Genetska transformacija u biljnim stanicama pomoću ultrazvuka

Transformacija posredovana agrobakterijama (SAAT) potpomognuta ultrazvukom je učinkovita metoda za inficiranje biljnih stanica stranim genima koristeći Agrobacterium kao prijenosnik. Ultrazvučna kavitacija uzrokuje sonoporaciju, koja se može opisati kao ciljano mikroranjavanje biljnog tkiva. Putem ovih ultrazvučno stvorenih mikrorana, DNK i DNK vektori mogu se učinkovito transportirati u staničnu matricu.

sonoporacija – Ultrazvučno poboljšana transformacija stanica

Kada se ultrazvuk niske frekvencije (približno 20 kHz) primijeni na stanične suspenzije, učinci akustične kavitacije uzrokuju prolaznu membransku permeabilizaciju staničnih tkiva. Ovaj ultrazvučni učinak poznat je kao sonoporacija i koristi se za prijenos gena u stanice ili tkiva.
Prednosti ultrazvučne obrade temelje se na njegovom netermalnom mehaničkom principu rada, što ultrazvučnu obradu često čini svestranijom i manje ovisnom o vrstama stanica. Svestrana primjena sonoporacije otvara mogućnost iskorištavanja transgenih biljaka koje imaju značajan potencijal u bioproizvodnji složenih ljudskih terapeutskih proteina. Takvim biljnim bioreaktorima može se lako genetski manipulirati, sprječava se potencijalna kontaminacija ljudskim patogenima, ne oštećuju bakterije koje posreduju transformaciju (npr. Agrobacterium) i predstavljaju jeftinu, učinkovitu metodu biosinteze.

Transformacija stanica potpomognuta ultrazvukom

Ultrazvuk je tehnika koja primjenjuje ultrazvučne valove niske frekvencije za protresanje čestica u otopini, za miješanje otopina, čime se povećava brzina prijenosa mase i otapanja. Istovremeno, sonikacija može ukloniti otopljene plinove iz tekućina. U transformaciji biljaka, sonikacija će uzrokovati stvaranje mikrorana na biljnom tkivu i poboljšati isporuku gole DNK u protoplast biljke.

Za genetsku transformaciju, ultrazvukom potpomognuta agrobakterijska transformacija (SAAT) je poželjna metoda i ima značajno veću učinkovitost od sonikacije koja se koristi za prijenos gole DNK i DNK vektora izravno u protoplast. Brojne su studije pokazale da se transformacija posredovana Agrobacteriumom (SAAT) potpomognuta sonikacijom može koristiti za izazivanje mehaničkog poremećaja i stvaranja rana na biljnim stanicama ultrazvučnim valovima i rezultirajućom akustičnom kavitacijom. Kratkim ultrazvučnim tretmanom stvaraju se mikro-ranice na površini eksplantata. Kako će ozlijeđene stanice omogućiti prodor Agrobacterium u dublje dijelove biljnog tkiva, čime se povećava vjerojatnost zaraze biljnih stanica. Dodatno, izlučeni fenolni spojevi pospješuju transformaciju. Ultrazvučno generirane mikro-rane također čine izvedivijim prodiranje bakterija u eksplant. SAAT je uspješno korišten za genetsku transformaciju biljnih vrsta koje se posebno smatraju otpornima na Agrobacterium.
Budući da je metoda vrlo jednostavna i jeftina, kao i značajno poboljšanje prijenosa gena posredovanog Agrobacteriumom, glavne su prednosti SAAT-a. Osim uspješne primjene SAAT u transformaciji Chenopodium rubrum L. i Beta vulgaris L., ovaj pristup je također primijenjen u proizvodnji rekombinantnog Escherichia coli divljeg tipa toplinski labilnog holotoksina i Escherichia coli mutanta LT cjepiva adjuvansa u Nicotiana tabacum , u kojem su najviši sistemski LT-B-specifični IgG titri otkriveni u ptica.
(usp. Laere i dr., 2016.; M. Klimek-Chodacka i R. Baranski, 2014.)

Opći postupak za prijenos gena putem sonoporacije u biljnim stanicama

1. Priprema genetskog materijala: Započnite s pripremom genetskog materijala koji želite uvesti u biljne stanice. To može biti plazmidna DNA, RNA ili druge nukleinske kiseline.
2. Izolacija biljnih stanica: Izolirajte biljne stanice koje želite ciljati. Ovisno o vašem eksperimentu, te stanice mogu biti izolirane iz biljnih tkiva ili kultura.
3. Suspenzija stanica: Suspendirajte biljne stanice u prikladnom mediju ili puferu. Ovo je bitno kako bi se osiguralo da su stanice zdrave iu stanju pogodnom za unos gena.
4. Postavite svoj Sonicator: Pripremite sonikator tipa sonikacije tako što ćete prethodno postaviti parametre sonikacije kao što su amplituda, vrijeme, energija i temperatura. Uronite ultrazvučnu sondu u suspenziju stanica.
5. Sonikacija: Pokrenite postupak ultrazvuka. Brzo osciliranje vrha sonde stvara kavitacijske mjehuriće u tekućini. Ti se mjehurići šire i kolabiraju zbog ultrazvučnih valova, stvarajući mehaničke sile i mikrostrujanje u suspenziji.
6. Sonoporacija: Mehaničke sile i mikrostrujanje koje stvara kavitacija privremeno stvaraju pore i rupe u membranama biljnih stanica. Genetski materijal prisutan u suspenziji može ući u biljne stanice kroz ove pore.
7. Inkubacija: Nakon tretmana sonoporacije, inkubirajte biljne stanice kako bi se oporavile i stabilizirale njihove membrane. Ovo je ključni korak za osiguranje preživljavanja stanica i uspješnog prijenosa gena.

Prijenos gena putem agrobakterija ili liposoma

Postoje dva uobičajena oblika za transfekciju biljne stanice. Oni koriste ili agrobakteriju, rod gram-negativnih bakterija, ili liposome kao nositelje genetskog materijala.

• Sonoporacija posredovana Agrobacteriumom: Agrobacterium tumefaciens je bakterija koja se često koristi u biljnom genetičkom inženjeringu. U ovoj metodi, plazmidna DNA koja sadrži željeni gen unosi se u Agrobacterium, koji se zatim miješa s biljnim stanicama. Suspenzija stanica je podvrgnuta sonoporaciji pomoću sonikatora tipa sonde. Ultrazvučna energija pospješuje prijenos genetskog materijala od Agrobacterium do biljnih stanica. Ova metoda se široko koristi za genetsku modifikaciju biljaka.
• Sonoporacija posredovana liposomima: Liposomi su vezikule na bazi lipida koje mogu nositi genetski materijal. U ovoj metodi, liposomi napunjeni plazmidnom DNA ili drugim nukleinskim kiselinama miješaju se s biljnim stanicama. Sonoporacija pomoću sonikatora tipa sonde koristi se za olakšavanje unosa liposoma u biljne stanice. Ultrazvuk remeti lipidne dvoslojeve liposoma, oslobađajući genetski materijal u biljne stanice. Ovaj pristup je koristan za studije prolazne ekspresije gena u biljnim stanicama.

Znanstveno dokazane prednosti transformacije posredovane agrobakterijama (SAAT) potpomognute sonikacijom

Transformacija posredovana agrobakterijama (SAAT) potpomognuta sonikacijom primijenjena je na brojne biljne vrste. Kratak i relativno blag tretman ultrazvukom kultura biljnih stanica uzrokuje sonoporaciju, što potom omogućuje duboki prodor Agrobacterium kao prijenosnika gena. U nastavku možete pročitati ogledne studije koje pokazuju korisne učinke SAAT-a.

Ultrazvučno potpomognuta transformacija Ashwagandhe

Kako bi se poboljšala učinkovitost transformacije kod W. somnifera (poznata kao ashwagandha ili zimska trešnja), Dehdashti i suradnici (2016.) istraživali su upotrebu acetosiringona (AS) i sonikacije.
Acetosiringon (AS) je dodan u tri faze: tekuća kultura Agrobacterium, infekcija Agrobacteriumom i kokultura eksplantata s Agrobacteriumom. Utvrđeno je da je dodatak 75 µM AS tekućoj kulturi Agrobacterium optimalan za indukciju vir gena.
Dodatna primjena sonikacije (SAAT) rezultirala je najvećom ekspresijom gena. Utvrđeno je da je ekspresija gusA gena u dlakavom korijenju najbolja kada su listovi i vrhovi izdanaka bili sonicirani 10 odnosno 20 sekundi. Učinkovitost transformacije poboljšanog protokola zabilježena je od 66,5 odnosno 59,5% u slučaju eksplantata lista i vrha izdanka. U usporedbi s drugim protokolima utvrđeno je da je učinkovitost transformacije ovog poboljšanog protokola 2,5 puta veća za listove i 3,7 puta veća za vrhove izdanaka. Southern blot analize potvrdile su 1-2 kopije transgena gusA u linijama W1-W4, dok su 1-4 kopije transgena otkrivene u liniji W5 generiranoj poboljšanim protokolom.

Učinak trajanja ultrazvukom potpomognute transformacije posredovane Agrobacterium (SAAT) na učestalost transformacije eksplantata lista (a) i vrha izdanka (b) W. somnifera
(studija i grafički prikaz: © Dehdashti et al., 2016.)

Ultrazvučno potpomognuta transformacija pamuka

Hussain i dr. (2007) pokazuju korisne učinke transformacije pamuka potpomognute sonikacijom. Akustična kavitacija uzrokovana niskofrekventnim ultrazvukom stvara mikro-rane na i ispod površine biljnog tkiva (sonoporacija) i omogućuje Agrobacteriumu da putuje dublje i potpuno po biljnom tkivu. Ovaj način ranjavanja povećava vjerojatnost zaraze biljnih stanica koje leže dublje u tkivu. Kako bi se procijenila učinkovitost transformacije SAAT-a, mjerena je ekspresija GUS gena. GUS reporterski sustav je reporterski genski sustav, posebno koristan u biljnoj molekularnoj biologiji i mikrobiologiji. Podešavanjem različitih SAAT parametara, prolazna ekspresija GUS-a u pamuku uz korištenje zrelih embrija kao eksplantata značajno je poboljšana. GUS je prvi put otkriven 24 sata nakon inkubacije eksplantata, a do 48 sati ekspresija GUS-a bila je vrlo intenzivna što je poslužilo kao koristan pokazatelj uspješne transformacije eksplantata pamuka nakon transformacije posredovane Agrobacteriumom (SAAT) potpomognute sonikacijom. Usporedba različitih tehnika transformacije (naime biolistic, Agro, BAAT, SAAT), transformacija posredovana Agrobacteriumom (SAAT) potpomognuta ultrazvukom pokazala je daleko najbolje rezultate transformacije.

Izbor postupka transformacije na temelju prolazne ekspresije GUS-a. Transformacija posredovana Agrobacterium (SAAT) potpomognuta sonikacijom pokazuje značajno veću prolaznu ekspresiju.
(studija i grafički prikaz: © Hussain et al., 2007.)

Visokoučinkovita ultrazvučna rješenja za sonoporaciju i SAAT

Hielscher Ultrasonics ima dugogodišnje iskustvo u razvoju i proizvodnji ultrazvučnih uređaja visokih performansi za laboratorije, istraživačke objekte kao i industrijsku proizvodnju s vrlo visokim učinkom. Za mikrobiologiju i znanost o životu, Hielscher nudi različita rješenja za prilagođavanje različitim zahtjevima potrebnim za određena tkiva i njihove tretmane. Za istovremenu ultrazvučnu obradu brojnih uzoraka Hielscher nudi UIP400MTP za ploče s više jažica, VialTweeter za ultrazvučnu obradu do 10 bočica (npr. Eppendorf cijevi) ili ultrazvučni CupHorn. Ultrasonicators tipa sonde dostupni su od 50 do 400 vata kao laboratorijski homogenizatori, dok industrijski sustavi pokrivaju raspon snage od 500 vata do 16 kW.
Molimo vas da nas kontaktirate i obavijestite nas o zahtjevima vaše prijave i procesa. Naše iskusno osoblje rado će vam preporučiti najprikladniji ultrazvučni uređaj za vaš biološki proces.
Donja tablica daje vam naznaku približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih uređaja: