Chitin i Chitosan Proizvodnja iz gljiva

Ultrasonication je vrlo učinkovita metoda za oslobađanje hitina i kitozana iz gljivičnih izvora kao što su gljive. Hitin i kitozan moraju se deacetilirati u obradi nizvodno kako bi se dobio visokokvalitetni biopolimer. Ultrazvučno potpomognuta deacetilacija je vrlo učinkovita, jednostavna i brza tehnika, što rezultira visokokvalitetnim kitozanima s visokom molekularnom težinom i vrhunskom bioraspoloživošću.

Hitin i kitozan iz gljiva

Jestive i ljekovite gljive kao što su Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi ili reishi), Inonotus obliquus (chaga), Agaricus bisporus (gumbaste gljive), Hericium erinaceus (lavlja griva), Cordyceps sinensis (gljiva gusjenica), Grifola frondosa (kokoš od drveta), Trametes versicolor (Corio verlussicolor, Polyporus versicolor, pureći rep) i mnoge druge vrste gljiva široko se koriste kao hrana i za ekstrakciju bioaktivnih spojeva. Ove gljive, kao i prerada ostataka (gljiva otpada) može se koristiti za proizvodnju kitozana. Ultrasonication ne samo da potiče oslobađanje hitina iz strukture stijenke gljivičnih stanica, već i potiče pretvaranje chitiona u vrijedan kitozan putem ultrazvučne depolymerizacije.

Deacetilacija hitina do kitozan je promovira ultrazvukom

hitina, koji je N-acetilglukozaminski polimer (poli-(β-(1–4)-N-acetil-D-glukozamin), prirodni je polisaharid koji se široko nalazi u egzoskeletu beskralješnjaka kao što su rakovi i insekti, unutarnji kostur lignji i sipa, kao i stanične stijenke gljiva. Ugrađen u strukturu zidova stanica gljiva, hitin je odgovoran za oblik i krutost stijenke gljivičnih stanica. Za mnoge primjene hitin se pretvara u njegov deacetilirani derivat, poznat kao kitozan putem procesa depolymerizacije.
kitozan je najčešći i najvredniji derivat hitina. To je polisaharid visoke molekularne težine povezan b-1,4 glikozida, sastavljen od N-acetil-glukozamina i glukozamina.
Chitosan se može izvesti kemijskim ili enzimskim N- deacetilacija. U kemijski pogonjenom procesu deacetilacije acetilna skupina (R-NHCOCH₃) otisnuta je jakim alkalnim temperaturama na visokim temperaturama. Alternativno, kitozan se može sintetizirati enzimskom deacetilacijom. Međutim, na industrijskoj proizvodnoj ljestvici kemijska deacetilacija je preferirana tehnika, budući da je enzimska deacetilacija znatno manje učinkovita zbog visokih troškova enzima deacetilaze i niskih dobivenih prinosa kitozana. Ultrasonication se koristi za intenziviranje kemijske degradacije (1→4)-/β-linkage (depolymerization) i učinak deacetilacije hitina za dobivanje visokokvalitetnog kitozana. Kada se sonication primjenjuje kao pred-tretman za enzimsku deacetilaciju, poboljšava se i prinos i kvaliteta kitozana.

Industrijska proizvodnja kitozana od gljiva s ultrazvukom

Komercijalna proizvodnja hitina i kitozana uglavnom se temelji na rasipanju morske industrije (tj. ribolovu, berbi školjaka itd.). Različiti izvori sirovina rezultiraju različitim kvalitetama hitina i kitozana, što rezultira proizvodnjom i fluktuacijama kvalitete zbog sezonskih varijacija ribolova. Nadalje, kitozan izveden iz gljivičnih izvora nudi navodno vrhunska svojstva poput homogene duljine polimera i veće topljivosti u usporedbi s kitozanom iz morskih izvora. (usp. Ghormade i sur., 2017.) Kako bi se opskrbio ujednačenim kitozanom, vađenje hitina iz gljivičnih vrsta postalo je stabilna alternativna proizvodnja. Proizvodnja hitina i citiosana iz gljiva može se lako i pouzdano postići ultrazvučnom tehnologijom ekstrakcije i deacetilacije. Intenzivna ultrazvukom ometa stanične strukture za oslobađanje hitina i potiče prijenos mase u akvaoznim otapalima za vrhunske prinose hitina i učinkovitost ekstrakcije. Naknadna ultrazvučna deacetilacija pretvara hitin u vrijedan kitozan. Oba, ultrazvučna ekstrakcija hitina i deacetilacija na kitozan može se linearno skalirati na bilo koju komercijalnu razinu proizvodnje.

Sonication pojačava proizvodnju gljivičnog kitozana i čini proizvodnju učinkovitijom i ekonomičnijom.
(slika i studija: © Zhu et al., 2019.)

Visoko učinkovita sinteza kitozana putem ultrazvukom

Kako bi se prevladali nedostaci (tj. niska učinkovitost, visoka cijena energije, dugo vrijeme obrade, toksična otapala) tradicionalne kemijske i enzimske chitin deacetlytion, ultrazvuk visokog intenziteta integriran je u obradu hitina i kitozana. Ultrazvukom visokog intenziteta i rezultirajući učinci akustične kavitacije dovode do brze škare polimernih lanaca i smanjuju polidisperzitet, čime se potiče sinteza kitozana. Nadalje, ultrazvučne sile smicanja pojačavaju prijenos mase u otopini tako da se poboljšava kemijska, hidrolitička ili enzimska reakcija.

Ultrazvučno potpomognuta kemijska deacetilacija i depolymerizacija

Budući da je hitin nereaktivan i netopljiv biopolimer, mora proći procesne korake demineralizacije, deproteinizacije i depolymerizacije / deacetilacije kako bi se dobio topljiv i bioakesabilan kitozan. Ovi koraci procesa uključuju tretmane s jakim kiselinama kao što su HCl i jake baze kao što su NaOH i KOH. Budući da su ovi konvencionalni koraci procesa neučinkoviti, spori i zahtijevaju visoke energije, intenziviranje procesa ultrazvukom značajno poboljšava proizvodnju kitozana. Primjena power-ultrazvuka povećava prinose i kvalitetu kitozana, smanjuje proces iz dana u nekoliko sati, omogućuje blaža otapala i čini cijeli proces energetski učinkovitijim.

Ultrazvučno poboljšana deproteinizacija hitina

(2021) je u svom istraživanju deproteinizacije hitina utvrdio da je "primjena ultrazvuka za proizvodnju biopolimera smanjila sadržaj proteina kao i veličinu čestica hitina. Chitosan visokog stupnja deacetilacije i srednje molekularne težine proizveden je ultrazvučnom pomoći.

Ultrazvučna hidroliza za chitin depolymerization

Za kemijsku hidrolizu koriste se kiseline ili lužine za deacetilat hitina, no šire se koristi alkalna deacetilacija (npr. natrijev hidroksid NaOH). Acidna hidroliza je alternativna metoda tradicionalne kemijske deacetilacije, gdje se otopine organske kiseline koriste za depolymerizaciju hitina i kitozana. Metoda hidrolize kiseline uglavnom se koristi kada molekularna težina hitina i kitozana mora biti homogena. Ovaj konvencionalni proces hidrolize poznat je kao spor i energetski i troškovno intenzivan. Potreba za jakim kiselinama, visokim temperaturama i pritiscima su čimbenici koji pretvaraju hidrolitički kitozan u vrlo skup i dugotrajan postupak. Korištene kiseline zahtijevaju nizvodne procese kao što su neutralizacija i desaliranje.
Integracijom ultrazvuka velike snage u proces hidrolize, zahtjevi temperature i tlaka za hidrolitički dekolte hitina i kitozana mogu se značajno smanjiti. Nadalje, ultrazvukom omogućuje niže koncentracije kiseline ili korištenje blažih kiselina. To čini proces održivijim, učinkovitijim, isplativijim i ekološki prihvatljivijim.

Ultrazvučno potpomognuta kemijska deacetilacija

Kemijsko raspadanje i deakteilacija hitina i kitozana uglavnom se postiže liječenjem hitina ili kitozana mineralnim kiselinama (npr. klorovodična kiselina HCl), natrijevim nitritom (NaNO₂), ili vodikov peroksid (H₂O₂). Ultrazvuk poboljšava brzinu deacetilacije čime se skraćuje vrijeme reakcije potrebno za dobivanje ciljanog stupnja deacetilacije. To znači da ultrazvukom smanjuje potrebno vrijeme obrade od 12-24 sata do nekoliko sati. Nadalje, ultrazvukom omogućuje znatno niže kemijske koncentracije, na primjer 40% (w /w) natrijev hidroksid pomoću ultrazvukom dok 65% (w /w) su potrebni bez korištenja ultrazvuka.

Ultrazvučno-enzimska deacetilacija

Iako je enzimska deacetilacija blagi, ekološki benigni oblik obrade, njegova učinkovitost i troškovi su neekonomični. Zbog složene, radno intenzivne i skupe nizvodne izolacije i pročišćavanja enzima iz krajnjeg proizvoda, enzimska deacetilacija hitina ne provodi se u komercijalnoj proizvodnji, već se koristi samo u znanstveno-istraživačkom laboratoriju.
Ultrazvučni pred-tretman prije enzimske deacetlikacije fragmenti hitina molekule čime se povećava površina i čini više površine dostupne za enzime. Ultrazvukom visokih performansi pomaže u poboljšanju enzimske deacetilacije i čini proces ekonomičnijim.

Rezultati istraživanja za ultrazvučni hitin i chitosan deacetilation

(2018) zaključuju u svojoj studiji da se ultrazvučna deacetilacija pokazala ključnim otkrićem, pretvarajući β-hitin u kitozan s 83-94% deacetilacije pri smanjenim temperaturama reakcije. Slika lijevo prikazuje SEM sliku ultrazvučno deacetiliranog kitozana (90 W, 15 min, 20 w / v% NaOH, 1:15 (g: mL) (slika i studija: © Zhu et al., 2018.)
U njihovom protokolu, Otopina NaOH (20 w/v %) pripremljena je otapanjem NaOH pahuljica u DI vodi. Alkalna otopina zatim je dodana GLSP sedimentu (0,5 g) u omjeru krute tekućine od 1:20 (g: mL) u centrifugu. Chitosan je dodan u NaCl (40 ml, 0,2 M) i octenu kiselinu (0,1 M) pri omjeru volumena otopine 1:1. Suspenzija je tada podvrgnuta ultrazvuku na blagoj temperaturi od 25 ° C tijekom 60 minuta pomoću sondi tipa ultrasonicator (250W, 20kHz). (usp. Zhu et al., 2018.)
(2021) otkrili su da na brzinu razgradnje chitosanskih otopina rijetko utječu koncentracije kiseline koja se koristi za topljivost polimera i uvelike ovisi o temperaturi, intenzitetu ultrazvučnih valova i ionskom snazi medija koji se koristi za otapanje polimera. (usp. Pandit i sur., 2021.)

U drugoj studiji, Zhu et al. (2019) koristio ganoderma lucidum spore praha kao gljivične sirovine i istraživao ultrazvučno‐asisted deacetylation i učinke obrade parametara kao što su vrijeme ultrazvukom, solid‐to‐liquid omjer, Koncentracija NaOH, i zračenje snage na stupanj deacetilacije (DD) kitozana. Najviša DD vrijednost dobivena je na sljedećim ultrazvučnim parametrima: 20 min ultrazvukom na 80W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Površinska morfologija, kemijske skupine, toplinska stabilnost i kristalnost ultrazvučno dobivenog kitozana ispitani su pomoću SEM- a, FTIR-a, TG-a i XRD-a. Istraživački tim izvještava o značajnom poboljšanju stupnja deacetilacije (DD), dinamičke viskoznosti ([η]) i molekularne težine (Mv ̄) ultrazvučno proizvedenog kitozana. Rezultati su naglasili ultrazvučnu tehniku deacetilacije gljiva vrlo moćnu metodu proizvodnje kitozana, koja je pogodna za biomedicinske primjene. (usp. Zhu et al., 2019.)

SEM slike hitina i kitozana iz dvije vrste gljiva: a) Hitin iz L. vellereusa; b) hitin iz P. ribisa; c) Kitozan iz L.vellereusa; d) kitozan iz P. ribisa.
slika i studija: © Erdoğan i sur., 2017.

Vrhunska kvaliteta kitozana s ultrazvučnom deacetilacijom

Ultrazvučno vođeni procesi ekstrakcije hitina / kitozana i depolymerizacije precizno se kontroliraju, a ultrazvučni parametri procesa mogu se prilagoditi sirovinama i ciljanoj kvaliteti krajnjeg proizvoda (npr. Molekularna težina, stupanj deacetilacije). To omogućuje prilagodbu ultrazvučnog procesa vanjskim čimbenicima i postavljanje optimalnih parametara za vrhunski ishod i učinkovitost.
Ultrazvučno deacetilirani kitozan pokazuje izvrsnu bioraspoloživost i biokompatibilnost. Kada se ultrazvučno pripremljeni biopolimeri kitozana uspoređuju s termički izvedenim kitozanom u pogledu biomedicinskih svojstava, ultrazvučno proizvedeni kitozan pokazuje značajno poboljšanu održivost fibroblasta (L929 stanica) i poboljšanu antibakterijsku aktivnost za Escherichia coli (E. coli) i Staphylococcus aureus (S. aureus).
(usp. Zhu et al., 2018.)

Kako ultrazvučna ekstrakcija i deacetilacija hitina rade?

Kada snaga ultrazvučni valovi su parovi u tekućinu ili kašu (npr, suspenzija koja se sastoji od hitina u otapalu), ultrazvučni valovi putuju kroz tekućinu uzrokujući naizmjenične cikluse visokog tlaka / niskog tlaka. Tijekom ciklusa niskog tlaka stvaraju se minutni vakuumski mjehurići (takozvani kavitacijski mjehurići), koji rastu tijekom nekoliko ciklusa tlaka. U određenoj veličini, kada mjehurići ne mogu apsorbirati više energije, oni se nasilno urušaju tijekom ciklusa visokog tlaka. Imploziju mjehurića karakteriziraju intenzivne kavitacijske (ili sonomehaničke) sile. Ovi sonomehanički uvjeti javljaju se lokalno u kavitacijskom žarištu i karakteriziraju ih vrlo visoke temperature i pritisci do 4000K odnosno 1000atm; kao i odgovarajuće razlike u visokim temperaturama i tlaku. Furtehrmore nastaju mikro-turbulencije i tekući tokovi s brzinama do 100 m/s. Ultrazvučna ekstrakcija hitina i kitozana iz gljivica i rakova, kao i dezolimerizacija i deacetilacija hitina uglavnom su uzrokovani sonomehanskim učincima: uznemirenost i turbulencije ometaju stanice i potiču prijenos mase, a također mogu rezati polimerne lance u kombinaciji s kiselim ili alkalnim otapalima.
Radni princip ekstrakcije hitina putem ultrazvuka: Ultrazvučna ekstrakcija učinkovito razbija staničnu strukturu gljiva i oslobađa unutarstanične spojeve iz stanične stijenke i unutrašnjosti stanica (tj. polisaharidi kao što su hitin i kitozan i druge bioaktivne fitokemikalije) u otapalo. Ultrazvučna ekstrakcija temelji se na radnom principu akustične kavitacije. Učinci ultrazvučne / akustične kavitacije su sile visokog smicanja, turbulencije i intenzivne diferencijale tlaka. Ove sonomehaničke sile razbijaju stanične strukture kao što su stijenke stanica hitinoznih gljiva, potiču prijenos mase između biomaterijala i otapala gljivica i rezultiraju vrlo visokim prinosima ekstrakta u brzom procesu. Osim toga, ultrazvukom potiče sterilizaciju ekstrakata ubijanjem bakterija i mikroba. Mikrobna inaktivacija ultrazvukom rezultat je destruktivnih kavitacijskih sila stanične membrane, proizvodnje slobodnih radikala i lokaliziranog grijanja.
Radni princip depolymerizacije i deacetilacije ultrazvukom: Polimerni lanci uhvaćeni su u polju smicanja oko mjehurića, a segmenti lanca polimerne zavojnice u blizini urušavanja šupljine pomaknut će se većom brzinom od onih dalje. Naprezanja se zatim proizvode na polimernom lancu zbog relativnog gibanja polimernih segmenata i otapala i ona su dovoljna da uzrokuju cijepanje. Proces je stoga sličan drugim učincima striženja u polimernim otopinama ~ 2 ° i daje vrlo slične rezultate. (usp. Cijena i sur., 1994.)

Ultrazvučna oprema visokih performansi za gljivičnu chitin i chitosan obradu

Skeniranje elektron mikroskopije (SEM) slika u povećavanju 100 × a) Gladius, b) ultrazvučno tretirane Gladius, c) β-chitin, d) ultrazvučno tretirani β-chitin, i e) kitozan (izvor: Preto et Al. 2017)

Fragmentacija hitina i decetilacija hitina u kitozan zahtijeva snažnu i pouzdanu ultrazvučnu opremu koja može isporučiti visoke amplitude, nudi preciznu upravljivost nad parametrima procesa i može se upravljati 24/7 pod velikim opterećenjem iu zahtjevnim okruženjima. Asortiman proizvoda Hielscher Ultrasonics pouzdano ispunjava ove zahtjeve. Osim izvanrednih ultrazvučnih performansi, Hielscher ultrasonicators mogu se pohvaliti visokom energetskom učinkovitošću, što je značajna ekonomska prednost. – osobito kada se zapošljavaju u komercijalnoj velikoj proizvodnji.
Hielscher ultrasonicators su sustavi visokih performansi koji mogu biti opremljeni priborom kao što su sonotrode, pojačivači, reaktori ili stanice protoka kako bi na optimalan način odgovarali vašim potrebama procesa. S digitalnim zaslonom u boji osigurana je mogućnost unaprijed postavljenih ultrazvukom, automatsko snimanje podataka na integriranoj SD kartici, daljinsko upravljanje preglednikom i mnoge druge značajke, najviša kontrola procesa i jednostavnost korištenja. Upareni s robusnošću i teškim nosivim kapacitetom, Hielscher ultrazvučni sustavi su vaš pouzdan radni konj u proizvodnji. 
Chitin fragmentacija i deacetilacija zahtijeva snažan ultrazvuk za dobivanje ciljane pretvorbe i konačni kitozan proizvod visoke kvalitete. Posebno za fragmentaciju hitinskih pahuljica i korake depolymerizacije / deacetilacije, ključne su visoke amplitude i povišeni tlakovi. Hielscher Ultrasonics 'industrijski ultrazvučni procesori lako isporučiti vrlo visoke amplitude. Amplitude do 200 μm mogu se kontinuirano izvoditi u 24/7 operaciji. Za još veće amplitude dostupne su prilagođene ultrazvučne sonotrode. Snaga kapaciteta Hielscher ultrazvučnih sustava omogućuje učinkovitu i brzu deacetilaciju u sigurnom i user-friendly procesu.
Tablica u nastavku daje vam pokazatelj približne mogućnosti obrade naših ultrazvučnih uređaja: