Genetska transformacija biljnih stanica ultrazvukom

Transformacija posredovana bakterijama roda Agrobacterium uz pomoć sonikacije (SAAT) učinkovita je metoda unošenja stranih gena u biljne stanice uz korištenje bakterija roda Agrobacterium kao prijenosnika. Ultrazvučna kavitacija uzrokuje sonoporaciju, koja se može opisati kao ciljano stvaranje mikroozljeda biljnog tkiva. Kroz te mikroozljede stvorene ultrazvukom DNA i vektori DNA mogu se učinkovito prenijeti u stanični matriks.

Sonoporacija – ultrazvučno poboljšana transformacija stanica

Kada se na stanične suspenzije primijeni niskofrekventni ultrazvuk (približno 20kHz), učinci akustične kavitacije uzrokuju prolazno povećanje propusnosti membrana u staničnim tkivima. Taj ultrazvučni učinak poznat je kao sonoporacija i koristi se za prijenos gena u stanice ili tkiva.
Prednosti ultrazvučne obrade temelje se na njezinu netoplinskom mehaničkom načelu rada, zbog čega je sonikacija često svestranija i manje ovisna o vrsti stanica. Svestrana primjena sonoporacije otvara mogućnost korištenja transgenih biljaka, koje imaju znatan potencijal za bioproizvodnju složenih ljudskih terapijskih proteina. Takvi bioreaktori na biljnoj osnovi mogu se lako genetski modificirati, sprječavaju moguću kontaminaciju ljudskim patogenima, ne oštećuju bakterije koje posreduju u transformaciji (npr. Agrobacterium) te predstavljaju jeftinu i učinkovitu metodu biosinteze.

Transformacija stanica uz pomoć ultrazvuka

Sonikacija je tehnika kojom se niskofrekventni ultrazvučni valovi primjenjuju za pokretanje čestica u otopini i miješanje otopina, čime se povećava brzina prijenosa mase i otapanja. Istodobno, sonikacija može ukloniti otopljene plinove iz tekućina. Pri transformaciji biljaka sonikacija uzrokuje nastanak mikroozljeda na biljnom tkivu i poboljšava unos gole DNA u biljni protoplast.

Za genetsku transformaciju preferira se transformacija posredovana bakterijama roda Agrobacterium uz pomoć sonikacije (SAAT), koja je znatno učinkovitija od sonikacije koja se koristi za prijenos gole DNA i vektora DNA izravno u protoplast. Brojna su istraživanja pokazala da se transformacija posredovana bakterijama roda Agrobacterium uz pomoć sonikacije (SAAT) može koristiti za izazivanje mehaničkog razaranja i nastanka ozljeda na biljnim stanicama djelovanjem ultrazvučnih valova i posljedične akustične kavitacije. Kratka ultrazvučna obrada stvara mikroozljede na površini eksplantata. Ozlijeđene stanice omogućuju prodiranje bakterija roda Agrobacterium u dublje dijelove biljnih tkiva, čime se povećava vjerojatnost infekcije biljnih stanica. Osim toga, izlučeni fenolni spojevi poboljšavaju transformaciju. Mikroozljede stvorene ultrazvukom također olakšavaju prodiranje bakterija u eksplantat. SAAT je uspješno primijenjen za genetsku transformaciju biljnih vrsta koje se osobito smatraju otpornima na Agrobacterium.
Glavne prednosti SAAT-a njegova su jednostavnost i niska cijena te znatno poboljšanje prijenosa gena posredovanog bakterijama roda Agrobacterium. Osim uspješne primjene SAAT-a u transformaciji vrsta Chenopodium rubrum L. i Beta vulgaris L., ovaj je pristup primijenjen i u proizvodnji rekombinantnog termolabilnog holotoksina divljeg tipa bakterije Escherichia coli te adjuvansa za cjepiva na osnovi mutantnog LT-a bakterije Escherichia coli u biljci Nicotiana tabacum, pri čemu su u ptica utvrđeni najviši sistemski titri IgG-a specifičnog za LT-B.
(usp. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

Opći postupak prijenosa gena sonoporacijom u biljnim stanicama

1. Priprema genetskog materijala: Započnite pripremom genetskog materijala koji želite unijeti u biljne stanice. To može biti plazmidna DNA, RNA ili druge nukleinske kiseline.
2. Izolacija biljnih stanica: Izolirajte biljne stanice koje želite ciljati. Ovisno o vašem eksperimentu, te se stanice mogu izolirati iz biljnih tkiva ili kultura.
3. Stanična suspenzija: Suspendirajte biljne stanice u prikladnom mediju ili puferu. To je ključno kako bi stanice bile zdrave i u stanju pogodnom za unos gena.
4. Pripremite sonikator: Pripremite sonikator sa sondom tako da unaprijed postavite parametre sonikacije kao što su amplituda, vrijeme, energija i temperatura. Uronite ultrazvučnu sondu u staničnu suspenziju.
5. Sonikacija: Započnite postupak sonikacije. Brzo osciliranje vrha sonde stvara kavitacijske mjehuriće u tekućini. Ti se mjehurići šire i urušavaju pod djelovanjem ultrazvučnih valova, stvarajući mehaničke sile i mikrostrujanje u suspenziji.
6. Sonoporacija: Mehaničke sile i mikrostrujanje koje stvara kavitacija privremeno stvaraju pore i otvore u membranama biljnih stanica. Genetski materijal prisutan u suspenziji može kroz te pore ući u biljne stanice.
7. Inkubacija: Nakon tretmana sonoporacijom inkubirajte biljne stanice kako bi se mogle oporaviti i stabilizirati svoje membrane. To je ključan korak za osiguravanje preživljavanja stanica i uspješnog prijenosa gena.

Prijenos gena pomoću bakterija roda Agrobacterium ili liposoma

Postoje dva uobičajena načina transfekcije biljnih stanica. Kao nosači genetskog materijala upotrebljavaju se bakterije roda Agrobacterium, roda gram-negativnih bakterija, ili liposomi.

• Sonoporacija posredovana bakterijama roda Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens bakterija je koja se često upotrebljava u genetičkom inženjerstvu biljaka. U ovoj se metodi plazmidna DNA koja sadrži željeni gen unosi u Agrobacterium, koji se zatim miješa s biljnim stanicama. Stanična suspenzija podvrgava se sonoporaciji pomoću sonikatora sa sondom. Ultrazvučna energija poboljšava prijenos genetskog materijala iz bakterija roda Agrobacterium u biljne stanice. Ova se metoda široko upotrebljava za genetsku modifikaciju biljaka.
• Sonoporacija posredovana liposomima: Liposomi su vezikule na bazi lipida koje mogu prenositi genetski materijal. U ovoj se metodi liposomi napunjeni plazmidnom DNA ili drugim nukleinskim kiselinama miješaju s biljnim stanicama. Sonoporacija pomoću sonikatora sa sondom primjenjuje se kako bi se olakšao unos liposoma u biljne stanice. Ultrazvuk razara lipidne dvoslojeve liposoma, oslobađajući genetski materijal u biljne stanice. Ovaj je pristup koristan za istraživanja prolazne ekspresije gena u biljnim stanicama.

Znanstveno dokazane prednosti transformacije posredovane bakterijama roda Agrobacterium uz pomoć sonikacije (SAAT)

Transformacija posredovana bakterijama roda Agrobacterium uz pomoć sonikacije (SAAT) primijenjena je na brojne biljne vrste. Kratak i relativno blag ultrazvučni tretman kultura biljnih stanica uzrokuje sonoporaciju, koja zatim omogućuje duboko prodiranje bakterija roda Agrobacterium kao prijenosnika gena. U nastavku možete pročitati primjere istraživanja koja pokazuju korisne učinke metode SAAT.

Transformacija ašvagande uz pomoć ultrazvuka

Kako bi poboljšali učinkovitost transformacije u vrsti W. somnifera (poznatoj kao ašvaganda ili zimska trešnja), Dehdashti i suradnici (2016) istražili su primjenu acetosiringona (AS) i sonikacije.
Acetosiringon (AS) dodan je u trima fazama: u tekuću kulturu bakterija roda Agrobacterium, tijekom infekcije bakterijama roda Agrobacterium i tijekom kokultivacije eksplantata s bakterijama roda Agrobacterium. Utvrđeno je da je dodavanje 75 μM AS-a u tekuću kulturu bakterija roda Agrobacterium optimalno za indukciju gena vir.
Dodatna primjena sonikacije (SAAT) rezultirala je najvišom ekspresijom gena. Utvrđeno je da je ekspresija gena gusA u vlasastom korijenju bila najbolja kada su listovi sonificirani 10, a vrhovi izdanaka 20s. Zabilježena učinkovitost transformacije poboljšanim protokolom iznosila je 66,5 za eksplantate listova i 59,5% za eksplantate vrhova izdanaka. U usporedbi s drugim protokolima, utvrđeno je da je učinkovitost transformacije ovim poboljšanim protokolom bila 2,5 puta veća za listove i 3,7 puta veća za vrhove izdanaka. Analize Southern blot potvrdile su 1–2 kopije transgena gusA u linijama W1-W4, dok su u liniji W5 dobivenoj poboljšanim protokolom otkrivene 1–4 kopije transgena.

Utjecaj trajanja transformacije posredovane bakterijama roda Agrobacterium uz pomoć sonikacije (SAAT) na učestalost transformacije eksplantata listova (a) i vrhova izdanaka (b) vrste W. somnifera
(istraživanje i grafički prikaz: © Dehdashti i sur., 2016)

Transformacija pamuka uz pomoć ultrazvuka

Hussain i sur. (2007) pokazuju povoljne učinke transformacije pamuka uz pomoć sonikacije. Akustična kavitacija uzrokovana niskofrekventnim ultrazvukom stvara mikroozljede na površini i ispod površine biljnog tkiva (sonoporacija) te omogućuje bakterijama roda Agrobacterium da prodru dublje i kroz cijelo biljno tkivo. Takav način ozljeđivanja povećava vjerojatnost infekcije biljnih stanica smještenih dublje u tkivu. Kako bi se procijenila učinkovitost transformacije metodom SAAT, izmjerena je ekspresija gena GUS. Reporterski sustav GUS sustav je reporterskog gena, osobito koristan u molekularnoj biologiji biljaka i mikrobiologiji. Prilagodbom različitih parametara metode SAAT znatno je poboljšana prolazna ekspresija gena GUS u pamuku pri upotrebi zrelih embrija kao eksplantata. GUS je prvi put otkriven 24h nakon inkubacije eksplantata, a do 48h ekspresija gena GUS bila je vrlo intenzivna, što je poslužilo kao koristan pokazatelj uspješne transformacije eksplantata pamuka nakon transformacije posredovane bakterijama roda Agrobacterium uz pomoć sonikacije (SAAT). U usporedbi različitih tehnika transformacije (odnosno biolističke metode, Agro, BAAT i SAAT), transformacija posredovana bakterijama roda Agrobacterium uz pomoć sonikacije (SAAT) pokazala je daleko najbolje rezultate transformacije.

Odabir postupka transformacije na temelju prolazne ekspresije gena GUS. Transformacija posredovana bakterijama roda Agrobacterium uz pomoć sonikacije (SAAT) pokazuje znatno višu prolaznu ekspresiju.
(istraživanje i grafički prikaz: © Hussain i sur., 2007)

Ultrazvučna rješenja visokih performansi za sonoporaciju i SAAT

Hielscher Ultrasonics ima dugogodišnje iskustvo u razvoju i proizvodnji ultrazvučnih uređaja visokih performansi za laboratorije, istraživačke ustanove te industrijsku proizvodnju s vrlo velikim kapacitetom obrade. Za mikrobiologiju i znanosti o životu Hielscher nudi različita rješenja koja zadovoljavaju različite zahtjeve specifičnih tkiva i njihove obrade. Za istodobnu ultrazvučnu obradu brojnih uzoraka Hielscher nudi UIP400MTP za ploče s više jažica, VialTweeter za sonikaciju do 10 bočica (npr. Eppendorf epruveta) ili ultrazvučni CupHorn. Ultrazvučni uređaji sa sondom obuhvaćaju raspon snage od 50 do 400 vata za laboratorijske homogenizatore i od 500 vata do 16 kW za industrijske sustave.
Obratite nam se i upoznajte nas sa svojom primjenom i zahtjevima procesa. Naše iskusno osoblje rado će preporučiti najprikladniji ultrazvučni uređaj za vaš biološki proces.
Tablica u nastavku daje okvirni pregled kapaciteta obrade naših ultrazvučnih uređaja: