Sonication-Assisted Agrobacterium-Posredovana transformacija (SAAT) učinkovita je metoda za zarazu biljnih stanica stranim genima koji koriste Agrobacterium kao transporter. Ultrazvučna kavitacija uzrokuje sonoporaciju, koja se može opisati kao ciljano mikro-ranjavanje biljnog tkiva. Putem ovih ultrazvučno stvara mikro-rane, DNA i DNA vektori mogu se učinkovito transportirati u staničnu matricu.

sonoporacija – Ultrazvučno poboljšana transformacija stanica

Kada se ultrazvuk niske frekvencije (približno 20 kHz) primjenjuje na stanične suspenzije, učinci akustične kavitacije uzrokuju prolaznu membransku propusnost na stanična tkiva. Ovaj ultrazvučni učinak poznat je kao sonoporacija i koristi se za prijenos gena u stanice ili tkiva.
Prednosti ultrazvuka temelje se na njegovom netoplinskom mehaničkom principu rada, što ultrazvukom često čini svestranijom i manje ovisnom o vrstama stanica. Svestrana primjena sonoporacije otvara mogućnost korištenja transgenih biljaka, koje imaju značajan potencijal u bioprodukciji složenih ljudskih terapijskih proteina. Takvim bioreaktorima na biljnoj bazi može se lako genetski manipulirati, spriječiti potencijalnu kontaminaciju ljudskim patogenima, ne oštetiti bakterije koje posreduju u transformaciji (npr. Agrobakterija) i jeftina su, učinkovita metoda bio-sinteze.

Ultrazvučno potpomognuta transformacija stanica

Sonication je tehnika koja primjenjuje niskofrekventne ultrazvučne valove za miješanje čestica u otopini, za miješanje otopina, čime se povećava brzina prijenosa mase i otapanja. Istodobno, ultrazvukom se mogu ukloniti otopljeni plinovi iz tekućina. U biljnoj transformaciji ultrazvukom će se stvoriti mikrovijoti na biljnom tkivu i poboljšati isporuku gole DNK u biljni protoplast.

Za genetsku transformaciju, transformacija (SAAT) potpomognuta ultrazvukom (SaAT) je preferirana metoda i ima znatno veću učinkovitost od ultrazvukom koja se koristi za prijenos golih vektora DNA i DNA izravno u protoplast. Brojne studije pokazale su da se ultrazvukom pomogla transformaciji posredovanoj agrobakterijom (SAAT) koja se može koristiti za izazivanje mehaničkih poremećaja i stvaranja rana na biljnim stanicama ultrazvučnim valovima i rezultirajućom akustičkom kavitacijom. Kratki ultrazvučni tretman stvara mikro-rane na površini eksplanta. Kako će ranjene stanice omogućiti prodiranje Agrobakterije u dublji dio biljnih tkiva, čime će se povećati vjerojatnost zaraze biljnih stanica. Osim toga, izlučeni fenolni spojevi pojačavaju transformaciju. Ultrazvučno generirane mikro-rane čine prodiranje eksplanta bakterijama također izvedivijim. SAAT je uspješno korišten za genetsku transformaciju kod biljnih vrsta koje se posebno smatraju otpornima na Agrobakteriju.
Budući da je vrlo jednostavna i jeftina metoda, kao i značajno poboljšanje prijenosa gena posredovanih Agrobakterijom glavne su prednosti SAAT-a. Osim uspješne primjene SAAT-a u transformaciji Chenopodium rubrum L. i Beta vulgaris L., ovaj pristup primijenjen je i u proizvodnji rekombinantnih Escherichia coli divljih vrsta toplinsko-labilnog holotoksina i Escherichia coli mutant LT cjepiva adjuvants u Nicotiana tabacumu, u kojem su kod ptica otkriveni najviši sistemski IgG titre specifični za LT-B.
(usp. Laere i dr., 2016.; M. Klimek-Chodacka i R. Baranski, 2014.)

Opći postupak prijenosa gena putem sonoporacije u biljnim stanicama

1. Priprema genetskog materijala: Započnite s pripremom genetskog materijala koji želite uvesti u biljne stanice. To može biti plazmidna DNK, RNA ili druge nukleinske kiseline.
2. Izolacija biljnih stanica: Izolirajte biljne stanice koje želite ciljati. Ovisno o vašem eksperimentu, te stanice mogu biti izolirane iz biljnih tkiva ili kultura.
3. Suspenzija ćelije: Suspendirajte biljne stanice u prikladnom mediju ili puferu. To je ključno kako bi se osiguralo da su stanice zdrave i u stanju pogodnom za prihvaćanje gena.
4. Postavite svoj Sonicator: Pripremite sonda tipa ultrazvukom ultrazvukom unaprijed podešavanje parametara kao što su amplituda, vrijeme, energija, i temperatura. Uronite ultrazvučnu sondu u staničnu suspenziju.
5. sonication: Započnite postupak ultrazvukom. Brza oscilacija vrha sonde stvara kavitacijske mjehuriće u tekućini. Ti se mjehurići šire i urušavaju zbog ultrazvučnih valova, stvarajući mehaničke sile i mikrostreaming u suspenziji.
6. Sonoporacija: Mehaničke sile i mikrostreaming generirani kavitacijom stvaraju privremene pore i rupe u membranama biljnih stanica. Genetski materijal prisutan u suspenziji može ući u biljne stanice kroz te pore.
7. Inkubacija: Nakon tretmana sonoporacijom inkubirajte biljne stanice kako biste im omogućili oporavak i stabilizaciju membrana. Ovo je ključan korak kako bi se osiguralo preživljavanje stanica i uspješan prijenos gena.

Prijenos gena putem agrobacteriuma ili liposoma

Postoje dva uobičajena oblika za transfekciju biljnih stanica. Koriste ili agrobacterium, rod Gram-negativnih bakterija, ili liposome kao nositelja genetskog materijala.

• Sonoporacija posredovana agrobacteriumom: Agrobacterium tumefaciens je bakterija koja se obično koristi u biljnom genetskom inženjeringu. U ovoj metodi u Agrobacterium se unosi plazmidna DNA koja sadrži željeni gen, koji se zatim miješa s biljnim stanicama. Stanična suspenzija podvrgava se sonoporaciji pomoću sonde tipa sonicator. Ultrazvučna energija poboljšava prijenos genetskog materijala iz Agrobacteriuma u biljne stanice. Ova metoda se široko koristi za genetsku modifikaciju biljaka.
• Sonoporacija posredovana liposomomomom: Liposomi su vezikule na bazi lipida koje mogu nositi genetski materijal. U ovoj metodi, liposomi napunjeni plazmidnom DNA ili drugim nukleinskim kiselinama miješaju se s biljnim stanicama. Sonoporacija pomoću sonde tipa ultrazvukom koristi se za olakšavanje unosa liposoma biljnim stanicama. Ultrazvuk ometa lipidne dvoslojnike liposoma, oslobađajući genetski materijal u biljne stanice. Ovaj pristup je koristan za prolazne studije ekspresije gena u biljnim stanicama.

Znanstveno dokazane prednosti transformacije posredovane agrobakterijom uz pomoć ultrazvukom (SAAT)

Sonication-Assisted Agrobacterium-Posredovana transformacija (SAAT) primijenjena je na brojne biljne vrste. Kratko i relativno blago ultrazvučno liječenje kultura biljnih stanica uzrokuje sonoporaciju, što naknadno omogućuje duboku penetraciju Agrobacterium kao transportera gena. U nastavku možete pročitati uzorne studije koje pokazuju blagotvorne učinke SAAT-a.

Ultrazvučno potpomognuta transformacija Ashwagandha

Kako bi se poboljšala učinkovitost transformacije u W. somniferi (poznatoj kao ashwagandha ili zimska trešnja), Dehdashti i kolege (2016.) istraživali su uporabu acetosiringona (AS) i ultrazvukom.
Acetosiringon (AS) dodan je u tri faze: likvidna kultura Agrobacterium, infekcija Agrobacterium i kokultura objašnjenja s Agrobacterijom. Utvrđeno je da je dodavanje 75 μM AS u tekuću kulturu Agrobacterium optimalno za indukciju virskih gena.
Dodatna primjena ultrazvukom (SAAT) rezultirala je najvišom ekspresijom gena. Utvrđeno je da je ekspresija gena gusA u dlakavim korijenima najbolja kada su vrhovi lišća i pucanja ultrazvukom 10, odnosno 20s. Učinkovitost transformacije poboljšanog protokola zabilježena je 66,5 odnosno 59,5% u slučaju eksplanta vrhova lišća i pucanja. U usporedbi s drugim protokolima utvrđeno je da je učinkovitost transformacije ovog poboljšanog protokola 2,5 puta viša za lišće i 3,7 puta više za savjete za pucanje. Južne analize mrlja potvrdile su 1–2 kopije gusA transgena u linijama W1-W4, dok su 1–4 transgenske kopije otkrivene u liniji W5 generiranoj poboljšanim protokolom.

Učinak trajanja transformacije posredovane ultrazvukom Agrobakterije (SAAT) na učestalost transformacije lista W. somnifere (a) i vrha pucanja (b) objašnjenja
(studija i grafika: © Dehdashti et al., 2016)

Ultrazvučno potpomognuta transformacija pamuka

(2007) pokazuju blagotvorne učinke transformacije pamuka potpomognute ultrazvukom. Akustična kavitacija uzrokovana niskofrekventnim ultrazvukom stvara mikro-rane na površini biljnog tkiva i ispod nje (sonoporacija) i omogućuje Agrobacteriji da putuje dublje i potpuno kroz biljno tkivo. Ova moda ranjavanja povećava vjerojatnost zaraze biljnih stanica koje leže dublje u tkivu. Kako bi se procijenila učinkovitost transformacije SAAT-a, izmjerena je ekspresija GENA GUS-a. GUS reporterski sustav je genski sustav reportera, posebno koristan u biljnoj molekularnoj biologiji i mikrobiologiji. Podešavajući različite SAAT parametre, GUS-ova prolazna ekspresija u pamuku pomoću zrelih embrija kao eksplanta značajno je poboljšana. GUS je prvi put otkriven 24 sata nakon inkubacije eksplanta, a do 48h, GUS ekspresija je bila vrlo intenzivna što je poslužilo kao koristan pokazatelj uspješne transformacije pamučnog eksplanta nakon ultrazvukom potpomognute agrobakterijske posredovane transformacije (SAAT). Usporedba različitih tehnika transformacije (naime biolističke, Agro, BAAT, SAAT), transformacije posredovane ultrazvukom Agrobacterium (SAAT) pokazala je daleko najbolje rezultate transformacije.

Izbor postupka transformacije na temelju prolaznog izražavanja GUS-a. Transformacija posredovana ultrazvukom Agrobakterije (SAAT) pokazuje znatno veći prolazni izraz.
(studija i grafika: © Hussain i sur., 2007))

Ultrazvučna rješenja visokih performansi za sonoporaciju i SAAT

Hielscher Ultrasonics je dugogodišnji iskustvo u razvoju i proizvodnji high-performance ultrasonicators za laboratorije, istraživačke objekte kao i industrijske proizvodnje s vrlo visokim propusnosti. Za mikrobiologiju i znanost o životu, Hielscher nudi različita rješenja za prilagodbu različitim zahtjevima potrebnim za određena tkiva i njihove tretmane. Za istovremenu ultrazvukom brojnih uzoraka Hielscher nudi UIP400MTP za višewell ploče, VialTweeter za ultrazvukom do 10 bočica (npr. Eppendorf cijevi) ili ultrazvučni CupHorn. Sondni ultrasonicators su dostupni od 50 do 400 vata kao laboratorijski homogenizatori, dok industrijski sustavi pokrivaju raspon snage od 500 vata do 16kW.
Molimo vas da stupite u kontakt s nama i obavijestite nas o vašim zahtjevima za prijavu i obradu. Naše dobro iskusno osoblje rado će preporučiti najprikladniji ultrasonicator za vaš biološki proces.
Tablica u nastavku daje vam pokazatelj približne mogućnosti obrade naših ultrazvučnih uređaja: