne peptide može se primijeniti hibridni pristup SPPS/TAPS.
Otkrijte kako je sonikacija poboljšala sintezu peptida na čvrstoj fazi (SPPS)!

Može li se sinteza peptida u tekućoj fazi uz pomoć ultrazvuka povećati na industrijsko mjerilo?

Da, industrijski sonikatori – poput modela Hielscher UIP2000hdT ili UIP4000hdT – mogu se integrirati u šaržne reaktore i protočne ćelije, omogućujući proizvodnju peptida u velikom mjerilu. Naknadna ugradnja u postojeće reaktore omogućuje poboljšanje ustaljenih postupaka sinteze peptida.

Koje su glavne prednosti ultrazvučnog LPPS-a u odnosu na konvencionalni LPPS?

Brzina: vremena reakcije drastično se skraćuju u svakom koraku spajanja i uklanjanja zaštitnih skupina.
Učinkovitost: veći prinosi po koraku dovode do većeg ukupnog prinosa peptida s više ostataka.
Održivost: manje ekvivalenata reagensa i potencijalno manje otapala zbog bržih reakcija.
Dostupnost: potrebna je samo standardna ultrazvučna kupelj, bez specijaliziranih instrumenata.
Kompatibilnost: primjenjivo je sa standardnim reagensima za spajanje (DIC, HATU, TBTU, Oxyma itd.) i strategijama zaštitnih skupina (Boc, Fmoc).

Literatura / Reference

M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.

Ultrazvučni CupHorn za ujednačenu i intenzivnu sonikaciju do 5 zatvorenih epruveta i bočica radi ujednačene i brze sterilne sinteze peptida.

Ultrazvučni CupHorn za intenzivnu sonikaciju zatvorenih epruveta i bočica radi sterilne sonikacije peptida.

Od ispitivanja izvedivosti do optimizacije procesa i industrijske ugradnje uz najbolji sonikator – Hielscher Ultrasonics vaš je partner za uspješne ultrazvučne procese!

Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi od laboratorijskih do industrijskih dimenzija.