Proizvodnja hitina i hitozana iz gljiva

Ultrasonication je vrlo učinkovita metoda za oslobađanje kitina i kitozana iz gljivičnih izvora kao što su gljive. Hitin i hitozan moraju se depolimerizirati i deacetilirati u daljnjoj obradi kako bi se dobio biopolimer visoke kvalitete. Ultrazvučno potpomognuta depolimerizacija i deacetilacija vrlo je učinkovita, jednostavna i brza tehnika, koja rezultira visokokvalitetnim kitozanima velike molekularne težine i vrhunske bioraspoloživosti.

Hitin i hitozan dobiveni iz gljiva ultrazvukom

Jestive i ljekovite gljive kao što su Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi ili reishi), Inonotus obliquus (chaga), Agaricus bisporus (butuljaste gljive), Hericium erinaceus (lavlja griva), Cordyceps sinensis (gljiva gusjenica), Grifola frondosa ( kokošja), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, puretina) i mnoge druge vrste gljiva naširoko se koriste kao hrana i za ekstrakciju bioaktivnih spojeva. Ove gljive, kao i ostaci prerade (otpad od gljiva) mogu se koristiti za proizvodnju kitozana. Ultrazvučna obrada ne samo da potiče oslobađanje hitina iz strukture stanične stijenke gljivica, već također potiče pretvorbu hitina u vrijedan hitozan ultrazvučno potpomognutom depolimerizacijom i deacetilacijom.

Depolimerizacija i deacetilacija hitina u hitozan pospješuju se sonikacijom

Intenzivna ultrazvučna obrada pomoću ultrazvučnog sustava sonde je tehnika koja se koristi za promicanje depolimerizacije i deacetilacije hitina, što dovodi do stvaranja hitozana. Hitin je prirodni polisaharid koji se nalazi u egzoskeletima rakova, insekata i staničnih stijenki određenih gljiva. Hitozan se dobiva iz hitina uklanjanjem acetilnih skupina iz molekule hitina.

Ultrazvučni postupak za pretvorbu gljivičnog hitina u hitozan

Kada se intenzivna ultrazvučna obrada primjenjuje za proizvodnju hitozana iz hitina, hitinska suspenzija se sonicira ultrazvučnim valovima visokog intenziteta, niske frekvencije, obično u rasponu od 20 kHz do 30 kHz. Proces stvara intenzivnu akustičnu kavitaciju, koja se odnosi na stvaranje, rast i kolaps mikroskopskih vakuumskih mjehurića u tekućini. Kavitacija stvara lokalizirane ekstremno velike sile smicanja, visoke temperature (do nekoliko tisuća stupnjeva Celzijusa) i tlakove (do nekoliko stotina atmosfera) u tekućini koja okružuje kavitacijske mjehuriće. Ovi ekstremni uvjeti pridonose razgradnji polimera hitina i naknadnoj deacetilaciji.
 

SEM slike hitina i hitozana iz dviju vrsta gljiva: a) hitin iz L. vellereus; b) Hitin iz P. ribis; c) kitozan iz L.vellereus; d) hitozan iz P. ribis.
slika i studija: © Erdoğan et al., 2017

Ultrazvučna depolimerizacija hitina

Depolimerizacija hitina događa se kombiniranim učincima mehaničkih sila, poput mikrostrujanja i mlaznice tekućine, kao i ultrazvučno iniciranih kemijskih reakcija izazvanih slobodnim radikalima i drugim reaktivnim vrstama nastalim tijekom kavitacije. Valovi visokog tlaka koji nastaju tijekom kavitacije uzrokuju smično naprezanje hitinskih lanaca, što rezultira cijepanjem polimera na manje fragmente.

Ultrazvučna deacetilacija hitina

Osim depolimerizacije, intenzivna ultrazvučna obrada također potiče deacetilaciju hitina. Deacetilacija uključuje uklanjanje acetilnih skupina iz molekule hitina, što dovodi do stvaranja hitozana. Intenzivna ultrazvučna energija, osobito visoke temperature i pritisci koji nastaju tijekom kavitacije, ubrzavaju reakciju deacetilacije. Reaktivni uvjeti stvoreni kavitacijom pomažu prekinuti acetilne veze u hitinu, što rezultira otpuštanjem octene kiseline i pretvaranjem hitina u hitozan.
Sveukupno, intenzivna ultrazvučna obrada poboljšava procese depolimerizacije i deacetilacije osiguravajući potrebnu mehaničku i kemijsku energiju za razgradnju polimera hitina i olakšavanje pretvorbe u hitozan. Ova tehnika nudi brzu i učinkovitu metodu za proizvodnju kitozana iz hitina, s brojnim primjenama u raznim industrijama, uključujući farmaceutsku, poljoprivrednu i biomedicinsku tehniku.

Industrijska proizvodnja kitozana iz gljiva s moćnim ultrazvukom

Komercijalna proizvodnja hitina i hitozana uglavnom se temelji na otpadu pomorske industrije (tj. ribolov, izlov školjaka itd.). Različiti izvori sirovina rezultiraju različitim kvalitetama hitina i hitozana, što je rezultat oscilacija u proizvodnji i kvaliteti zbog sezonskih varijacija ribolova. Nadalje, kitozan dobiven iz gljivičnih izvora nudi navodno vrhunska svojstva kao što su homogena duljina polimera i veća topljivost u usporedbi s kitozanom iz morskih izvora. (usp. Ghormade et al., 2017.) Kako bi se osigurao ujednačen hitozan, ekstrakcija hitina iz gljivičnih vrsta postala je stabilna alternativna proizvodnja. Proizvodnja hitina i citiozana iz gljiva može se lako i pouzdano postići uporabom tehnologije ultrazvučne ekstrakcije i deacetilacije. Intenzivna sonikacija remeti stanične strukture kako bi se oslobodio hitin i pospješuje prijenos mase u vodenim otapalima za vrhunske prinose hitina i učinkovitost ekstrakcije. Naknadna ultrazvučna deacetilacija pretvara hitin u dragocjeni hitozan. I ultrazvučna ekstrakcija hitina i deacetilacija u hitozan mogu se linearno skalirati na bilo koju komercijalnu razinu proizvodnje.

Sonikacija intenzivira proizvodnju gljivičnog kitozana i čini proizvodnju učinkovitijom i ekonomičnijom.
(slika i studija: © Zhu et al., 2019.)

Rezultati istraživanja za ultrazvučnu deacetilaciju hitina i hitozana

Zhu i sur. (2018.) u svojoj studiji zaključuju da se ultrazvučna deacetilacija pokazala ključnim otkrićem, pretvarajući β-hitin u kitozan s 83-94% deacetilacije pri smanjenim temperaturama reakcije. Slika lijevo prikazuje SEM sliku ultrazvučno deacetiliranog kitozana (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (slika i studija: © Zhu et al., 2018.)
U njihovom protokolu, otopina NaOH (20 w/v %) pripremljena je otapanjem pahuljica NaOH u DI vodi. Alkalna otopina je zatim dodana GLSP sedimentu (0,5 g) u omjeru kruto-tekuće od 1:20 (g: mL) u epruvetu za centrifugu. Hitozan je dodan NaCl (40 mL, 0,2 M) i octenoj kiselini (0,1 M) u omjeru volumena otopine 1:1. Suspenzija je zatim podvrgnuta ultrazvuku na blagoj temperaturi od 25°C tijekom 60 minuta pomoću ultrazvučnog uređaja tipa sonde (250 W, 20 kHz). (usp. Zhu i dr., 2018.)
 
Pandit i sur. (2021.) otkrili su da na brzinu razgradnje otopina kitozana rijetko utječu koncentracije kiseline koja se koristi za solubilizaciju polimera i uvelike ovisi o temperaturi, intenzitetu ultrazvučnih valova i ionskoj jakosti medija koji se koristi za otapanje polimera. (usp. Pandit i sur., 2021.)
 
U drugoj studiji, Zhu i sur. (2019) koristili su prah spora Ganoderme lucidum kao gljivičnu sirovinu i istraživali ultrazvučno potpomognutu deacetilaciju i učinke parametara obrade kao što su vrijeme sonikacije, omjer kruto-tekuće, koncentracija NaOH i snaga zračenja na stupanj deacetilacije (DD) hitozana. Najveća vrijednost DD dobivena je pri sljedećim ultrazvučnim parametrima: 20 min sonikacije na 80 W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Površinska morfologija, kemijske skupine, toplinska stabilnost i kristalnost ultrazvučno dobivenog kitozana ispitani su pomoću SEM, FTIR, TG i XRD. Istraživački tim izvješćuje o značajnom povećanju stupnja deacetilacije (DD), dinamičke viskoznosti ([η]) i molekularne težine (Mv¯) ultrazvučno proizvedenog kitozana. Rezultati su naglasili tehniku ultrazvučne deacetilacije gljiva kao vrlo moćnu proizvodnu metodu za kitozan, koja je prikladna za biomedicinske primjene. (usp. Zhu i sur., 2019.)

Vrhunska kvaliteta kitozana s ultrazvučnom depolimerizacijom i deacetilacijom

Ultrazvučno vođeni procesi ekstrakcije i depolimerizacije hitina / hitozana mogu se precizno kontrolirati, a parametri ultrazvučnog procesa mogu se prilagoditi sirovinama i ciljanoj kvaliteti krajnjeg proizvoda (npr. molekularna težina, stupanj deacetilacije). To omogućuje prilagodbu ultrazvučnog procesa vanjskim čimbenicima i postavljanje optimalnih parametara za vrhunski ishod i učinkovitost.
Ultrazvučno deacetilirani kitozan pokazuje izvrsnu bioraspoloživost i biokompatibilnost. Kada se ultrazvučno pripremljeni kitozanski biopolimeri usporede s termički dobivenim kitozanom u pogledu biomedicinskih svojstava, ultrazvučno proizvedeni kitozan pokazuje značajno poboljšanu vitalnost fibroblasta (L929 stanica) i pojačanu antibakterijsku aktivnost za Escherichia coli (E. coli) i Staphylococcus aureus (S. aureus).
(usp. Zhu i sur., 2018.)
 

Slike skenirajuće elektronske mikroskopije (SEM) u povećanju od 100× a) gladijusa, b) gladijusa tretiranog ultrazvukom, c) β-hitina, d) β-hitina tretiranog ultrazvukom i e) hitozana (izvor: Preto et al. 2017.)

Visokoučinkovita ultrazvučna oprema za obradu hitina i hitozana

Fragmentacija hitina i decetilacija hitina u hitozan zahtijeva moćnu i pouzdanu ultrazvučnu opremu koja može isporučiti visoke amplitude, nudi preciznu kontrolu parametara procesa i može raditi 24/7 pod velikim opterećenjem i u zahtjevnim okruženjima. Asortiman proizvoda Hielscher Ultrasonics pouzdano ispunjava ove zahtjeve. Osim izvanrednih ultrazvučnih performansi, Hielscher ultrasonicators ima visoku energetsku učinkovitost, što je značajna ekonomska prednost – osobito kada se zapošljava u komercijalnoj velikoj proizvodnji.
Hielscher ultrasonicators su sustavi visokih performansi koji se mogu opremiti priborom kao što su sonotrode, pojačivači, reaktori ili protočne ćelije kako bi se na optimalan način uskladili s vašim potrebama procesa. S digitalnim zaslonom u boji, opcijom unaprijed postavljenih pokreta sonikacije, automatskim snimanjem podataka na integriranu SD karticu, daljinskom kontrolom preglednika i mnogim drugim značajkama, Hielscher ultrasonicators osiguravaju najvišu kontrolu procesa i lakoću korištenja. U kombinaciji s robusnošću i velikom nosivošću, Hielscher ultrazvučni sustavi vaš su pouzdani radni konj u proizvodnji. Fragmentacija i deacetilacija hitina zahtijeva snažan ultrazvuk kako bi se dobila ciljana pretvorba i konačni proizvod visoke kvalitete od kitozana. Visoke amplitude i povišeni pritisci su presudni posebno za fragmentaciju hitinskih pahuljica i korake depolimerizacije/deacetilacije. Industrijski ultrazvučni procesori Hielscher Ultrasonics lako daju vrlo visoke amplitude. Amplitude do 200 µm mogu se neprekidno izvoditi u radu 24/7. Za još veće amplitude dostupne su prilagođene ultrazvučne sonotrode. Kapacitet snage Hielscher ultrazvučnih sustava omogućuje učinkovitu i brzu depolimerizaciju i deacetilaciju u sigurnom i korisniku jednostavnom procesu.
 

Sinergistički tretman hitinom poboljšan ultrazvučnom obradom

Kako bi se prevladali nedostaci (tj. niska učinkovitost, visoki troškovi energije, dugo vrijeme obrade, toksična otapala) tradicionalne kemijske i enzimske deacetizacije hitina, ultrazvuk visokog intenziteta integriran je u obradu hitina i hitozana. Ultrazvuk visokog intenziteta i rezultirajući učinci akustične kavitacije dovode do brzog cijepanja polimernih lanaca i smanjuju polidisperznost, čime se potiče sinteza kitozana. Nadalje, ultrazvučne sile smicanja intenziviraju prijenos mase u otopini tako da se pojačavaju kemijske, hidrolitičke ili enzimske reakcije. Ultrazvučni tretman hitinom može se kombinirati s već postojećim tehnikama obrade hitina kao što su kemijske metode, hidroliza ili enzimski postupci.

Ultrazvučno potpomognuta kemijska deacetilacija i depolimerizacija

Budući da je hitin nereaktivan i netopljiv biopolimer, mora proći procesne korake demineralizacije, deproteinizacije i depolimerizacije/deacetilacije kako bi se dobio topiv i biodostupan kitozan. Ovi procesni koraci uključuju tretmane jakim kiselinama kao što je HCl i jakim bazama kao što su NaOH i KOH. Kako su ovi konvencionalni procesni koraci neučinkoviti, spori i zahtijevaju visoke energije, intenziviranje procesa ultrazvukom značajno poboljšava proizvodnju kitozana. Primjena power-ultrazvuka povećava prinose i kvalitetu kitozana, skraćuje proces s nekoliko dana na nekoliko sati, omogućuje blaža otapala i čini cijeli proces energetski učinkovitijim.

Ultrazvučno poboljšana deproteinizacija hitina

Vallejo-Dominguez i sur. (2021) su u svom istraživanju deproteinizacije hitina otkrili da je “primjena ultrazvuka za proizvodnju biopolimera smanjila je sadržaj proteina kao i veličinu čestica hitina. Pomoću ultrazvuka proizveden je hitozan visokog stupnja deacetilacije i srednje molekularne težine.”

Ultrazvučna hidroliza za depolimerizaciju hitina

Za kemijsku hidrolizu, kiseline ili lužine se koriste za deacetilaciju hitina, međutim alkalna deacetilacija (npr. natrijev hidroksid NaOH) se više koristi. Kisela hidroliza alternativna je metoda tradicionalnoj kemijskoj deacetilaciji, gdje se otopine organskih kiselina koriste za depolimerizaciju hitina i hitozana. Metoda kiselinske hidrolize uglavnom se koristi kada molekulska masa hitina i hitozana mora biti homogena. Ovaj konvencionalni proces hidrolize poznat je kao spor, energetski i troškovno intenzivan. Potreba za jakim kiselinama, visokim temperaturama i pritiscima faktori su koji proces hidrolize kitozana pretvaraju u vrlo skup i dugotrajan postupak. Korištene kiseline zahtijevaju nizvodne procese kao što su neutralizacija i odsoljavanje.
Uz integraciju ultrazvuka velike snage u proces hidrolize, zahtjevi za temperaturu i tlak za hidrolitičko cijepanje hitina i hitozana mogu se značajno smanjiti. Nadalje, sonikacija omogućuje niže koncentracije kiseline ili korištenje blažih kiselina. To proces čini održivijim, učinkovitijim, isplativijim i ekološki prihvatljivijim.

Ultrazvučno potpomognuta kemijska deacetilacija

Kemijska dezintegracija i deakteilacija hitina i hitozana uglavnom se postiže tretiranjem hitina ili hitozana mineralnim kiselinama (npr. klorovodična kiselina HCl), natrijevim nitritom (NaNO₂), ili vodikov peroksid (H₂O₂). Ultrazvuk poboljšava brzinu deacetilacije čime se skraćuje vrijeme reakcije potrebno za postizanje ciljanog stupnja deacetilacije. To znači da sonikacija smanjuje potrebno vrijeme obrade od 12-24 sata na nekoliko sati. Nadalje, sonikacija omogućuje znatno niže kemijske koncentracije, na primjer 40% (w/w) natrijevog hidroksida korištenjem sonikacije dok je 65% (w/w) potrebno bez upotrebe ultrazvuka.

Ultrazvučno-enzimska deacetilacija

Dok je enzimatska deacetilacija blag, ekološki prihvatljiv oblik obrade, njegova učinkovitost i troškovi su neekonomični. Zbog složene, radno intenzivne i skupe naknadne izolacije i pročišćavanja enzima iz krajnjeg proizvoda, enzimatska deacetilacija hitina nije implementirana u komercijalnu proizvodnju, već se koristi samo u znanstveno-istraživačkom laboratoriju.
Ultrazvučna prethodna obrada prije enzimske deacetlitacije fragmentira molekule hitina čime se povećava površina i čini više površine dostupnom za enzime. Ultrazvučna obrada visokih performansi pomaže poboljšati enzimsku deacetilaciju i čini proces ekonomičnijim.