הכנת ליפוזומים באמצעות אולטרסאונד

ליפוזומים המיוצרים באמצעות אולטרסאונד מציגים יעילות כליאה גבוהה מאוד, קיבולת העמסה גבוהה, גודל קטן ואחיד וצורה כדורית. הודות לכך, ליפוזומים אלה מציעים זמינות ביולוגית מצוינת. Hielscher Ultrasonics מציעה מכשירים אולטרסוניים לייצור אמין של ליפוזומים בדרגה פרמצבטית, בתהליך מנתי ובתהליך רציף.

יתרונות ייצור ליפוזומים באמצעות אולטרסאונד

כימוס אולטרסוני בליפוזומים הוא טכניקה המשמשת לכימוס תרופות או חומרים טיפוליים אחרים בתוך ליפוזומים באמצעות אנרגיה אולטרסונית. בהשוואה לשיטות אחרות לכימוס בליפוזומים, לכימוס אולטרסוני יש כמה יתרונות ההופכים אותו לטכניקת הייצור העדיפה.

• העמסה גבוהה, יעילות כליאה גבוהה: ייצור ליפוזומים באמצעות אולטרסאונד מוכר היטב כשיטה להפקת ליפוזומים בעלי העמסה גבוהה של מרכיבים פעילים, כגון ויטמין C, מולקולות של תרופות ועוד. בה בעת, שיטת הסוניקציה מציגה יעילות כליאה גבוהה. משמעות הדבר היא שאחוז גבוה מהחומר הפעיל מכומס באמצעות אולטרסאונד. לפיכך, אולטרסאונד הוא שיטה יעילה ביותר לייצור ליפוזומים.
• ליפוזומים בעלי גודל קטן ואחיד: אחד היתרונות של כימוס אולטרסוני בליפוזומים הוא היכולת לייצר ליפוזומים אחידים מאוד בעלי התפלגות גדלים צרה. ניתן להשתמש באנרגיה אולטרסונית כדי לפרק ליפוזומים גדולים יותר או צברי ליפידים לליפוזומים קטנים ואחידים יותר. הדבר מוביל לאחידות רבה יותר בגודל הליפוזומים ובצורתם, העשויה להיות חשובה ביישומים להובלת תרופות, שבהם גודל החלקיקים יכול להשפיע על הפרמקוקינטיקה והיעילות שלהם.
• מתאים לכל מולקולה: יתרון נוסף של כימוס אולטרסוני בליפוזומים הוא היכולת לכמס מגוון רחב של תרופות וחומרים טיפוליים אחרים. ניתן להשתמש בטכניקה כדי לכמס הן תרופות הידרופיליות והן תרופות הידרופוביות, דבר שעשוי להיות קשה לביצוע בשיטות אחרות. בנוסף, ניתן להשתמש באנרגיה אולטרסונית לכימוס מקרומולקולות וננו־חלקיקים, שעשויים להיות גדולים מכדי לכמסם בשיטות אחרות.
• מהיר ואמין: כימוס אולטרסוני בליפוזומים הוא גם תהליך פשוט ומהיר יחסית. הוא אינו דורש שימוש בכימיקלים אגרסיביים או בטמפרטורות גבוהות, העלולים להזיק לחומרים הטיפוליים העוברים כימוס.
• הגדלת קנה המידה: בנוסף, ניתן להגדיל בקלות את קנה המידה של הטכניקה לייצור בהיקף גדול, מה שהופך אותה לאפשרות כדאית מבחינה כלכלית ליישומים להובלת תרופות.

לסיכום, כימוס אולטרסוני בליפוזומים הוא טכניקה עדיפה לכימוס בליפוזומים בזכות היכולת לייצר ליפוזומים אחידים בעלי התפלגות גדלים צרה ולכמס מגוון רחב של חומרים טיפוליים, וכן בזכות פשטותה והאפשרות להגדיל את קנה המידה שלה.

לאחר יצירת שכבה דקה של ליפידים והידרציה חוזרת בהמשך, משתמשים בסוניקציה כדי לקדם את כליאת המרכיבים הפעילים בליפוזום. בנוסף, סוניקציה מאפשרת להשיג את גודל הליפוזום הרצוי.

הכנת ליפוזומים באמצעות אולטרסאונד לתרופות ולתכשירים קוסמטיים

ליפוזומים (שלפוחיות המבוססות על ליפידים), טרנספרוזומים (ליפוזומים בעלי יכולת גבוהה במיוחד לשינוי צורה), אתוזומים (שלפוחיות בעלות יכולת גבוהה במיוחד לשינוי צורה ותכולת אלכוהול גבוהה) וניוזומים (שלפוחיות סינתטיות) הם שלפוחיות מיקרוסקופיות שניתן להכין באופן מלאכותי כנשאים כדוריים שבתוכם ניתן לכמס מולקולות פעילות. שלפוחיות אלה, שקוטרן בין 25 ל־5000 nm, משמשות לעיתים קרובות כנשאי תרופות בתעשיות התרופות והקוסמטיקה, ביישומים כגון מתן תרופות דרך הפה או במריחה מקומית, טיפול גנטי וחיסון. שימוש באולטרסאונד הוא שיטה מוכחת מדעית לייצור יעיל ביותר של ליפוזומים. המכשירים האולטרסוניים של Hielscher מייצרים ליפוזומים בעלי העמסה גבוהה של מרכיבים פעילים וזמינות ביולוגית מעולה.

ליפוזומים ופורמולציה ליפוזומלית

ליפוזומים הם מערכות של שלפוחיות חד־למלריות, מעט־למלריות או רב־למלריות, והם מורכבים מאותו חומר שממנו עשויה ממברנת התא (דו־שכבה ליפידית). לפי הרכבם וגודלם, הליפוזומים מסווגים כך:

• שלפוחיות רב־למלריות (MLV, 0.1–10μm)
• שלפוחיות חד־למלריות קטנות (SUV, <100 nm)
• שלפוחיות חד־למלריות גדולות (LUV, 100–500 nm)
• שלפוחיות חד־למלריות ענקיות (GUV, ≥1 μm)

המבנה העיקרי של ליפוזומים מורכב מפוספוליפידים. לפוספוליפידים יש קבוצת ראש הידרופילית וקבוצת זנב הידרופובית, המורכבת משרשרת פחמימנית ארוכה.
הרכב ממברנת הליפוזום דומה מאוד להרכב מחסום העור, ולכן הליפוזומים יכולים להשתלב בקלות בעור האדם. כאשר הליפוזומים מתמזגים עם העור, הם יכולים לשחרר את החומרים הכלואים בהם ישירות אל היעד, שם החומרים הפעילים יכולים למלא את תפקידיהם. כך הליפוזומים משפרים את חדירות העור לחומרים התרופתיים והקוסמטיים הכלואים בהם. גם ליפוזומים ללא חומרים מכומסים, כלומר השלפוחיות הריקות, הם חומרים פעילים רבי־עוצמה לעור, שכן ״phosphatidylcholin״ מכיל שני מרכיבים חיוניים שגוף האדם אינו יכול לייצר בעצמו: חומצה לינולאית וכולין.
ליפוזומים משמשים כנשאים תואמים ביולוגית של תרופות, פפטידים, חלבונים, ״plasmic DNA״, אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס או ריבוזימים, למטרות תרופתיות, קוסמטיות וביוכימיות. הגמישות העצומה בגודל החלקיקים ובפרמטרים הפיזיקליים של הליפידים מציעה פוטנציאל אטרקטיבי ליצירת נשאים המותאמים במיוחד למגוון רחב של יישומים. (Ulrich 2002)

יצירת ליפוזומים באמצעות אולטרסאונד

ניתן ליצור ליפוזומים באמצעות אולטרסאונד. חומר הבסיס להכנת ליפוזומים הוא מולקולות ״amphilic״ שמקורן בליפידים של ממברנות ביולוגיות או שהן מבוססות עליהם. ליצירת שלפוחיות חד־למלריות קטנות (SUV), הפיזור הליפידי עובר סוניקציה עדינה – למשל באמצעות המכשיר האולטרסוני הידני UP50H (50W, 30kHz), ה־VialTweeter או הכור האולטרסוני CupHorn – באמבט קרח. משך טיפול אולטרסוני כזה הוא כ־5 – 15 דקות. שיטה נוספת לייצור שלפוחיות חד־למלריות קטנות היא סוניקציה של ליפוזומים בצורת שלפוחיות רב־למלריות.
Dinu-Pirvu ועמיתיו (2010) מדווחים על קבלת טרנספרוזומים באמצעות סוניקציה של MLV בטמפרטורת החדר.
Hielscher Ultrasonics מציעה מגוון מכשירים אולטרסוניים, סונוטרודות ואביזרים, ובכך יכולה לספק את המערך האולטרסוני המתאים ביותר לכימוס ליפוזומלי ביעילות גבוהה בכל קנה מידה.

כימוס אולטרסוני של חומרים פעילים בתוך ליפוזומים

ליפוזומים משמשים כנשאים לחומרים פעילים כגון ויטמינים, מולקולות טיפוליות, פפטידים וכו׳. אולטרסאונד הוא כלי יעיל להכנה וליצירה של ליפוזומים לכליאת חומרים פעילים. במקביל, סוניקציה מסייעת לתהליך הכימוס והכליאה, כך שנוצרים ליפוזומים בעלי תכולה גבוהה של חומרים פעילים. לפני הכימוס, הליפוזומים נוטים ליצור צברים עקב אינטראקציה בין מטענים על פני השטח של הראשים הקוטביים של הפוספוליפידים (ראו Míckova ועמיתיו 2008), ונוסף על כך יש לפתוח אותם. לדוגמה, Zhu ועמיתיו (2003) מתארים כימוס של אבקת ביוטין בליפוזומים באמצעות אולטרסאונד. עם הוספת אבקת הביוטין לתמיסת תרחיף השלפוחיות, התמיסה עברה סוניקציה. לאחר טיפול זה, הביוטין נכלא בליפוזומים.
קראו עוד על כימוס אולטרסוני של ״peptrides״ מסוג GLP-1 (למשל סמגלוטייד) בליפוזומים!

תחליבים ליפוזומליים באמצעות אולטרסאונד

כדי להגביר את ההשפעה המטפחת של קרמים ללחות או נגד הזדקנות, תחליבים, ג'לים ותכשירים קוסמצבטיים אחרים, מוסיפים חומרים מתחלבים לפיזורים הליפוזומליים כדי לייצב כמויות גדולות יותר של ליפידים. אולם מחקרים הראו כי יכולתם של ליפוזומים מוגבלת בדרך כלל. עם הוספת חומרים מתחלבים, השפעה זו תופיע מוקדם יותר, והחומרים המתחלבים הנוספים גורמים להחלשת הזיקה של פוספטידילכולין למחסום העור. ננו־חלקיקים – המורכבים מפוספטידילכולין ומליפידים – הם המענה לבעיה זו. ננו־חלקיקים אלה נוצרים מטיפת שמן המכוסה בשכבה יחידה של פוספטידילכולין. השימוש בננו־חלקיקים מאפשר ליצור תכשירים המסוגלים לקלוט יותר ליפידים ולהישאר יציבים, כך שאין צורך בחומרים מתחלבים נוספים.
סוניקציה היא שיטה מוכחת לייצור ננו־אמולסיות וננו־פיזורים. אולטרסאונד בעוצמה גבוהה מאוד מספק את ההספק הדרוש לפיזור פאזה נוזלית (הפאזה המפוזרת) בטיפות קטנות בתוך פאזה שנייה (הפאזה הרציפה). באזור הפיזור, בועות קוויטציה הקורסות פנימה גורמות לגלי הלם עזים בנוזל שסביבן ומביאות להיווצרות סילוני נוזל במהירות גבוהה. כדי לייצב את הטיפות החדשות של הפאזה המפוזרת ולמנוע את התמזגותן, מוסיפים לאמולסיה חומרים מתחלבים (חומרים פעילי שטח) וחומרים מייצבים. מכיוון שהתמזגות הטיפות לאחר פירוקן משפיעה על התפלגות גודל הטיפות הסופית, משתמשים בחומרים מתחלבים המייצבים ביעילות כדי לשמור על התפלגות גודל טיפות סופית השווה להתפלגות המתקבלת מיד לאחר פירוק הטיפות באזור הפיזור האולטרסוני.

פיזורים ליפוזומליים באמצעות סוניקציה

פיזורים ליפוזומליים המבוססים על "phosphatidylchlorine" בלתי רווי אינם יציבים דיים בפני חמצון. ניתן לייצב את הפיזור באמצעות נוגדי חמצון, כגון קומפלקס של ויטמינים C ו־E.
 

יצירת ליפוזומים בשיטת אידוי בפאזה הפוכה באמצעות סוניקציה

 
Ortan et al. (2002) השיגו תוצאות טובות במחקרם על הכנה אולטרסונית של שמן אתרי של Anethum graveolens בליפוזומים. לאחר סוניקציה, גודל הליפוזומים היה בטווח 70–150 nm, ובמקרה של MLV בטווח 230–475 nm; ערכים אלה נותרו קבועים בקירוב גם לאחר 2 חודשים, אך עלו לאחר 12 חודשים, במיוחד בפיזור SUV (ראו את ההיסטוגרמות להלן). מדידת היציבות, שהתייחסה לאובדן שמן אתרי ולהתפלגות הגדלים, הראתה גם כי הפיזורים הליפוזומליים שמרו על תכולת השמן הנדיף. ממצא זה מצביע על כך שכליאת השמן האתרי בליפוזומים הגבירה את יציבות השמן.

Ortan et al. (2009): יציבות פיזורי MLV ו־SUV לאחר 1 שנה. תכשירים ליפוזומליים אוחסנו ב־4±1 ºC.

המעבדים האולטרסוניים של Hielscher הם המכשירים האידיאליים ליישומים בתעשיית הקוסמטיקה והתרופות. מערכות המורכבות ממספר מעבדים אולטרסוניים בהספק של עד 16,000 ואט כל אחד מספקות את הקיבולת הדרושה להפיכת יישום מעבדתי זה לשיטת ייצור יעילה לקבלת אמולסיות מפוזרות דק בזרימה רציפה או באצווה – תוך השגת תוצאות המשתוות לאלה של ההומוגנייזרים בלחץ גבוה הטובים ביותר הזמינים כיום, כגון שסתומי נחיר. לצד יעילות גבוהה זו ביצירת אמולסיות באופן רציף, המכשירים האולטרסוניים של Hielscher דורשים תחזוקה מועטה מאוד וקלים מאוד לתפעול ולניקוי. האולטרסאונד אף מסייע בפועל לניקוי ולשטיפה. ההספק האולטרסוני ניתן לוויסות ולהתאמה למוצרים מסוימים ולדרישות יצירת האמולסיה. זמינים גם כורים מיוחדים בעלי תא זרימה העומדים בדרישות המתקדמות של CIP (ניקוי במקום) ושל SIP (עיקור במקום).

שאלות נפוצות על ליפוזומים

אילו סוגי ליפוזומים קיימים?

ליפוזומים מסווגים לסוגים שונים לפי גודלם ומספר הדו־שכבות שהם מכילים. קטגוריות אלה כוללות:

• שלפוחיות חד־למלריות קטנות (SUV): אלה הליפוזומים הקטנים ביותר, בעלי דו־שכבה ליפידית יחידה.
• שלפוחיות חד־למלריות גדולות (LUV): הן גדולות יותר משלפוחיות SUV, וגם להן דו־שכבה יחידה.
• שלפוחיות רב־למלריות (MLV): הן מכילות דו־שכבות קונצנטריות מרובות.
• שלפוחיות רב־שלפוחיתיות (MVV): הן מורכבות ממספר שלפוחיות קטנות יותר בתוך שלפוחית גדולה יותר.

 
סוגים ייעודיים נוספים כוללים:

• ליפוזומים מצומדי PEG: ליפוזומים שעברו שינוי באמצעות פוליאתילן גליקול (PEG) לשיפור היציבות ולהארכת זמן השהייה במחזור הדם.
• ננו־ליפוזומים: ליפוזומים קטנים מאוד, המשמשים בדרך כלל להובלה ממוקדת של תרופות.

אילו מבני שלפוחיות יכולים להיות לליפוזומים?

ליפוזומים מסווגים גם לפי מבנה השלפוחית שלהם לשבעה סוגים עיקריים:

• שלפוחיות רב־למלריות גדולות (MLV): מכילות דו־שכבות מרובות.
• שלפוחיות אוליגו־למלריות (OLV): בעלות מספר מועט של דו־שכבות.
• שלפוחיות חד־למלריות קטנות (SUV): הקטנות ביותר, בעלות דו־שכבה יחידה.
• שלפוחיות חד־למלריות בגודל בינוני (MUV): בגודל בינוני, בעלות דו־שכבה יחידה.
• שלפוחיות חד־למלריות גדולות (LUV): גדולות יותר, בעלות דו־שכבה יחידה.
• שלפוחיות חד־למלריות ענקיות (GUV): גדולות מאוד, בעלות דו־שכבה יחידה.
• שלפוחיות רב־שלפוחיתיות (MVV): מספר שלפוחיות בתוך שלפוחית גדולה יחידה.

מהם ההבדלים בין ליפוזומים לניוזומים?

ליפוזומים וניוזומים נבדלים בעיקר בהרכבם:
ליפוזומים: עשויים מפוספוליפידים בעלי שתי שרשראות, שיכולים להיות ניטרליים או טעונים.
ניוזומים: עשויים מחומרים פעילי שטח בלתי טעונים בעלי שרשרת יחידה ומכולסטרול.
שני המבנים נוצרים באמצעות סוניקציה, המעודדת את התארגנות השלפוחיות בעלות הדו־שכבה.

מהו הגודל האידיאלי של ליפוזום?

לצורך הובלת חומרים טיפוליים, הגודל האידיאלי של ליפוזום הוא, באופן תאורטי, קוטר שבין 50 ל־200 ננומטר. טווח גדלים זה ממטב את היציבות ואת הזמינות הביולוגית. סוניקציה משמשת בדרך כלל להקטנת השלפוחית לגודל הרצוי.

האם ליפוזומים יכולים לשאת תרופות הידרופיליות?

כן, ליפוזומים יכולים לשאת תרופות הידרופיליות. הם מוערכים ביישומים ביו־רפואיים בזכות יכולתם לכמס חומרים הידרופוביים והידרופיליים כאחד. בנוסף, הם מציעים תאימות ביולוגית גבוהה ויכולת התפרקות ביולוגית גבוהה, ההופכות אותם למערכות הובלה יעילות.

כיצד מכינים ליפוזומים?

השיטות הנפוצות ביותר להכנת ליפוזומים הן שיטת הסרט הדק ושיטת האידוי בפאזה הפוכה.
שיטת ההידרציה של סרט דק:

1. המיסו ליפידים בממס אורגני.
2. אדו את הממס ליצירת סרט ליפידי דק.
3. בצעו הידרציה של הסרט בתמיסה מימית באמצעות סוניקציה כדי ליצור שלפוחיות רב־למלריות.

שיטת האידוי בפאזה הפוכה:

1. המיסו ליפידים במים ובאתנול.
2. בצעו סוניקציה של התמיסה בטמפרטורה של 60°C במשך כ־10 דקות ליצירת משחה ליפידית.
3. קררו את התרחיף הליפידי והוסיפו מים או תמיסת בופר טיפה אחר טיפה תוך כדי ערבוב.
4. בצעו הידרציה של התרחיף במשך 1 שעה ליצירת שלפוחיות רב־למלריות.
5. הקטינו את גודל הליפוזומים באמצעות סוניקציה נוספת.

מהם ארכאוזומים?

ארכאוזומים הם ליפוזומים העשויים מליפידים של ארכאונים, הידועים ביציבותם ובעמידותם לתנאים קיצוניים. תכונות אלה הופכות את הארכאוזומים לשימושיים במיוחד להובלת תרופות ולפיתוח חיסונים בסביבות מאתגרות.

כיצד מכינים ארכאוזומים?

הליך סוניקציה לפי Pise (2022): ניתן להכין ארכאוזומים ממקטע הליפידים הקוטביים "PLF" של Sulfolobussolfataricus באמצעות סוניקציה ב-60°C ללא צורך בהשלמת ליפידים ממקור חיצוני. ב-0°C, ליפידים קוטביים מ-Sulfolobusacidocaldarius עברו סוניקציה יעילה ליצירת ארכאוזומים. ארכאוזומים טעונים ב-BMD וליפוזומים רגילים, וכן ליפידים של ארכאונים שבודדו מ-Archaea H. salinarum והועשרו בפוספטידילכולין, הוכנו באמצעות טכניקות סוניקציה. שלפוחיות שעברו סוניקציה נוצרו לצורך מתן מקומי באמצעות סוניקציה של פיזורי MLV באמפליטודה של 80 אחוז במשך 4 דקות באמצעות מכשיר סוניקציה מסוג גשושית Hielscher UP50H (ראו תמונה משמאל).

ספרות/מקורות

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.