Genetska transformacija u biljnim stanicama pomoću ultrazvuka
Sonication-Assisted Agrobacterium-Posredovana transformacija (SAAT) učinkovita je metoda za zarazu biljnih stanica stranim genima koji koriste Agrobacterium kao transporter. Ultrazvučna kavitacija uzrokuje sonoporaciju, koja se može opisati kao ciljano mikro-ranjavanje biljnog tkiva. Putem ovih ultrazvučno stvara mikro-rane, DNA i DNA vektori mogu se učinkovito transportirati u staničnu matricu.
sonoporacija – Ultrazvučno poboljšana transformacija stanica
Kada se ultrazvuk niske frekvencije (približno 20 kHz) primjenjuje na stanične suspenzije, učinci akustične kavitacije uzrokuju prolaznu membransku propusnost na stanična tkiva. Ovaj ultrazvučni učinak poznat je kao sonoporacija i koristi se za prijenos gena u stanice ili tkiva.
Prednosti ultrazvuka temelje se na njegovom netoplinskom mehaničkom principu rada, što ultrazvukom često čini svestranijom i manje ovisnom o vrstama stanica. Svestrana primjena sonoporacije otvara mogućnost korištenja transgenih biljaka, koje imaju značajan potencijal u bioprodukciji složenih ljudskih terapijskih proteina. Takvim bioreaktorima na biljnoj bazi može se lako genetski manipulirati, spriječiti potencijalnu kontaminaciju ljudskim patogenima, ne oštetiti bakterije koje posreduju u transformaciji (npr. Agrobakterija) i jeftina su, učinkovita metoda bio-sinteze.
Ultrasonicator UP200St (200W, 26kHz) sa zvučnim kućištem
Ultrazvučno potpomognuta transformacija stanica
Sonication je tehnika koja primjenjuje niskofrekventne ultrazvučne valove za miješanje čestica u otopini, za miješanje otopina, čime se povećava brzina prijenosa mase i otapanja. Istodobno, ultrazvukom se mogu ukloniti otopljeni plinovi iz tekućina. U biljnoj transformaciji ultrazvukom će se stvoriti mikrovijoti na biljnom tkivu i poboljšati isporuku gole DNK u biljni protoplast.
Za genetsku transformaciju, transformacija (SAAT) potpomognuta ultrazvukom (SaAT) je preferirana metoda i ima znatno veću učinkovitost od ultrazvukom koja se koristi za prijenos golih vektora DNA i DNA izravno u protoplast. Brojne studije pokazale su da se ultrazvukom pomogla transformaciji posredovanoj agrobakterijom (SAAT) koja se može koristiti za izazivanje mehaničkih poremećaja i stvaranja rana na biljnim stanicama ultrazvučnim valovima i rezultirajućom akustičkom kavitacijom. Kratki ultrazvučni tretman stvara mikro-rane na površini eksplanta. Kako će ranjene stanice omogućiti prodiranje Agrobakterije u dublji dio biljnih tkiva, čime će se povećati vjerojatnost zaraze biljnih stanica. Osim toga, izlučeni fenolni spojevi pojačavaju transformaciju. Ultrazvučno generirane mikro-rane čine prodiranje eksplanta bakterijama također izvedivijim. SAAT je uspješno korišten za genetsku transformaciju kod biljnih vrsta koje se posebno smatraju otpornima na Agrobakteriju.
Budući da je vrlo jednostavna i jeftina metoda, kao i značajno poboljšanje prijenosa gena posredovanih Agrobakterijom glavne su prednosti SAAT-a. Osim uspješne primjene SAAT-a u transformaciji Chenopodium rubrum L. i Beta vulgaris L., ovaj pristup primijenjen je i u proizvodnji rekombinantnih Escherichia coli divljih vrsta toplinsko-labilnog holotoksina i Escherichia coli mutant LT cjepiva adjuvants u Nicotiana tabacumu, u kojem su kod ptica otkriveni najviši sistemski IgG titre specifični za LT-B.
(usp. Laere i dr., 2016.; M. Klimek-Chodacka i R. Baranski, 2014.)
VialTweeter za istovremenu ultrazvukom više cijevi uzorka, npr. za sonication-potpomognutu Agrobacterium- posredovanu transformaciju (SAAT)
Znanstveno dokazane prednosti transformacije posredovane agrobakterijom uz pomoć ultrazvukom (SAAT)
Sonication-Assisted Agrobacterium-Posredovana transformacija (SAAT) primijenjena je na brojne biljne vrste. Kratko i relativno blago ultrazvučno liječenje kultura biljnih stanica uzrokuje sonoporaciju, što naknadno omogućuje duboku penetraciju Agrobacterium kao transportera gena. U nastavku možete pročitati uzorne studije koje pokazuju blagotvorne učinke SAAT-a.
Ultrazvučno potpomognuta transformacija Ashwagandha
Kako bi se poboljšala učinkovitost transformacije u W. somniferi (poznatoj kao ashwagandha ili zimska trešnja), Dehdashti i kolege (2016.) istraživali su uporabu acetosiringona (AS) i ultrazvukom.
Acetosiringon (AS) dodan je u tri faze: likvidna kultura Agrobacterium, infekcija Agrobacterium i kokultura objašnjenja s Agrobacterijom. Utvrđeno je da je dodavanje 75 μM AS u tekuću kulturu Agrobacterium optimalno za indukciju virskih gena.
Dodatna primjena ultrazvukom (SAAT) rezultirala je najvišom ekspresijom gena. Utvrđeno je da je ekspresija gena gusA u dlakavim korijenima najbolja kada su vrhovi lišća i pucanja ultrazvukom 10, odnosno 20s. Učinkovitost transformacije poboljšanog protokola zabilježena je 66,5 odnosno 59,5% u slučaju eksplanta vrhova lišća i pucanja. U usporedbi s drugim protokolima utvrđeno je da je učinkovitost transformacije ovog poboljšanog protokola 2,5 puta viša za lišće i 3,7 puta više za savjete za pucanje. Južne analize mrlja potvrdile su 1–2 kopije gusA transgena u linijama W1-W4, dok su 1–4 transgenske kopije otkrivene u liniji W5 generiranoj poboljšanim protokolom.
Učinak trajanja transformacije posredovane ultrazvukom Agrobakterije (SAAT) na učestalost transformacije lista W. somnifere (a) i vrha pucanja (b) objašnjenja
(studija i grafika: © Dehdashti et al., 2016)
Ultrazvučno potpomognuta transformacija pamuka
(2007) pokazuju blagotvorne učinke transformacije pamuka potpomognute ultrazvukom. Akustična kavitacija uzrokovana niskofrekventnim ultrazvukom stvara mikro-rane na površini biljnog tkiva i ispod nje (sonoporacija) i omogućuje Agrobacteriji da putuje dublje i potpuno kroz biljno tkivo. Ova moda ranjavanja povećava vjerojatnost zaraze biljnih stanica koje leže dublje u tkivu. Kako bi se procijenila učinkovitost transformacije SAAT-a, izmjerena je ekspresija GENA GUS-a. GUS reporterski sustav je genski sustav reportera, posebno koristan u biljnoj molekularnoj biologiji i mikrobiologiji. Podešavajući različite SAAT parametre, GUS-ova prolazna ekspresija u pamuku pomoću zrelih embrija kao eksplanta značajno je poboljšana. GUS je prvi put otkriven 24 sata nakon inkubacije eksplanta, a do 48h, GUS ekspresija je bila vrlo intenzivna što je poslužilo kao koristan pokazatelj uspješne transformacije pamučnog eksplanta nakon ultrazvukom potpomognute agrobakterijske posredovane transformacije (SAAT). Usporedba različitih tehnika transformacije (naime biolističke, Agro, BAAT, SAAT), transformacije posredovane ultrazvukom Agrobacterium (SAAT) pokazala je daleko najbolje rezultate transformacije.
Izbor postupka transformacije na temelju prolaznog izražavanja GUS-a. Transformacija posredovana ultrazvukom Agrobakterije (SAAT) pokazuje znatno veći prolazni izraz.
(studija i grafika: © Hussain i sur., 2007))
Ultrazvučna rješenja visokih performansi za sonoporaciju i SAAT
Hielscher Ultrasonics je dugogodišnji iskustvo u razvoju i proizvodnji high-performance ultrasonicators za laboratorije, istraživačke objekte kao i industrijske proizvodnje s vrlo visokim propusnosti. Za mikrobiologiju i znanost o životu, Hielscher nudi različita rješenja za prilagodbu različitim zahtjevima potrebnim za određena tkiva i njihove tretmane. Za istovremenu ultrazvukom brojnih uzoraka Hielscher nudi UIP400MTP za višewell ploče, VialTweeter za ultrazvukom do 10 bočica (npr. Eppendorf cijevi) ili ultrazvučni CupHorn. Sondni ultrasonicators su dostupni od 50 do 400 vata kao laboratorijski homogenizatori, dok industrijski sustavi pokrivaju raspon snage od 500 vata do 16kW.
Molimo vas da stupite u kontakt s nama i obavijestite nas o vašim zahtjevima za prijavu i obradu. Naše dobro iskusno osoblje rado će preporučiti najprikladniji ultrasonicator za vaš biološki proces.
Tablica u nastavku daje vam pokazatelj približne mogućnosti obrade naših ultrazvučnih uređaja:
| Batch Volumen | Protok | Preporučeni uređaji |
|---|---|---|
| multiwell / mikrotiter ploče | N.a. | UIP400MTP |
| do 10 bočica | N.a. | VialTweeter |
| do 5 bočica/cijevi ili 1 veće posude | N.a. | Cuphorn |
| 1 do 500 mL | 10 do 200 mL / min | UP100H |
| 10 do 2000 ml | 20 do 400 mL / min | Uf200 ः t, UP400St |
| 0.1 do 20L | 0.2 do 4L / min | UIP2000hdT |
| 10 do 100L | 2 do 10 l / min | UIP4000hdT |
| N.a. | 10 do 100 l / min | UIP16000 |
| N.a. | veći | grozd UIP16000 |
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi za miješanje aplikacija, disperziju, emulzifikaciju i ekstrakciju na laboratorijskim, pilotskim i industrijskim razmjerima.
Književnost / Reference
- Klimek-Chodacka, Magdalena & Baranski, Rafal (2014): A protocol for sonication-assisted Agrobacterium rhizogenesmediated transformation of haploid and diploid sugar beet (Beta vulgaris L.) explants. Acta biochimica Polonica 2014. 13-17.
- Bing-fu GUO, Yong GUO, Jun WANG, Li-juan ZHANG, Long-guo JIN, Hui-long HONG, Ru-zheng CHANG, Li-juan QIU (2015): Co-treatment with surfactant and sonication significantly improves Agrobacterium-mediated resistant bud formation and transient expression efficiency in soybean. Journal of Integrative Agriculture, Volume 14, Issue 7, 2015. 1242-1250.
- Dehdashti, Sayed Mehdi; Acharjee, Sumita; Kianamiri, Shahla; Deka, Manab (2016): An efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation protocol of Withania somnifera. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 128(1), 2016. 55–65.
- Syed Sarfraz Hussain; Tayyab Husnain; S. Riazuddin (2007): Sonication Assisted Agrobacterium Mediated Transformation (Saat): An Alternative Method For Cotton Transformation. Pak. J. Bot., 39(1), 2007. 223-230.
Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi Laboratorija do industrijske veličine.