Proizvodnja hitina i hitozana iz gljiva

Ultrazvučna obrada vrlo je učinkovita metoda oslobađanja hitina i hitozana iz gljivičnih izvora kao što su gljive. Hitin i hitozan moraju se depolimerizirati i deacetilirati u daljnjoj obradi kako bi se dobio visokokvalitetan biopolimer. Ultrazvučno potpomognuta depolimerizacija i deacetilacija vrlo je učinkovita, jednostavna i brza tehnika kojom se dobivaju visokokvalitetni hitozani visoke molekulske mase i bolje bioraspoloživosti.

Dobivanje hitina i hitozana iz gljiva ultrazvučnom obradom

Jestive i ljekovite gljive kao što su Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (lingzhi ili reishi), Inonotus obliquus (čaga), Agaricus bisporus (šampinjoni), Hericium erinaceus (lavlja griva), Cordyceps sinensis (gusjeničasta gljiva), Grifola frondosa (zečarka), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, puranov rep) i mnoge druge vrste gljiva naširoko se upotrebljavaju kao hrana i za ekstrakciju bioaktivnih spojeva. Te se gljive, kao i ostaci prerade (otpad od gljiva), mogu upotrebljavati za proizvodnju hitozana. Ultrazvučna obrada ne samo da potiče oslobađanje hitina iz strukture stanične stijenke gljiva nego i pokreće pretvorbu hitina u vrijedan hitozan ultrazvučno potpomognutom depolimerizacijom i deacetilacijom.

Sonikacija potiče depolimerizaciju i deacetilaciju hitina u hitozan

Intenzivna ultrazvučna obrada ultrazvučnim sustavom sa sondom tehnika je koja se upotrebljava za poticanje depolimerizacije i deacetilacije hitina, što dovodi do nastanka hitozana. Hitin je prirodni polisaharid koji se nalazi u egzoskeletima rakova i kukaca te u staničnim stijenkama određenih gljiva. Hitozan se dobiva iz hitina uklanjanjem acetilnih skupina iz molekule hitina.

Ultrazvučni postupak pretvorbe gljivičnog hitina u hitozan

Kada se intenzivna ultrazvučna obrada primjenjuje za proizvodnju hitozana iz hitina, suspenzija hitina sonicira se ultrazvučnim valovima visokog intenziteta i niske frekvencije, obično u rasponu od 20 kHz do 30 kHz. Postupak stvara intenzivnu akustičnu kavitaciju, koja podrazumijeva nastanak, rast i kolaps mikroskopskih vakuumskih mjehurića u tekućini. Kavitacija lokalno stvara iznimno velike smične sile, visoke temperature (do nekoliko tisuća Celzijevih stupnjeva) i tlakove (do nekoliko stotina atmosfera) u tekućini koja okružuje kavitacijske mjehuriće. Ti ekstremni uvjeti pridonose razgradnji polimera hitina i naknadnoj deacetilaciji.
 

SEM snimke hitina i hitozana iz dviju vrsta gljiva: a) hitin iz L. vellereus; b) hitin iz P. ribis; c) hitozan iz L.vellereus; d) hitozan iz P. ribis.
slika i istraživanje: © Erdoğan et al., 2017

Ultrazvučna depolimerizacija hitina

Depolimerizacija hitina odvija se kombiniranim djelovanjem mehaničkih sila, kao što su mikrostrujanje i stvaranje mlazova tekućine, te ultrazvučno pokrenutih kemijskih reakcija izazvanih slobodnim radikalima i drugim reaktivnim vrstama nastalima tijekom kavitacije. Visokotlačni valovi koji nastaju tijekom kavitacije izlažu lance hitina smičnom naprezanju, što dovodi do cijepanja polimera na manje fragmente.

Ultrazvučna deacetilacija hitina

Osim depolimerizacije, intenzivna ultrazvučna obrada potiče i deacetilaciju hitina. Deacetilacija uključuje uklanjanje acetilnih skupina iz molekule hitina, što dovodi do nastanka kitozana. Intenzivna ultrazvučna energija, osobito visoke temperature i tlakovi koji nastaju tijekom kavitacije, ubrzavaju reakciju deacetilacije. Reaktivni uvjeti stvoreni kavitacijom pomažu u kidanju acetilnih veza u hitinu, što rezultira oslobađanjem octene kiseline i pretvorbom hitina u kitozan.
Sveukupno, intenzivna ultrazvučna obrada poboljšava procese depolimerizacije i deacetilacije osiguravanjem potrebne mehaničke i kemijske energije za razgradnju polimera hitina i olakšavanje pretvorbe u kitozan. Ova tehnika nudi brzu i učinkovitu metodu proizvodnje kitozana iz hitina, s brojnim primjenama u različitim industrijama, uključujući farmaceutsku industriju, poljoprivredu i biomedicinsko inženjerstvo.

Industrijska proizvodnja kitozana iz gljiva ultrazvukom velike snage

Komercijalna proizvodnja hitina i kitozana uglavnom se temelji na otpadu iz morskih gospodarskih djelatnosti (tj. ribolova, izlova školjkaša itd.). Različiti izvori sirovina daju hitin i kitozan različite kvalitete, uz oscilacije u proizvodnji i kvaliteti zbog sezonskih promjena u ribolovu. Nadalje, prema dostupnim navodima, kitozan dobiven iz gljiva ima bolja svojstva, poput ujednačene duljine polimera i veće topljivosti, u usporedbi s kitozanom iz morskih izvora. (cf. Ghormade et al., 2017) Kako bi se osigurala opskrba kitozanom ujednačenih svojstava, ekstrakcija hitina iz gljivičnih vrsta postala je stabilna alternativa u proizvodnji. Proizvodnja hitina i kitozana iz gljiva može se jednostavno i pouzdano ostvariti tehnologijom ultrazvučne ekstrakcije i deacetilacije. Intenzivna sonikacija razara stanične strukture radi oslobađanja hitina i potiče prijenos tvari u vodenim otapalima radi postizanja većih prinosa hitina i veće učinkovitosti ekstrakcije. Naknadna ultrazvučna deacetilacija pretvara hitin u vrijedan kitozan. I ultrazvučna ekstrakcija hitina i deacetilacija u kitozan mogu se linearno povećati na bilo koju razinu komercijalne proizvodnje.

Sonikacija intenzivira proizvodnju kitozana iz gljiva te je čini učinkovitijom i ekonomičnijom.
(slika i istraživanje: © Zhu et al., 2019)

Rezultati istraživanja ultrazvučne deacetilacije hitina i kitozana

Zhu et al. (2018) u svojem istraživanju zaključuju da se ultrazvučna deacetilacija pokazala ključnim iskorakom, pretvarajući β-hitin u kitozan sa stupnjem deacetilacije od 83–94% pri sniženim reakcijskim temperaturama. Slika lijevo prikazuje SEM snimku ultrazvučno deacetiliranog kitozana (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (slika i istraživanje: © Zhu et al., 2018)
U njihovu protokolu otopina NaOH (20 w/v %) pripremljena je otapanjem pahuljica NaOH u deioniziranoj vodi. Lužnata otopina zatim je dodana talogu GLSP-a (0,5 g) u epruveti za centrifugiranje pri omjeru čvrste i tekuće faze od 1:20 (g: mL). Kitozan je dodan u NaCl (40 mL, 0,2 M) i octenu kiselinu (0,1 M) pri volumnom omjeru otopina od 1:1. Suspenzija je zatim podvrgnuta ultrazvuku pri blagoj temperaturi od 25°C tijekom 60 min pomoću ultrazvučnog uređaja sa sondom (250W, 20kHz). (usp. Zhu et al., 2018)
 
Pandit et al. (2021) utvrdili su da koncentracije kiseline upotrijebljene za otapanje polimera rijetko utječu na brzinu razgradnje otopina kitozana te da ona uvelike ovisi o temperaturi, intenzitetu ultrazvučnih valova i ionskoj jakosti medija upotrijebljenih za otapanje polimera. (usp. Pandit et al., 2021)
 
U drugom istraživanju Zhu et al. (2019) upotrijebili su prah spora gljive Ganoderma lucidum kao gljivičnu sirovinu te istražili ultrazvučno potpomognutu deacetilaciju i učinke procesnih parametara kao što su vrijeme sonikacije, omjer čvrste i tekuće faze, koncentracija NaOH i snaga ozračivanja na stupanj deacetilacije (DD) kitozana. Najviša vrijednost DD-a postignuta je pri sljedećim ultrazvučnim parametrima: 20 min sonikacije pri 80W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Morfologija površine, kemijske skupine, toplinska stabilnost i kristalnost ultrazvučno dobivenog kitozana ispitane su metodama SEM, FTIR, TG i XRD. Istraživački tim izvješćuje o znatnom povećanju stupnja deacetilacije (DD), dinamičke viskoznosti ([η]) i molekulske mase (Mv¯) ultrazvučno proizvedenog kitozana. Rezultati su istaknuli tehniku ultrazvučne deacetilacije gljiva kao vrlo djelotvornu metodu proizvodnje kitozana prikladnog za biomedicinske primjene. (usp. Zhu et al., 2019)

Vrhunska kvaliteta kitozana uz ultrazvučnu depolimerizaciju i deacetilaciju

Procesi ekstrakcije i depolimerizacije hitina / kitozana koji se odvijaju djelovanjem ultrazvuka mogu se precizno kontrolirati, a parametri ultrazvučnog procesa mogu se prilagoditi sirovinama i ciljanoj kvaliteti konačnog proizvoda (npr. molekulskoj masi, stupnju deacetilacije). To omogućuje prilagodbu ultrazvučnog procesa vanjskim čimbenicima i postavljanje optimalnih parametara za vrhunske rezultate i učinkovitost.
Ultrazvučno deacetilirani kitozan pokazuje izvrsnu bioraspoloživost i biokompatibilnost. Kada se biopolimeri kitozana pripremljeni ultrazvukom usporede s toplinski dobivenim kitozanom u pogledu biomedicinskih svojstava, ultrazvučno proizvedeni kitozan pokazuje znatno poboljšanu vijabilnost fibroblasta (stanica L929) i pojačanu antibakterijsku aktivnost protiv bakterija Escherichia coli (E. coli) i Staphylococcus aureus (S. aureus).
(usp. Zhu et al., 2018)
 

Snimke pretražne elektronske mikroskopije (SEM) pri povećanju od 100×: a) gladius, b) gladius obrađen ultrazvukom, c) β-hitin, d) β-hitin obrađen ultrazvukom i e) kitozan (izvor: Preto et al. 2017)

Ultrazvučna oprema visokih performansi za obradu hitina i kitozana

Fragmentacija hitina i deacetilacija hitina u kitozan zahtijevaju snažnu i pouzdanu ultrazvučnu opremu koja može postići visoke amplitude, omogućuje preciznu kontrolu procesnih parametara i može raditi 24/7 pod velikim opterećenjem i u zahtjevnim okruženjima. Asortiman proizvoda Hielscher Ultrasonics pouzdano ispunjava te zahtjeve. Osim izvanrednih ultrazvučnih performansi, Hielscher ultrazvučni uređaji odlikuju se visokom energetskom učinkovitošću, što je značajna ekonomska prednost – osobito pri uporabi u komercijalnoj proizvodnji velikih razmjera.
Hielscher ultrazvučni uređaji sustavi su visokih performansi koji se mogu opremiti dodatnom opremom kao što su sonotrode, pojačivači amplitude, reaktori ili protočne ćelije kako bi se optimalno prilagodili potrebama vašeg procesa. Uz digitalni zaslon u boji, mogućnost unaprijed zadanih ciklusa sonikacije, automatsko bilježenje podataka na ugrađenu SD karticu, daljinsko upravljanje putem preglednika i brojne druge značajke, Hielscher ultrazvučni uređaji osiguravaju najvišu razinu kontrole procesa i jednostavnosti uporabe. Zahvaljujući robusnosti i sposobnosti podnošenja velikih opterećenja, Hielscher ultrazvučni sustavi vaš su pouzdan radni oslonac u proizvodnji. Fragmentacija i deacetilacija hitina zahtijevaju snažan ultrazvuk kako bi se postigla ciljana pretvorba i dobio visokokvalitetan konačni proizvod od kitozana. Visoke amplitude i povišeni tlakovi ključni su osobito za fragmentaciju ljuskica hitina i korake depolimerizacije / deacetilacije. Industrijski ultrazvučni procesori Hielscher Ultrasonics lako postižu vrlo visoke amplitude. Amplitude do 200µm mogu se kontinuirano održavati pri radu 24/7. Za još više amplitude dostupne su ultrazvučne sonotrode izrađene po mjeri. Raspoloživa snaga Hielscher ultrazvučnih sustava omogućuje učinkovitu i brzu depolimerizaciju i deacetilaciju u sigurnom procesu jednostavnom za korisnika.
 

Sinergijska obrada hitina poboljšana primjenom ultrazvuka

Kako bi se prevladali nedostaci (tj. niska učinkovitost, visoki troškovi energije, dugo vrijeme obrade, toksična otapala) tradicionalne kemijske i enzimske deacetilacije hitina, ultrazvuk visokog intenziteta integriran je u obradu hitina i kitozana. Sonikacija visokog intenziteta i učinci akustične kavitacije koji pritom nastaju dovode do brzog cijepanja polimernih lanaca i smanjuju polidisperznost, čime potiču sintezu kitozana. Nadalje, ultrazvučne smične sile intenziviraju prijenos tvari u otopini, čime se pospješuju kemijske, hidrolitičke ili enzimske reakcije. Ultrazvučna obrada hitina može se kombinirati s već postojećim tehnikama obrade hitina kao što su kemijske metode, hidroliza ili enzimski postupci.

Ultrazvučno potpomognuta kemijska deacetilacija i depolimerizacija

Budući da je hitin nereaktivan i netopljiv biopolimer, mora proći procesne korake demineralizacije, deproteinizacije i depolimerizacije / deacetilacije kako bi se dobio topljiv i biološki dostupan kitozan. Ti procesni koraci uključuju obradu jakim kiselinama kao što je HCl i jakim bazama kao što su NaOH i KOH. Budući da su ti konvencionalni procesni koraci neučinkoviti, spori i zahtijevaju velike količine energije, intenzifikacija procesa sonikacijom znatno poboljšava proizvodnju kitozana. Primjena ultrazvuka velike snage povećava prinose i kvalitetu kitozana, skraćuje proces s nekoliko dana na nekoliko sati, omogućuje uporabu blažih otapala i čini cijeli proces energetski učinkovitijim.

Ultrazvučno poboljšana deproteinizacija hitina

Vallejo-Dominguez et al. (2021) u svojem su istraživanju deproteinizacije hitina utvrdili da je „primjena ultrazvuka za proizvodnju biopolimera smanjila udio proteina i veličinu čestica hitina. Uz pomoć ultrazvuka proizveden je hitozan visokog stupnja deacetilacije i srednje molekulske mase.”

Ultrazvučna hidroliza za depolimerizaciju hitina

Za kemijsku hidrolizu upotrebljavaju se kiseline ili lužine za deacetilaciju hitina, no alkalna deacetilacija (npr. natrijevim hidroksidom NaOH) šire je zastupljena. Kiselinska hidroliza alternativna je metoda tradicionalnoj kemijskoj deacetilaciji, pri kojoj se otopine organskih kiselina upotrebljavaju za depolimerizaciju hitina i hitozana. Metoda kiselinske hidrolize uglavnom se primjenjuje kada molekulska masa hitina i hitozana mora biti ujednačena. Taj konvencionalni postupak hidrolize poznat je kao spor, energetski zahtjevan i skup. Potreba za jakim kiselinama, visokim temperaturama i tlakovima čimbenici su koji hidrolitički postupak dobivanja hitozana čine vrlo skupim i dugotrajnim. Upotrijebljene kiseline zahtijevaju naknadne postupke poput neutralizacije i odsoljavanja.
Uvođenjem ultrazvuka velike snage u postupak hidrolize mogu se znatno smanjiti potrebne temperature i tlakovi za hidrolitičko cijepanje hitina i hitozana. Nadalje, sonikacija omogućuje niže koncentracije kiselina ili upotrebu blažih kiselina. Time postupak postaje održiviji, učinkovitiji, isplativiji i prihvatljiviji za okoliš.

Kemijska deacetilacija potpomognuta ultrazvukom

Kemijska razgradnja i deacetilacija hitina i hitozana uglavnom se postižu obradom hitina ili hitozana mineralnim kiselinama (npr. klorovodičnom kiselinom HCl), natrijevim nitritom (NaNO₂), ili vodikovim peroksidom (H₂O₂). Ultrazvuk povećava brzinu deacetilacije i time skraćuje vrijeme reakcije potrebno za postizanje ciljanog stupnja deacetilacije. To znači da sonikacija skraćuje potrebno vrijeme obrade s 12–24 sata na nekoliko sati. Nadalje, sonikacija omogućuje znatno niže koncentracije kemikalija, primjerice 40% (w/w) natrijeva hidroksida uz primjenu sonikacije, dok je bez primjene ultrazvuka potrebno 65% (w/w).

Ultrazvučno-enzimska deacetilacija

Iako je enzimska deacetilacija blag oblik obrade prihvatljiv za okoliš, zbog svoje učinkovitosti i troškova nije ekonomična. Zbog složene, radno zahtjevne i skupe naknadne izolacije i pročišćavanja enzima iz konačnog proizvoda, enzimska deacetilacija hitina ne primjenjuje se u komercijalnoj proizvodnji, nego se upotrebljava samo u znanstvenoistraživačkim laboratorijima.
Ultrazvučna predobrada prije enzimske deacetilacije usitnjava molekule hitina, čime povećava površinu i čini veći dio površine dostupnim enzimima. Sonikacija visokog učinka pomaže poboljšati enzimsku deacetilaciju i čini postupak ekonomičnijim.