פירוק תאי שמרים במיקרו-צלחות באמצעות סוניקציה בעוצמה גבוהה
מיקרוביולוגים וחוקרי מדעי החיים העוסקים ב- Saccharomyces cerevisiae, פיקיה פסטוריס / Komagataella phaffii, ומערכות שמרים אחרות מכירות את האתגר: תאי שמרים הם עמידים, פירוק תאים בר-שחזור עלול להיות מאתגר, ופירוק הדגימות באופן ידני הופך במהרה ל"צוואר בקבוק" כאשר יש לסנן זנים, שיבוטים, תנאי גידול או קונסטרוקטים לביטוי רבים.
פירוק שמרים בקצב גבוה לצורכי מיקרוביולוגיה, ביולוגיה מולקולרית וניתוח חלבונים
מכשירים לסוניקציה של מיקרו-פלטה מבית Hielscher, כגון ה-UIP400MTP (400 וואט) וה-UIP550MTP (550 וואט), מספקים פתרון בעל תפוקה גבוהה לפירוק מכני של תאי שמרים ישירות במיקרו-פלטה. במקום לעבד דגימות אחת אחת באמצעות בדיקה, ניתן לבצע סוניקציה של מיקרו-פלטה שלמה בתנאים אחידים. הדבר הופך את פירוק השמרים באמצעות אולטרה-סאונד למהיר יותר, בעל יכולת שחזור גבוהה יותר, וקל יותר לשילוב בתהליכי עבודה מודרניים במיקרוביולוגיה, ביטוי חלבונים, סינון אנזימים ותחומי האומיקה.
בין אם אתם צריכים לשחרר חלבונים רקומביננטיים מ-P. pastoris, להכין תמציות שמרים לבדיקות אנזימטיות, לפרק תאי S. cerevisiae לצורך ניתוח חלבונים, או לסנן עשרות שיבוטים של שמרים במקביל, מכשירי הסוניקציה למיקרו-פלטה של Hielscher מספקים פירוק תאים עוצמתי המבוסס על קוויטציה, עם בקרה מדויקת על התהליך.
יש צורך בליזה הניתנת לשחזור של שמרים לאפייה, אבא, רועה צאן, או זני שמרים אחרים במיקרו-צלחות? אנא ציינו את פורמט הצלחת, נפח הדגימה, צפיפות התאים והחומר הנבדק. אנו נעזור לכם לקבוע פרמטרים מתאימים לעיבוד קולי עבור תהליך העבודה שלכם עם מכשירי ה-UIP400MTP או ה-UIP550MTP.
מכשיר סוניקציה של Hielscher לצלחות רב-תאיות, המיועד לפירוק שמרים – הכנת דגימות בתפוקה גבוהה
מדוע תאי שמרים זקוקים לליזיס מכני יעיל
תאי שמרים קשים יותר לפירוק מאשר תאים חיידקיים או תאי יונקים רבים, מכיוון שהם מוגנים על ידי דופן תא קשיחה המורכבת בעיקר מפוליסכרידים, גלוקנים, מנופרוטאינים וחיטין. דופן תא זו מספקת יציבות מכנית, אך היא גם מגבילה את שחרורם של חלבונים תאיים, חומצות גרעין, מטבוליטים ואנזימים.
שיטות ליזיס קונבנציונליות של שמרים כוללות פירוק באמצעות חרוזים, עיכול אנזימטי, מחזורי הקפאה-הפשרה, ליזיס כימי וטיפול באולטרסאונד באמצעות בדיקה. שיטות אלו עשויות להיות יעילות, אך יש להן גם מגבלות. הכאה בחרוזים עלולה לגרום להיווצרות פסולת ולחימום, עיכול אנזימטי עלול להוסיף עלויות ושונות, ושימוש באולטרסאונד עם בדיקה לדגימה בודדת גוזל זמן רב כאשר יש לעבד מספר רב של דגימות.
קביטציה אולטראסונית ממוקדת ובעוצמה גבוהה מתגברת על מגבלות אלה באמצעות הפעלת כוחות גזירה מכניים עזים, תנודות לחץ ומיקרו-זרימה על תמיסת השמרים. התוצאה היא פירוק מהיר של דפנות התאים והקרומים, שחרור תאי משופר והכנת דגימות בעלת רמת שחזור גבוהה במתכונת של צלחות.
שימוש באולטרסאונד במיקרו-פלטה להכנת דגימות שמרים במקביל
ה-UIP400MTP וה-UIP550MTP של Hielscher תוכננו לביצוע סוניקציה אחידה של מיקרו-פלטה, צלחות רב-תאיות, צלחות PCR ומתקני דגימות מתאימים. בניגוד לסוניקציה באמצעות בדיקה, אין צורך לטפל בדגימות בנפרד. הצלחת כולה נחשפת לאנרגיה אולטראסונית מבוקרת, מה שהופך את תהליך העבודה למתאים במיוחד לעיבוד דגימות במקביל.
זה שימושי במיוחד עבור:
- ההקרנה שמרים לאפייה מוטנטים או זני ביטוי
- ליזיס של אבא, רועה צאן / K. phaffii שיבוטים לאחר ביטוי חלבון רקומביננטי
- הכנת תמציות שמרים לבדיקות אנזימטיות
- מיצוי חלבונים לצורך SDS-PAGE, Western blot, ELISA, LC-MS/MS או בדיקת פעילות
- שחרור מטבוליטים תאיים למטרות מטבולומיקה
- הכנת דגימות DNA ו-RNA לאחר תהליך טיהור מתאים בהמשך
- אופטימיזציה בתפוקה גבוהה של תמיסות ליזיס, תוספים ותנאי מיצוי
כיצד קוויטציה אולטראסונית משבשת את תאי השמרים
במהלך הטיפול באולטרסאונד, גלי קול ממוקדים בעלי עוצמה גבוהה יוצרים מחזורים מתחלפים של דחיסה ודילול בדגימה הנוזלית. בעוצמה מספקת, תנודות הלחץ הללו גורמות לקוויטציה אקוסטית. בועות קוויטציה נוצרות, מתנודדות וקורסות, ויוצרות כוחות גזירה מקומיים, מיקרו-סילונים, טורבולנציה וגרדיאנטים חזקים של לחץ.
בתמיסות שמרים, השפעות מכניות אלו מחלישות וקורעות את דופן התא ואת קרום התא. חלבונים תאיים, אנזימים, חומצות גרעין ומטבוליטים משתחררים לתוך תמיסת הליזיס. מכיוון שמדובר בתהליך מכני, ניתן להשתמש בו עם מערכות תמיסות רבות ושונות, וניתן לשלב אותו עם מעכבי פרוטאז, חומרים מחזרים, חומרי ניקוי, מלחים או טיפול מקדים אנזימטי מתון.
פרוטוקול כללי: פירוק תאי שמרים במיקרו-צלחות
הפרוטוקול הבא מספק נקודת התחלה מעשית לתהליך פירוק שמרים באמצעות מכשיר הסוניקציה למיקרו-פלטה Hielscher UIP400MTP או UIP550MTP. יש לבצע אופטימיזציה של הפרמטרים בהתאם לזן השמרים, לצפיפות התאים, למולקולה היעד, להרכב התמיסה המחסנית, לסוג הפלטה ולבדיקה הבאה בשרשרת.
1. איסוף ושטיפת תאי שמרים
יש לגדל זני שמרים כגון Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces או זן שמרים אחר בתנאי התרבית הרצויים. יש לקצור את התאים באמצעות צנטריפוגה ולהסיר את מצע התרבית. יש לשטוף את המשקע במים מזוקקים קרים, ב-PBS או במאגר ליזיס שנבחר, כדי להסיר רכיבי מצע שנותרו העלולים להפריע לניתוחים הבאים.
לצורך מיצוי חלבונים, יש לשמור על הדגימות בקירור ולעבוד במהירות. אם קיים חשש מפני פרוטאזות, יש לקרר מראש את כל התמיסות והחומרים המתכלים.
2. יש לערבב מחדש את משקע התאים
יש להמיס מחדש את משקע השמרים במאגר ליזיס קר מתאים. לשם שחרור יעיל של החלבון, צפיפות תאים גבוהה מהווה לרוב יתרון. כנקודת התחלה, יש להשתמש בכ-10–20% (משקל/נפח) ממשקע התאים הרטוב או בתמיסה צפופה המקבילה לערך OD600 > 10, בהתאם לבדיקה.
תמיסת ליזיס חלבונים שמרים טיפוסית עשויה להכיל:
- מערכת חיץ כגון Tris-HCl, חיץ פוספט או HEPES
- מלח כגון NaCl או KCl
- קוקטייל מעכב פרוטאז
- חומר מחזר אופציונלי, כגון DTT או β-מרקפטואתנול
- חומר ניקוי אופציונלי כגון Triton X-100, NP-40, SDS או CHAPS, בהתאם לתאימות בשלבים הבאים בתהליך
- מעכבי פוספטאז אופציונליים למחקרים בתחום הזרחון
במקרה של זני שמרים קשים או לצורך מיצוי חלבונים עדין במיוחד, ניתן לבצע טיפול מקדים קצר באמצעות Zymolyase, Lyticase או אנזים אחר המפרק את דופן התא, לפני הטיפול באולטרסאונד. טיפול מקדים אנזימטי זה הוא אופציונלי, אך עשוי לשפר את יעילות הפירוק או להפחית את עוצמת האולטרסאונד הנדרשת.
3. העברת הדגימות למיקרו-פלטה מתאימה
יש למזוג את תמיסת השמרים לתוך מיקרו-פלטה המתאימה לטיפול באולטרסאונד. לרוב מעדיפים להשתמש בפלטות בעלות תחתית עגולה, שכן הן משפרות את איסוף הדגימות ומצמצמות את האזורים המתים. יש להשתמש בנפחי דגימה שווים בכל הבארות כדי לשפר את השחזור.
אטמו את הצלחת באמצעות משטח איטום או יריעת איטום מתאימים, כדי למנוע אידוי, היווצרות תרסיס וזיהום צולב. ודאו שהאיטום מתאים לטמפרטורה ולתנאי האולטרסאונד שנבחרו.
נפחי העבודה האופייניים תלויים בפורמט הצלחת וביישום. הפורמטים הנפוצים כוללים צלחות עם 96 שקעים, צלחות עם שקעים עמוקים, צלחות PCR או מתקני צינורות מתאימים.
4. הגדרת קירור
פירוק שמרים מחייב עוצמת אולטראסאונד גבוהה, והשיבוש המכני יוצר חום. לפיכך, בקרת הטמפרטורה היא קריטית, במיוחד לצורך ניתוח חלבונים, אנזימים, RNA או זרחון.
יש להשתמש באסטרטגיית קירור מתאימה, כגון:
- תמיסת ליזיס מקוררת מראש
- מיקרו-צלחות מקוררות מראש
- הפסקות קירור בין מחזורי האולטרסאונד
- קירור חיצוני של פלטפורמת האולטרסאונד, במידת הצורך
המטרה היא לשמור על הדגימה קרה מספיק כדי למנוע דנטורציה של חלבונים, איון אנזימים, פירוק RNA ושינויים בדגימה הנגרמים מחום.
5. לעבד את תמיסת השמרים באמצעות אולטרסאונד
הכניסו את הצלחת האטומה למכשיר הסוניקציה למיקרו-צלחות Hielscher UIP400MTP או UIP550MTP ובחרו בתוכנית סוניקציה פועמת. מומלץ להשתמש בפעימות מכיוון שהן מאפשרות פירוק מכני בשלבים שבהם המכשיר פועל (ON) ופיזור חום בשלבים שבהם המכשיר כבוי (OFF).
כנקודת התחלה לתהליך פירוק תאי השמרים:
| פרמטר | טווח התחלה מומלץ | מטרה |
|---|---|---|
| משרעת | 60–100% | עוצמת קוויטציה גבוהה עבור תאי שמרים עמידים |
| מצב פולס | 10–30 שניות פועל / 30–60 שניות כבוי | פירוק יעיל עם הצטברות חום מבוקרת |
| זמן הפעולה המצטבר | חמש עד חמש עשרה דקות | יש להתאים בהתאם לזן, לצפיפות ולמולקולה היעד |
| טמפרטורה | יש לשמור את הדגימות בקירור | הגנה על חלבונים, אנזימים, RNA ומטבוליטים |
| איטום לוחות | מומלץ | מונע אידוי, היווצרות אירוסול וזיהום צולב |
במקרה של תמיסות שמרים עמידות במיוחד, ביומסה צפופה של P. pastoris או מיצוי קשה של חלבונים רקומביננטיים, יש להגדיל את זמן הפעולה המצטבר (ON-time) בהדרגה. עבור חלבונים רגישים לחום או בדיקות אנזימטיות, יש להשתמש בפולסים קצרים יותר, בהפסקות קירור ארוכות יותר ובמשרעת התחלתית נמוכה יותר.
פירוק שמרים בקצב גבוה בצלחות רב-תאים באמצעות מכשיר ה-UIP400MTP
6. לטהר את התסנין
לאחר הטיפול באולטרסאונד, יש לסובב את המיקרו-פלטה בצנטריפוגה או להעביר את הדגימות למבחנות לצורך צנטריפוגה. יש להסיר את שאריות התאים באמצעות צנטריפוגה במהירות ובטמפרטורה מתאימות. יש לאסוף את הנוזל העליון לצורך ניתוח בהמשך התהליך.
בהתאם ליישום, ניתן להשתמש בתוצר הפירוק למטרות הבאות:
- כימות חלבונים
- בדיקות פעילות אנזימטית
- SDS-PAGE ו-Western blotting
- ELISA ובדיקות אימונולוגיות
- פרוטאומיקה באמצעות LC-MS/MS
- ניתוח מטבוליטים
- טיהור DNA או RNA
7. לייעל ולתעד את השיטה
לצורך פירוק שמרים הניתן לשחזור, יש לתעד את כל הפרמטרים הרלוונטיים, לרבות הזן, תנאי הגידול וערך ה-OD600, מסת התא הרטובה, הרכב התמיסה המאזנת, סוג הצלחת, נפח הדגימה, משרעת, מחזור הדופק, זמן הפעולה המצטבר, שיטת הקירור וטמפרטורת הדגימה הסופית.
אם מכשיר הסוניקטור של Hielscher מצויד במערכת רישום נתונים אוטומטית, ניתן להשתמש בנתוני התהליך לצורכי תיעוד, פיתוח שיטות, הגדלת היקף הייצור ובקרת איכות.
טיפים לייעול תהליך פירוק השמרים
כדי להשיג שחרור מקסימלי של חלבונים, יש להשתמש בתמיסות שמרים צפופות, בעוצמת אולטרסאונד גבוהה ובזמן הפעלה מצטבר מספיק. עבור חלבונים רגישים, יש להפחית את המשרעת, להאריך את הפסקות הקירור ולשמור על הצלחת קרה לאורך כל התהליך.
אם הליזה אינה מלאה, יש להאריך את משך הטיפול באולטרסאונד בהדרגה, לבדוק טיפול מקדים אנזימטי, להפחית את צמיגות הדגימה או לייעל את התמיסה המאגר. אם החלבונים מתפרקים או מאבדים את פעילותם, יש לשפר את הקירור, לקצר את מרווחי ה-ON, להוסיף מעכבים, ולבדוק שהמערכת הדטרגנטית תואמת לחלבון היעד.
מכיוון שזני השמרים נבדלים זה מזה באופן משמעותי במבנה דופן התא, בשלב הצמיחה, במערכת הביטוי ובצפיפות הביומסה, מומלץ להשתמש במטריצת אופטימיזציה קצרה. לדוגמה, יש לבדוק שלושה ערכי משרעת, שני מחזורי פולסים ושני זמני הפעלה סה"כ, ולאחר מכן להעריך את יעילות הליזיס ואת שלמות החלבון.
בין אם אתם מעבדים מספר מצומצם של צלחות בדיקה ובין אם אתם מבצעים סינון שמרים בקצב גבוה, חברת Hielscher יכולה לסייע לכם בבחירת מכשיר הסוניקציה המתאים לצלחות מיקרו ובפיתוח פרוטוקול ליזיס אמין. צרו איתנו קשר ופרטו את זן השמרים, תהליך העבודה ודרישות התפוקה שלכם!
יתרונותיהם של מכשירי הסוניקציה למיקרו-פלטה של Hielscher לפירוק שמרים
מכשירים לסוניקציה של מיקרו-פלטה מתוצרת Hielscher הם אידיאליים למעבדות הזקוקות לתהליך ליזיס שניתן לשחזר על פני דגימות רבות. הם מבטלים את הטיפול האיטי בדגימה אחת בכל פעם, המאפיין את הסוניקציה באמצעות בדיקה, ומפחיתים את השונות הנגרמת ממיקום ידני של הבדיקה, מעומק הטבילה ומהבדלים בטיפול בין דגימה לדגימה.
היתרונות העיקריים כוללים:
- עיבוד בתפוקה גבוהה: יש לבצע טיפול באולטרסאונד על דגימות שמרים רבות במקביל במיקרו-צלחות או במתקני דגימות תואמים.
- תנאים הניתנים לשחזור: תנאי סוניקציה זהים בכל הבארות, כדי להשיג תוצאות ליזיס אחידות וניתנות להשוואה.
- אין זיהום צולב של הבדיקה: הדגימות נשארות אטומות במהלך הטיפול באולטרסאונד, דבר שמפחית את העברת החומרים בין הדגימות ומצמצם את שלבי הניקוי.
- מתאים לתאים עמידים: אולטרסאונד בעוצמה גבוהה תורם לפירוק דפנות התאים של השמרים.
- תהליך עבודה יעיל: אידיאלי לבדיקת זנים, שיבוטים, תנאי ביטוי ותמיסות ליזיס.
- תהליך עבודה יעיל: הגדרות הניתנות לתכנות, רישום נתונים אוטומטי ומתאים לאוטומציה במעבדה.
יישומים בתחום הביוטכנולוגיה של שמרים ובמחקר במדעי החיים
פירוק שמרים באמצעות אולטרסאונד במיקרו-צלחות תומך בתהליכי עבודה רבים בתחום המחקר והסינון. בביטוי חלבונים רקומביננטיים, ניתן לפרק שיבוטים של P. pastoris ו-S. cerevisiae במקביל, כדי להשוות רמות ביטוי או פעילות אנזימטית. בביולוגיה של מערכות ובמדעי האומיקה, פירוק סטנדרטי משפר את יכולת ההשוואה בין תנאים שונים. במיקרוביולוגיה, שימוש באולטרסאונד מאפשר הכנה מהירה של תמציות מפירוק (ליזטים) מזנים שונים, מתנאי גידול שונים או מטיפולי לחץ.
תחומי היישום האופייניים כוללים:
- מיצוי חלבון שמרים
- סינון חלבונים רקומביננטיים
- בדיקת פעילות אנזימים
- בחירת שיבוטים לאחר טרנספורמציה
- אופטימיזציה של התסיסה
- הכנת דגימות לפרוטאומיקה
- הכנת דגימות למטבולומיקה
- מחקרים בנושא פגיעה בדופן התא
- בדיקות מיקרוביולוגיות בעלות תפוקה גבוהה
תהליך פירוק שמרים אמין מתחיל בעיבוד קולי מבוקר
פירוק שמרים עלול להיות מאתגר כאשר מספר הדגימות גדל, אך מכשירי הסוניקציה למיקרו-פלטה של Hielscher הופכים את התהליך למהיר יותר, נקי יותר וניתן לשחזור במידה רבה יותר. הדגמים UIP400MTP ו-UIP550MTP מאפשרים לחוקרים לעבד צלחות שלמות בתנאים אולטראסוניים מוגדרים, ובכך לשפר את התפוקה תוך צמצום הטיפול הידני.
עבור מיקרוביולוגים, ביולוגים מולקולריים, חוקרי חלבונים ומעבדות ביוטכנולוגיה, שימוש באולטרסאונד על מיקרו-פלטה מהווה כלי יעיל לשחרור רכיבים תאיים של שמרים בצורה יעילה וניתנת לשחזור.
שאלות נפוצות בנושא פירוק תאי שמרים באמצעות סוניקציה במיקרו-פלטה
האם ניתן לפרק תאי שמרים באמצעות סוניקציה?
כן. תאי שמרים כגון Saccharomyces cerevisiae ו-Pichia pastoris ניתנים לפירוק באמצעות טיפול באולטרסאונד בעוצמה גבוהה. קוויטציה אולטרסונית מייצרת כוחות גזירה מכניים חזקים, המשבשים את דופן התא והקרום של תאי השמרים, ובכך משחררים חלבונים, אנזימים, חומצות גרעין ומטבוליטים.
מדוע קשה יותר לפרק תאי שמרים מאשר תאי חיידקים?
לתאי השמרים יש דופן תא עבה ועמידה מכנית, המורכבת בעיקר מגלוקנים, מנופרוטאינים וחיטין. מבנה נוקשה זה מקשה על פירוק תאי השמרים בהשוואה לתאים רבים של חיידקים או יונקים. לפיכך, פירוק תאי השמרים מצריך בדרך כלל עוצמה גבוהה יותר, תהליך ארוך יותר או טיפול מקדים אנזימטי אופציונלי.
אילו מכשירי סוניקציה של Hielscher מתאימים לפירוק שמרים במיקרו-פלטה?
ה-UIP400MTP וה-UIP550MTP של Hielscher מתאימים לפירוק שמרים בתפוקה גבוהה במיקרו-צלחות. ה-UIP400MTP אידיאלי להכנת דגימות מקבילות שגרתיות, בעוד ה-UIP550MTP מספק עוצמת אולטראסאונד גבוהה יותר למשימות פירוק תובעניות, לתמיסות צפופות ולזני שמרים עמידים.
האם ניתן לפרק את Pichia pastoris במכשיר סוניקציה למיקרו-פלטה?
כן. ניתן לפרק את Pichia pastoris, הידועה גם בשם Komagataella phaffii, באמצעות סוניקציה במיקרו-פלטה בעוצמה גבוהה. מאחר ש-P. pastoris יכולה ליצור ביומסה צפופה ובעלת דופן תא חזקה, מומלץ לבצע אופטימיזציה של המשרעת, מחזור הפולסים, הקירור ומשך הסוניקציה הכולל.
מהם הפרמטרים האופייניים לטיפול באולטרסאונד לצורך פירוק שמרים?
טווח התחלתי מומלץ הוא משרעת של 50–80%, פעולה פועמת כגון 10–30 שניות במצב "ON" ו-30–60 שניות במצב "OFF", וזמן מצטבר של 5–15 דקות במצב "ON". הפרמטרים המדויקים תלויים בזן השמרים, בצפיפות התאים, בנפח הדגימה, בסוג הצלחת, בתמיסת המחסום ובמולקולה היעד.
מדוע יש לבצע את פירוק השמרים במצב פולס?
מצב הפולסים מפחית את הצטברות החום במהלך הטיפול באולטרסאונד. בשלב ה-ON, הקוויטציה האולטרסונית מפרקת את התאים. בשלב ה-OFF, הדגימה יכולה להתקרר. הדבר חשוב משום שחום מוגזם עלול לגרום לדנטורציה של חלבונים, להפחית את פעילות האנזימים, לפגוע ב-RNA ולפגוע ביכולת השחזור.
האם נדרש טיפול מקדים אנזימטי לפני ביצוע סוניקציה של תאי שמרים?
טיפול מקדים אנזימטי אינו נדרש תמיד, אך הוא עשוי לשפר את יעילות הליזיס. אנזימים כגון Zymolyase או Lyticase מפרקים באופן חלקי את דופן תא השמרים ויכולים להפחית את עוצמת הקול האולטראסוני או את הזמן הדרוש לליזיס מלא. הדבר עשוי להיות שימושי עבור חלבונים רגישים או זנים קשים.
כיצד ניתן למנוע התחממות יתר במהלך טיפול באולטרסאונד בשמרים?
יש להשתמש במאגרים מקוררים מראש, במצב פולסים, בהפסקות קירור ובהתקנת צלחת מקוררת. יש לשמור על מיקרו-הצלחת אטומה ולעקוב אחר הטמפרטורה ככל האפשר. עבור חלבונים רגישים, יש להשתמש במרווחי הפעלה קצרים יותר, במרווחי כיבוי ארוכים יותר, ולעבד את הדגימות בתנאים קרים.
האם שימוש באולטרסאונד במיקרו-פלטה יכול להחליף את שיטת ה-bead beating לצורך פירוק תאי שמרים?
בתהליכי עבודה רבים, כן. שימוש באולטרסאונד במיקרו-פלטה יכול להחליף את שיטת ה-bead beating כאשר נדרשת ליזיס נקייה, ניתנת לשחזור ומקבילה. שיטה זו חוסכת את הצורך בטיפול בחרוזים, מפחיתה את המורכבות של החומרים המתכלים ומפשטת את האוטומציה. עם זאת, יש לאמת כל יישום באמצעות השוואת תפוקת הליזיס, שלמות החלבון וביצועי הבדיקה.
האם שימוש באולטרסאונד במיקרו-פלטה מתאים להפקת חלבונים משמרים?
כן. שימוש באולטרסאונד במיקרו-פלטה מתאים היטב להפקת חלבונים משמרים, במיוחד כאשר יש להשוות בין מספר רב של שיבוטים או תנאי גידול. מעכבי פרוטאז, תמיסות חיץ קרות והגדרות פולסים מבוקרות מסייעים לשמירה על איכות החלבונים.
האם ניתן להשתמש באותה השיטה להפקת DNA, RNA וחלבונים?
ניתן להשתמש באותו עיקרון בסיסי של סוניקציה, אך יש להתאים את התמיסה המגן ותנאי התהליך למולקולה המיועדת. תהליכי עבודה עם חלבונים מחייבים עיכוב פרוטאז ובקרת טמפרטורה. תהליכי עבודה עם RNA מחייבים טיפול נטול RNase וקירור אינטנסיבי. תהליכי עבודה עם DNA עשויים לדרוש תנאי ליזיס וטיהור שונים, בהתאם לשאלה האם נדרש DNA גנומי שלם או DNA מקוטע.
איזה סוג צלחת יש להשתמש בו לצורך פירוק שמרים?
יש להשתמש במיקרו-פלטה או בפלטה בעלת שקעים עמוקים המתאימה לטיפול באולטרסאונד, עם אטימה מתאימה. פלטות בעלות תחתית עגולה מועילות לעתים קרובות לטיפול בתמיסות. על הפלטה לעמוד בתנאי הטיפול באולטרסאונד שנבחרו, בטמפרטורת הדגימה ובשלבי הצנטריפוגה.
איך אוכל לדעת אם תהליך פירוק השמרים הושלם?
ניתן לבדוק את יעילות הליזיס באמצעות מיקרוסקופיה, תפוקת חלבון, פעילות אנזימטית, ירידה בצמיגות, ניתוח SDS-PAGE, תפוקת DNA/RNA או השוואה לשיטת ליזיס ידועה. לצורך פיתוח השיטה, יש להעריך הן את התפוקה והן את האיכות של מולקולת היעד ששוחררה.
UIP400MTP או UIP550MTP: באיזה מכשיר סוניקציה למיקרו-פלטה כדאי לבחור?
ה-UIP400MTP הוא מכשיר סוניקציה רב-עוצמה למיקרו-צלחות, המיועד להכנת דגימות שגרתית בתפוקה גבוהה, לרבות פירוק שמרים, מיצוי חלבונים, גזירת DNA, ניתוק ביופילם והכנת בדיקות. המכשיר מתאים למעבדות הזקוקות לסוניקציה בעלת תוצאות חוזרות בפורמטים סטנדרטיים של צלחות.
ה-UIP550MTP מספק עוצמת אולטרה-סאונד גבוהה יותר, והוא מומלץ כאשר יישומים תובעניים יותר מצריכים עוצמה אקוסטית חזקה יותר, זמני עיבוד קצרים יותר, עומסי דגימה גדולים יותר או תנאי פירוק חזקים יותר. לצורך פירוק שמרים, ה-UIP550MTP שימושי במיוחד עבור ביומסה צפופה, זנים קשים, נפחי עבודה גדולים יותר וסינון ביטוי בתפוקה גבוהה.
האם ניתן לבצע אוטומציה של פירוק שמרים באמצעות סוניקציה במיקרו-פלטה?
כן. טיפול באולטרסאונד באמצעות מיקרו-צלחות מתאים היטב לתהליכי עבודה אוטומטיים במעבדה, מכיוון שהדגימות נשארות במבנה של צלחות. הדבר מאפשר שילוב עם מערכות פיפטה, טיפול בצלחות, צנטריפוגה, הכנת בדיקות ותהליכי סינון בתפוקה גבוהה.
ספרות / מקורות
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics 2024.
