הכנת ליפוזום קולי

ליפוזומים המיוצרים באולטרסאונד מראים יעילות לכידה גבוהה מאוד, יכולת העמסה גבוהה וגודל כדורי קטן באופן אחיד. לכן, ליפוזומים קוליים מציעים זמינות ביולוגית מעולה. Hielscher Ultrasonics מציעה ultrasonicators לייצור אמין של ליפוזומים כיתה פארמה במצב אצווה רציף.

היתרונות של ייצור ליפוזום קולי

אנקפסולציה של ליפוזומים על-קוליים היא טכניקה המשמשת לתמצת תרופות או חומרים טיפוליים אחרים בתוך ליפוזומים באמצעות אנרגיה על-קולית. בהשוואה לשיטות אחרות עבור אנקפסולציה ליפוזומים, אנקפסולציה קולית יש כמה יתרונות שהופכים אותו טכניקה הייצור מעולה.

• העמסה גבוהה, יעילות מלכודת גבוהה: ייצור ליפוזומים על-קוליים ידוע כמייצר ליפוזומים עם עומס גבוה של חומרים פעילים, כגון ויטמין C, מולקולות תרופות וכו'. יחד עם זאת, שיטת הסוניקציה מראה יעילות מלכודת גבוהה. משמעות הדבר היא כי אחוז גבוה של החומר הפעיל הוא עטוף על ידי ultrasonication. לסיכום, זה הופך את האולטרסוניקציה לשיטה יעילה ביותר לייצור ליפוזומים.
• ליפוזומים קטנים באופן אחיד: אחד היתרונות של אנקפסולציית ליפוזומים על-קולית הוא יכולתה לייצר ליפוזומים אחידים מאוד עם פיזור גודל צר. ניתן להשתמש באנרגיה על-קולית כדי לפרק ליפוזומים גדולים יותר או אגרגטים ליפידים לליפוזומים קטנים ואחידים יותר. זה מוביל לעקביות רבה יותר בגודל ובצורה של הליפוזומים, אשר יכול להיות חשוב עבור יישומי משלוח תרופות שבו גודל החלקיקים יכול להשפיע על הפרמקוקינטיקה שלהם ויעילות.
• ישים לכל מולקולה: יתרון נוסף של אנקפסולציה ליפוזומים קוליים הוא היכולת שלה לתמצת מגוון רחב של תרופות וסוכנים טיפוליים אחרים. הטכניקה יכולה לשמש כדי לתמצת הן תרופות הידרופיליות הידרופוביות, אשר יכול להיות קשה לעשות עם שיטות אחרות. בנוסף, ניתן להשתמש באנרגיה על-קולית כדי לתמצת מקרומולקולות וננו-חלקיקים, שעשויים להיות גדולים מכדי לתמצת אותם בשיטות אחרות.
• מהיר ואמין: אנקפסולציה קולית של ליפוזום היא גם תהליך פשוט ומהיר יחסית. זה לא דורש שימוש בכימיקלים קשים או טמפרטורות גבוהות, אשר יכול להיות מזיק לסוכנים הטיפוליים להיות עטוף.
• סקייל-אפ: בנוסף, ניתן להרחיב בקלות את הטכניקה לייצור בקנה מידה גדול, מה שהופך אותה לאפשרות חסכונית עבור יישומי משלוח תרופות.

לסיכום, אנקפסולציה של ליפוזומים על-קוליים היא טכניקה מעולה לאנקפסולציה של ליפוזומים בשל יכולתה לייצר ליפוזומים אחידים עם התפלגות גודל צרה, לתמצת מגוון רחב של חומרים טיפוליים, והפשטות והמדרגיות שלה.

לאחר היווצרות של סרט שומנים לאחר rehydration, סוניקציה משמש כדי לקדם את המלכודת של חומרים פעילים בליפוזום. בנוסף, סוניקציה משיגה את גודל הליפוזומים הרצוי.

הכנת ליפוזום קולי לתרופות וקוסמטיקה

ליפוזומים (בועיות על בסיס שומנים), טרנספרוזומים (ליפוזומים בעלי עיוות אולטרה), אתוזומים (שלפוחיות אולטרה-מעוותות עם תכולת אלכוהול גבוהה) וניוזומים (בועיות סינתטיות) הן שלפוחיות מיקרוסקופיות, שניתן להכין באופן מלאכותי כנשאיות כדוריות שאליהן ניתן לעטוף מולקולות פעילות. שלפוחיות אלה בקטרים שבין 25 ל -5000 ננומטר משמשות לעתים קרובות כנשאי תרופות בתעשיית התרופות והקוסמטיקה, כגון מתן תרופות דרך הפה או מקומי, ריפוי גנטי וחיסון. אולטרה-סוניקציה היא שיטה מוכחת מדעית לייצור ליפוזום יעיל ביותר. Hielscher ultrasonicators לייצר liposomes עם עומס גבוה של חומרים פעילים וזמינות ביולוגית מעולה.

ליפוזומים ונוסחה ליפוזומלית

ליפוזומים הם מערכות שלפוחית חד-למלריות, אוליגולאמלריות או מולטי-למלריות והן מורכבות מאותו חומר כמו קרום התא (דו-שכבתי שומנים). לגבי הרכבם וגודלם, ליפוזומים נבדלים כדלקמן:

• שלפוחיות רב-למלריות (MLV, 0.1-10μm)
• שלפוחיות חד-לאומיות קטנות (SUV, <100 ננומטר)
• שלפוחיות חד-למלריות גדולות (LUV, 100–500 ננומטר)
• שלפוחיות חד-למלריות ענקיות (GUV, ≥1 מיקרומטר)

המבנה העיקרי של ליפוזומים מורכב פוספוליפידים. לפוספוליפידים יש קבוצת ראש הידרופילית וקבוצת זנב הידרופובית, המורכבת משרשרת פחמימנים ארוכה.
לקרום הליפוזום יש הרכב דומה מאוד למחסום העור, כך שניתן לשלב אותם בקלות בעור האדם. כאשר הליפוזומים מתמזגים עם העור, הם יכולים לפרוק את הסוכנים הכלואים ישירות ליעד, שם הפעילים יכולים למלא את תפקידם. לפיכך, הליפוזומים יוצרים שיפור של חדירות העור / חדירות עבור תרופות וחומרים קוסמטיים לכודים. גם ליפוזומים ללא חומרים עטופים, השלפוחיות הפנויות, הן פעילות חזקות לעור, שכן הפוספטידילכולין משלב שני חיוניים, שהאורגניזם האנושי אינו יכול לייצר בעצמו: חומצה לינולאית וכולין.
ליפוזומים משמשים כנשאים תואמים ביולוגית של תרופות, פפטידים, חלבונים, DNA פלסמי, אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס או ריבוזימים, למטרות פרמצבטיות, קוסמטיות וביוכימיות. הרבגוניות העצומה בגודל החלקיקים ובפרמטרים הפיזיים של השומנים מעניקה פוטנציאל אטרקטיבי לבניית כלי רכב בהתאמה אישית למגוון רחב של יישומים. (אולריך 2002)

היווצרות ליפוזומים אולטראסוניים

ליפוזומים יכולים להיווצר על ידי שימוש באולטרסוניק. החומר הבסיסי להכנת ליפוזום הוא מולקולות אמפיליות הנגזרות או מבוססות על ליפידים ביולוגיים של הממברנה. עבור היווצרות שלפוחיות unilamellar קטן (SUV), פיזור השומנים הוא sonicated בעדינות – למשל עם המכשיר העל-קולי הידני UP50H (50W, 30kHz), ה-VialTweeter או הכור העל-קולי CupHorn – באמבט קרח. משך הטיפול האולטרסוני נמשך כ. 5 – 15 דקות. שיטה נוספת לייצור שלפוחיות חד-למלריות קטנות היא סוניקציה של שלפוחיות רב-למלריות ליפוזומים.
Dinu-Pirvu et al. (2010) מדווחים על השגת טרנספוזומים על ידי סוניקציה MLV בטמפרטורת החדר.
Hielscher Ultrasonics מציעה מכשירים קוליים שונים, sonotrodes ואביזרים ובכך יכול לספק את ההתקנה קולית המתאימה ביותר עבור אנקפסולציה ליפוזומים יעיל מאוד בכל קנה מידה.

אנקפסולציה על-קולית של חומרים פעילים לתוך ליפוזומים

ליפוזומים פועלים כנשאים של חומרים פעילים כגון ויטמינים, מולקולות טיפוליות, פפטידים וכו '. אולטרסאונד הוא כלי יעיל להכין וליצור ליפוזומים למלכודת של סוכנים פעילים. במקביל, סוניקציה מסייעת לתהליך האנקפסולציה והלכידה כך שמיוצרים ליפוזומים עם עומס גבוה של חומרים פעילים. לפני האנקפסולציה, הליפוזומים נוטים ליצור אשכולות עקב אינטראקציית מטען-מטען פני השטח של ראשי קוטב פוספוליפידים (cf. Míckova et al. 2008), יתר על כן יש לפתוח אותם. לדוגמה, Zhu et al. (2003) מתארים את האנקפסולציה של אבקת ביוטין בליפוזומים על ידי אולטרסוניקציה. כאשר אבקת הביוטין נוספה לתמיסת תרחיף השלפוחית, התמיסה עברה סוניקציה. לאחר טיפול זה, ביוטין נלכד בליפוזומים.

תחליבים ליפוזומליים עם אולטרסוניקציה

כדי לשפר את ההשפעה המזינה של קרמים, קרמים, ג'לים ותכשירים קוסמטיים אחרים המעניקים לחות או אנטי-אייג'ינג, מוסיפים מתחלב לפיזור הליפוזומלי כדי לייצב כמויות גבוהות יותר של שומנים. אבל מחקרים הראו כי היכולת של ליפוזומים היא בדרך כלל מוגבלת. עם תוספת של מתחלבים, השפעה זו תופיע מוקדם יותר והמתחלבים הנוספים גורמים להיחלשות בזיקה למחסום של פוספטידילכולין. ננו-חלקיקים – מורכב פוספטידילכולין ושומנים – הם התשובה לבעיה זו. ננו-חלקיקים אלה נוצרים על ידי טיפת שמן אשר מכוסה על ידי שכבה אחת של פוספטידילכולין. השימוש בננו-חלקיקים מאפשר פורמולציות המסוגלות לספוג יותר שומנים ולהישאר יציבות, כך שאין צורך בחומרים מתחלבים נוספים.
Ultrasonication היא שיטה מוכחת לייצור nanoemulsions ו nanodispersions. אולטרסאונד אינטנסיבי מאוד מספק את הכוח הדרוש לפיזור פאזה נוזלית (פאזה מפוזרת) בטיפות קטנות בשלב שני (פאזה רציפה). באזור הפיזור, בועות קוויטציה מתפוצצות גורמות לגלי הלם אינטנסיביים בנוזל שמסביב וגורמות להיווצרות סילוני נוזל במהירות נוזל גבוהה. על מנת לייצב את הטיפות החדשות שנוצרו בשלב הפיזור כנגד התמזגות, מוסיפים לאמולציה חומרים מתחלבים (חומרים פעילים על פני השטח, חומרים פעילי שטח) ומייצבים. מכיוון שהתלכדות הטיפות לאחר הפרעה משפיעה על התפלגות גודל הטיפות הסופית, משתמשים במתחלבים מייצבים ביעילות כדי לשמור על התפלגות גודל הטיפות הסופית ברמה השווה להתפלגות מיד לאחר הפרעה הטיפות באזור הפיזור העל-קולי.

פיזור ליפוזומלי באמצעות אולטרסוניקציה

פיזורים ליפוזומליים, המבוססים על פוספטידילכלורין בלתי רווי, חסרים יציבות מפני חמצון. ייצוב הפיזור יכול להיות מושג על ידי נוגדי חמצון, כגון על ידי קומפלקס של ויטמינים C ו- E.
 

היווצרות ליפוזום באמצעות שיטת אידוי פאזה הפוכה באמצעות סוניקציה

 
Ortan et al. (2002) השיגו במחקרם לגבי הכנה קולית של שמן אתרי Anethum graveolens בליפוזומים תוצאות טובות. לאחר סוניקציה, הממד של ליפוזומים היה בין 70-150 ננומטר, ועבור MLV בין 230-475 ננומטר; ערכים אלה היו קבועים בקירוב גם לאחר חודשיים, אך פסקו לאחר 12 חודשים, במיוחד בפיזור רכבי שטח (ראו היסטוגרמות בהמשך). מדידת היציבות, הנוגעת לאובדן שמן אתרי וחלוקת גודל, הראתה גם כי הפיזור הליפוזומלי שמר על תכולת השמן הנדיף. זה מצביע על כך שהלכידה של השמן האתרי בליפוזומים הגבירה את יציבות השמן.

Ortan et al. (2009): יציבות של פיזור MLV ו- SUV לאחר שנה. פורמולציות ליפוזומליות אוחסנו בטמפרטורה של 4±1 מעלות צלזיוס.

מעבדים קוליים Hielscher הם המכשירים האידיאליים עבור יישומים בתעשיית הקוסמטיקה והתרופות. מערכות המורכבות ממספר מעבדים על-קוליים של עד 16,000 וואט כל אחד, מספקות את הקיבולת הדרושה כדי לתרגם יישום מעבדה זה לשיטת ייצור יעילה להשגת תחליבים מפוזרים דק בזרימה רציפה או באצווה – השגת תוצאות דומות לאלה של הומוגנייזרים בלחץ גבוה הטובים ביותר הזמינים כיום, כגון שסתומי פתח. בנוסף ליעילות גבוהה זו בתחליב מתמשך, מכשירים קוליים Hielscher דורשים תחזוקה נמוכה מאוד והם קלים מאוד לתפעול ולניקוי. האולטרסאונד אכן תומך בניקוי ובשטיפה. הכוח הקולי מתכוונן וניתן להתאים אותו למוצרים מסוימים ולדרישות תחליב. כורי תאי זרימה מיוחדים העומדים בדרישות המתקדמות של CIP (ניקוי במקום) ו-SIP (עיקור במקום) זמינים גם כן.

שאלות נפוצות על ליפוזומים

אילו סוגי ליפוזומים נבדלים?

ליפוזומים מסווגים לסוגים שונים על פי גודלם ומספר הדו-שכבות שהם מכילים. קטגוריות אלה כוללות:

• שלפוחיות חד-לאומיות קטנות (SUV): אלה הם הליפוזומים הקטנים ביותר עם דו-שכבתי שומנים יחידים.
• שלפוחיות חד-לאומיות גדולות (LUV): אלה גדולים יותר מרכבי שטח, ויש להם גם דו-שכבתי יחיד.
• שלפוחיות מולטי-למלריות (MLV): אלה מכילים דו-שכבות קונצנטריות מרובות.
• שלפוחיות רב-שלפוחיתיות (MVV): אלה מורכבים ממספר שלפוחיות קטנות יותר בתוך שלפוחית גדולה יותר.

 
סוגים מיוחדים אחרים כוללים:

• ליפוזומים פגילטים: ליפוזומים שעברו שינוי עם פוליאתילן גליקול (PEG) לשיפור היציבות וזמן זרימת הדם.
• ננוליפוזומים: ליפוזומים קטנים מאוד, המשמשים בדרך כלל למשלוח תרופות ממוקד.

אילו מבני שלפוחית יכולים ליפוזומים להציג?

הליפוזומים מסווגים עוד יותר על פי מבנה השלפוחית שלהם לשבעה סוגים עיקריים:

• שלפוחיות גדולות מולטילמלריות (MLV): מכילים דו-שכבות מרובות.
• שלפוחיות אוליגולאמלריות (OLV): יש כמה bilayers.
• שלפוחיות חד-לאומיות קטנות (SUV): הקטן ביותר עם דו-שכבתי יחיד.
• בועיות Unilamellar בגודל בינוני (MUV): גודל בינוני עם דו-שכבתי יחיד.
• שלפוחיות חד-לאומיות גדולות (LUV): גדול יותר עם דו-שכבתי יחיד.
• שלפוחיות חד-לאומיות ענקיות (GUV): גדול מאוד עם דו-שכבתי יחיד.
• שלפוחיות רב-שלפוחיתיות (MVV): שלפוחיות מרובות בתוך שלפוחית אחת גדולה.

מהם ההבדלים בין ליפוזומים לניוזומים?

ליפוזומים וניוזומים נבדלים בעיקר בהרכבם:
ליפוזומים: עשוי פוספוליפידים בעלי שרשרת כפולה, אשר יכולים להיות ניטרליים או טעונים.
ניוזומים: מיוצר מחומרים פעילי שטח חד-שרשרת לא טעונים וכולסטרול.
שני המבנים נוצרים באמצעות סוניקציה, אשר מקדם את הרכבה של שלפוחיות דו שכבתיות.

מהו הגודל האידיאלי של ליפוזום?

עבור משלוח טיפולי, הגודל האידיאלי של ליפוזום הוא תיאורטית בין 50 ל 200 ננומטר קוטר. טווח גדלים זה ממטב את היציבות והזמינות הביולוגית. סוניקציה משמשת בדרך כלל כדי להקטין את השלפוחית לגודל הרצוי.

האם ליפוזומים יכולים לשאת תרופות הידרופיליות?

כן, ליפוזומים יכולים לשאת תרופות הידרופיליות. הם מוערכים ביישומים ביו-רפואיים בשל יכולתם לתמצת סוכנים הידרופוביים והידרופיליים כאחד. בנוסף, הם מציעים תאימות ביולוגית גבוהה ומתכלה, מה שהופך אותם למערכות אספקה יעילות.

איך להכין ליפוזומים?

הטכניקות הנפוצות ביותר להכנת ליפוזום הן שיטת הסרט הדק ושיטת אידוי השלב ההפוך.
שיטת הידרציה של סרט דק:

1. ממיסים שומנים בממס אורגני.
2. אידוי הממס ליצירת סרט שומנים דק.
3. לחות הסרט עם תמיסה מימית באמצעות סוניקציה על מנת ליצור שלפוחיות multilamellar.

שיטת אידוי שלב הפוך:

1. ממיסים שומנים במים ובאתנול.
2. יש לסחוט את התמיסה בטמפרטורה של 60°C למשך כ-10 דקות ליצירת משחת שומנים.
3. מצננים את תרחיף השומנים ומוסיפים מים או חיץ טיפה תוך כדי ערבוב.
4. לחות את ההשעיה במשך 1 שעה כדי ליצור שלפוחיות multilamellar.
5. הקטינו את גודל הליפוזומים באמצעות סוניקציה נוספת.

מהם ארכיאוזמים?

ארכיאוזומים הם ליפוזומים העשויים מליפידים ארכאיים, הידועים ביציבותם ובעמידותם לתנאים קיצוניים. תכונות אלה הופכות את הארכאוזומים לשימושיים במיוחד עבור אספקת תרופות ופיתוח חיסונים בסביבות מאתגרות.

כיצד מכינים ארכיאוזומים?

הליך סוניקציה על פי Pise (2022): ארכיאוזומים עשויים להיות עשויים מחלק השומנים הקוטבי “PLF” של Sulfolobussolfataricus על ידי סוניקציה ב-60°C ללא צורך בחידוש שומנים חיצוני. בטמפרטורה של 0°C, שומנים קוטביים מ-Sulfolobusacidocaldarius עברו סריקה יעילה ליצירת ארכיאוזומים. ארכיאוזומים טעוני BMD וליפוזומים קונבנציונליים, כמו גם ליפידים ארכאיים שבודדו מ-Archaea H. salinarum והועשרו בפוספטידילכולין, יוצרו בטכניקות סוניקציה. שלפוחיות סוניקציה נוצרו להעברה מקומית על ידי פיזור MLV באמפליטודה של 80 אחוז למשך 4 דקות באמצעות סוניק מסוג בדיקה Hielscher UP50H (ראה תמונה משמאל).

ספרות/מקורות