פורמולציה אולטרסונית של ניוזומים

ניוזומים הם שלפוחיות בגודל ננומטרי, שיכולות לשמש כנשאים לתרופות (למשל תרופות נגד סרטן) ולחומרים פעילים ביולוגית אחרים. תחלוב אולטרסוני הוא שיטה פשוטה ומהירה להכנת ניוזומים קטנים בעלי תכולת תרופה גבוהה.

שלפוחיות ניוזומליות כנשאים ננומטריים לחומרים פעילים

ניוזום הוא שלפוחית המבוססת על חומר פעיל שטח לא יוני, הנוצרת לרוב מחומר פעיל שטח לא יוני ומשילוב של כולסטרול כחומר עזר. ניוזומים עמידים יותר בפני פירוק כימי או חמצון, וניתן לאחסן אותם למשך זמן ממושך בהשוואה לליפוזומים. הודות לחומרים פעילי השטח המשמשים להכנת ניוזומים, הם מתכלים ביולוגית, תואמים ביולוגית ואינם מעוררים תגובה חיסונית. ניוזומים פעילים אוסמוטית, יציבים כימית ומאפשרים זמן אחסון ארוך יותר בהשוואה לליפוזומים. בהתאם לגודל ולמספר השכבות, קיימות שיטות הכנה שונות כגון סוניקציה, אידוי בפאזה הפוכה, הידרציה של שכבה דקה או תהליך קליטת תרופה באמצעות מפל pH חוצה ממברנה. הכנה אולטרסונית של ניוזומים היא הטכניקה המועדפת לייצור שלפוחיות חד־למלריות קטנות ואחידות בגודלן.

פורמולציה אולטרסונית של ניוזומים

להכנת פורמולציה של ניוזומים, יש להכין תחליב שמן במים (o/w) מתמיסה אורגנית של חומר פעיל שטח, כולסטרול ותמיסה מימית המכילה את התרכובת הפעילה ביולוגית, כלומר התרופה. תחלוב אולטרסוני הוא הטכניקה העדיפה לערבוב נוזלים שאינם מתערבבים זה בזה, כגון שמן ומים. באמצעות הפעלת כוחות גזירה על הטיפות של שתי הפאזות ופירוקן לגודל ננומטרי, מתקבל ננו־תחליב. לאחר מכן מאדים את הממס האורגני, וכך מתקבלים ניוזומים הטעונים בחומרים טיפוליים ומפוזרים בפאזה המימית. בהשוואה לבחישה מכנית, טכניקת הפורמולציה האולטרסונית של ניוזומים מצטיינת ביצירת ניוזומים בעלי גודל ממוצע קטן יותר ומדד פולידיספרסיות נמוך יותר, בתהליך מהיר. בדרך כלל עדיף להשתמש בשלפוחיות קטנות יותר, שכן הן נוטות לחמוק ממנגנוני הפינוי של הגוף טוב יותר מחלקיקים גדולים יותר, ונשארות בזרם הדם למשך זמן ארוך יותר. (ראו Bragagni et al. 2014)
קראו עוד על סוניקציה לשיפור פורמולציות של ניוזומים!

פרוטוקולים להכנה אולטרסונית של ניוזומים

פורמולציה של ניוזומים באמצעות סוניקציה נחקרה בהרחבה, ולכן קיימים פרוטוקולים רבים שאומתו מדעית לייצור אולטרסוני של ניוזומים.
להלן סקירה קצרה של כמה פרוטוקולי פורמולציה להכנת ניוזומים ולטעינתם באמצעות סוניקציה.

ניוזומים הטעונים בתמציות Withania somnifera
Chinembiri et al. (2017) הכינו פורמולציה של תמצית גולמית של Withania somnifera בתוך ניוזומים המיועדים לשימוש מקומי. התרכובות הפעילות ביולוגית כומסו באמצעות הזרקת ממס. לשם כך, הפאזות האורגנית והמימית עורבלו ברציפות באמצעות בוחש מגנטי, והטמפרטורה נשמרה על 60°C ± 2°C עד לסילוק הממס האורגני. הפורמולציה שהתקבלה קוררה ועברה סוניקציה על קרח באמצעות מכשיר הסוניקציה Hielscher UP200ST. לניוזומים היה גודל ממוצע של כ־165.9 ± 9.4, והם הראו יעילות כליאה גבוהה (EE%) של ויתנוליד A.

ניוזומים הטעונים בדוקסורוביצין
ניוזומים של N-פלמיטואיל גלוקוזאמין (Glu), הטעונים בדוקסורוביצין, תרופה נגד סרטן, הוכנו באמצעות ניעור תערובת של NPG (16 mg), Span 60 (65 mg), כולסטרול (58 mg) ו־Solulan C24 (54 mg) בתמיסת דוקסורוביצין (1.5 mg/ml, 2 ml, שהוכנה ב־PBS) בטמפרטורה של 90°C במשך 1 h, ולאחר מכן סוניקציה באמצעות גשוש במשך 10 min (75% מהמרב).
שלפוחיות של פלמיטואיל גליקול כיטוזן (GCP) הוכנו כמתואר קודם לכן (11), באמצעות סוניקציה בגשוש של גליקול כיטוזן (10 mg) וכולסטרול (4 mg) בתמיסת דוקסורוביצין (1.5 mg/ml). (Dufes et al. 2004)

שיטות חלופיות להכנת ניוזומים

שיטות חלופיות להכנת פורמולציות של ניוזומים, כגון טכניקת האידוי בפאזה הפוכה או תהליך קליטת תרופה באמצעות מפל pH חוצה ממברנה, כוללות הפעלת אנרגיה אולטרסונית. שתי הטכניקות משמשות בעיקר להכנת שלפוחיות רב־למלריות (MLVs). להלן תיאור קצר של שתי הטכניקות ושל שלב הסוניקציה הכלול בהן.

סוניקציה בהכנת ניוזומים באמצעות אידוי בפאזה הפוכה

בשיטת האידוי בפאזה הפוכה (REV), מרכיבי הפורמולציה הניוזומלית מומסים בתערובת של אתר וכלורופורם ומוספים לפאזה המימית, המכילה את התרופה. תחלוב אולטרסוני משמש להפיכת התערובת לתחליב בעל טיפות זעירות. לאחר מכן, הפאזה האורגנית מאודה. הניוזומים המתקבלים במהלך אידוי הממס האורגני הם שלפוחיות חד־למלריות גדולות.

תהליך קליטת תרופה באמצעות מפל pH חוצה ממברנה

בתהליך קליטת תרופה באמצעות מפל pH חוצה ממברנה (עם סביבה פנימית חומצית), הכולל העמסה מרחוק, חומר פעיל שטח וכולסטרול מומסים בכלורופורם. לאחר מכן הממס מאודה תחת ואקום לקבלת שכבה דקה על דופן הבקבוק בעל התחתית העגולה. השכבה עוברת הידרציה באמצעות חומצה ציטרית בריכוז 300 mM‏ (pH 4.0), תוך ערבול וורטקס של התרחיף. השלפוחיות הרב־למלריות מוקפאות ומופשרות שלוש פעמים ולאחר מכן עוברות סוניקציה באמצעות מכשיר אולטרסוני מסוג גשוש. לתרחיף הניוזומלי הזה מוסיפים תמיסה מימית המכילה תרופה בריכוז 10 mg/ml ומבצעים ערבול וורטקס. לאחר מכן מעלים את ה־pH של הדגימה ל־pH 7.0–7.2 באמצעות דיסודיום פוספט בריכוז 1M. לאחר מכן מחממים את התערובת ל־60°C למשך 10 דקות. טכניקה זו מניבה שלפוחיות רב־למלריות. (ראו Kazi et al. 2010)

הקטנת גודל ניוזומים באמצעות אולטרסאונד

ניוזומים נמצאים בדרך כלל בטווח הגדלים שבין 10nm ל־1000nm. בהתאם לטכניקת ההכנה, ניוזומים הם לעיתים קרובות גדולים יחסית ונוטים ליצור צברים. עם זאת, גדלים מסוימים של ניוזומים הם גורם חשוב בהתאמה לסוג מערכת ההובלה המיועד. לדוגמה, ניוזומים זעירים מאוד בטווח הננומטרי הם המתאימים ביותר להובלת תרופות מערכתית, שבה התרופה חייבת לעבור דרך ממברנות תאים כדי להגיע לאתר המטרה התאי, בעוד שניוזומים גדולים יותר מומלצים להובלת תרופות תוך־שרירית ולתוך חללי הגוף או ליישומים עיניים. הקטנת גודל ניוזומים באמצעות אולטרסאונד היא שלב נפוץ בהכנת ניוזומים בעלי עוצמת פעילות גבוהה. כוחות גזירה אולטרסוניים מפרקים צברים ומפזרים את הניוזומים לננו־ניוזומים אחידי גודל.

פרוטוקול – הקטנת גודל LipoNiosomes באמצעות אולטרסאונד

Naderinezhad et al. (2017) הכינו פורמולציה של LipoNiosomes בעלי תאימות ביולוגית (שילוב של ניוזום וליפוזום), המכילים Tween 60: כולסטרול: DPPC (ביחס 55 : 30 : 15 : 3) עם 3% DSPE-mPEG. כדי להקטין את גודלם של ה־LipoNiosomes שהוכנו, לאחר ההידרציה הם ביצעו סוניקציה של התרחיף במשך 45 דקות (15 שניות הפעלה ו־10 שניות הפסקה, אמפליטודה של 70% בהספק של 100 ואט), כדי למזער הצטברות חלקיקים, באמצעות הומוגנייזר אולטרסוני UP200St (Hielscher Ultrasonics GmbH, גרמניה). בשיטת מפל ה־pH, השכבות המיובשות של CUR, חומרים פעילי שטח וליפידים עברו הידרציה באמצעות 1300 mL של אמוניום סולפט (pH 1⁄4 4) בטמפרטורה של 63 C במשך 47 דקות. לאחר מכן, הננו־חלקיקים עברו סוניקציה מעל אמבט קרח ליצירת שלפוחיות קטנות.

מכשירים אולטרסוניים להכנת ניוזומים

ל-Hielscher Ultrasonics ניסיון רב שנים בתכנון, בייצור, בהפצה ובמתן שירות להומוגנייזרים אולטרסוניים בעלי ביצועים גבוהים לתעשיות התרופות, המזון והקוסמטיקה.
הכנת ניוזומים, ליפוזומים, ננו־חלקיקים ליפידיים מוצקים, ננו־חלקיקים פולימריים, קומפלקסים של ציקלודקסטרין ונשאי תרופות אחרים בעלי מבנה ננומטרי באיכות גבוהה היא תחום שבו מכשירי הסוניקציה של Hielscher מצטיינים בזכות אמינותם הגבוהה, הספק המוצא העקבי שלהם ואפשרות השליטה המדויקת בהם. המכשירים האולטרסוניים של Hielscher מאפשרים שליטה מדויקת בכל פרמטרי התהליך, כגון אמפליטודה, טמפרטורה, לחץ ואנרגיית סוניקציה. התוכנה החכמה מתעדת אוטומטית את כל פרמטרי הסוניקציה (זמן, תאריך, אמפליטודה, אנרגיה נטו, אנרגיה כוללת, טמפרטורה, לחץ) בכרטיס ה-SD המובנה.
עמידותם של מכשירי הסוניקציה של Hielscher מאפשרת הפעלה 24/7 בעומס כבד ובסביבות תובעניות.
הטבלה שלהלן מספקת אומדן של קיבולת העיבוד המשוערת של המכשירים האולטרסוניים שלנו: