שיפור אנליזת HPLC באמצעות הכנת דגימות אמינה

כרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים (HPLC) נותרה אחת הטכניקות האנליטיות החשובות ביותר לזיהוי ולכימות של תרכובות במטריצות מורכבות. מבקרת איכות בתעשיית התרופות ועד לניטור סביבתי ולאנליזת מזון, שיטות HPLC מוערכות בזכות הרגישות, הסלקטיביות והשחזוריות שלהן. עם זאת, אמינות הנתונים הכרומטוגרפיים תלויה במידה רבה בשלב מכריע אחד: הכנת הדגימות ל-HPLC.
מחקרים ותהליכים שגרתיים להכנת דגימות מראים כי מיצוי והכנת דגימות בסיוע סוניקציה משפרים במידה ניכרת את היעילות, הנכונות והמהירות של אנליזת HPLC. באמצעות שימוש באנרגיה אולטרסונית לפירוק מטריצות ולהגברת מעבר האנליטים לממסים, מעבדות יכולות להשיג שיעורי השבה גבוהים יותר, זמני מיצוי קצרים יותר ותוצאות אנליטיות בעלות שחזוריות גבוהה יותר.

מדוע הכנת דגימות חשובה ב-HPLC

בתהליכי עבודה אנליטיים רבים, מטריצת הדגימה – כגון חומר צמחי, רקמה ביולוגית, קרקע או מים – מכילה תערובות מורכבות של תרכובות העלולות להפריע להפרדה הכרומטוגרפית. לפיכך נדרשת הכנת דגימות יעילה כדי לבודד אנליטים, להסיר חומרים מפריעים ולרכז את תרכובות המטרה לפני ההזרקה למערכת ה-HPLC.
טכניקות מיצוי מסורתיות כרוכות לעיתים קרובות בהליכים ממושכים, בנפחים גדולים של ממסים אורגניים ובשלבי ניקוי מרובים. שיטות אלה עלולות להכניס שונות, להגדיל את עלויות התפעול ולהאריך את משך האנליזה הכולל.
הכנת דגימות אולטרסונית מציעה חלופה יעילה. סוניקציה מחדירה אנרגיה אקוסטית בתדר גבוה לתווך נוזלי ויוצרת בועות קוויטציה מיקרוסקופיות. כאשר בועות אלה קורסות, הן יוצרות כוחות גזירה מקומיים והשפעות ערבול בקנה מידה מיקרוסקופי, המפרקים מטריצות מוצקות ומאיצים מעבר מסה. תהליך זה משפר באופן דרמטי את יעילות המיצוי.

מכשיר סוניקציה בתפוקה גבוהה UIP400MTP עם מעמד למבחנות עבור בקבוקוני דוגם אוטומטי

ראיות מדעיות: סוניקציה משפרת ביצועים אנליטיים

כמה מחקרים שעברו ביקורת עמיתים הדגימו את יתרונות המיצוי האולטרסוני בתהליכי עבודה של HPLC.
לדוגמה, שיטה שפותחה לניטור שאריות חומרי הדברה בדגימות מים השתמשה בסוניקציה בשילוב אנליזת LC–MS/MS לקביעת ריכוזי חומר ההדברה קרבריל. בגישה זו, דגימות מים מוצו באצטוניטריל תוך טיפול אולטרסוני לפני האנליזה הכרומטוגרפית. השיטה השיגה ביצועים אנליטיים גבוהים, ובהם שיעורי השבה בין 89.53% ל-101.72%, המאשרים את הנכונות והאמינות של הליך הכנת הדגימות האולטרסוני.
שלב המיצוי האולטרסוני אפשר העברה יעילה של אנליטים מהמטריצה המימית אל הממס האורגני, תוך הפחתת צריכת הממס וביטול הצורך בהליכי ניקוי נרחבים. השיטה האנליטית שעברה תיקוף הפגינה ליניאריות, דיוק וגבולות כימות מצוינים, והדגישה את יעילות הסוניקציה בתהליכי עבודה כרומטוגרפיים מודרניים. (cf. Roudani et al., 2018)
מחקר נוסף הציג פיזור מטריצה בפאזה מוצקה בסיוע אולטרסאונד (UA-MSPD) לקביעת תכולת אולאורופאין בעלי זית באמצעות אנליזת HPLC. בטכניקה זו עורבבו אבקה צמחית וחומר סופח ולאחר מכן נחשפו לגלים אולטרסוניים במהלך שלב האלוציה. האולטרסאונד הגביר את דסורפציית האנליטים מפני השטח של החומר הסופח, ובו בזמן שיפר את המיצוי ממטריצת הדגימה. (cf. Rashidipour and Heydari, 2018)

ההליך האולטרסוני שעבר אופטימיזציה הניב שיפורים אנליטיים משמעותיים, ובהם:

• עקומות כיול ליניאריות עם R² = 0.9979
• גבולות גילוי נמוכים עד כדי 0.03 µg mL⁻¹
• שיעורי השבה בין 90.2% ל-96.7%

תוצאות אלה מאשרות שמיצוי בסיוע אולטרסאונד לא רק מאיץ את הכנת הדגימות, אלא גם מגדיל את תפוקת המיצוי בהשוואה לטכניקות מסורתיות של פיזור מטריצה בפאזה מוצקה.

יתרונות מרכזיים של הכנת דגימות באולטרסאונד ל-HPLC

השימוש הגובר במיצוי באולטרסאונד במעבדות אנליטיות נובע מכמה יתרונות מדידים.

1. יעילות מיצוי גבוהה יותר
   קוויטציה אקוסטית מפרקת מטריצות מוצקות ומשפרת את חדירת הממס. כך משתפר שחרור האנליטים ועולים שיעורי ההשבה, במיוחד עבור תרכובות בריכוזי עקבות בדגימות מורכבות.
2. קיצור זמן הכנת הדגימות
   מיצוי באולטרסאונד יכול לעיתים קרובות להשלים את הכנת הדגימות בתוך שניות או דקות. לדוגמה, פרמטרים מיטביים של מיצוי באולטרסאונד ב-UA-MSPD אפשרו השבה יעילה של אנליטים בתוך כ-30 שניות של סוניקציה, והדגימו עד כמה ניתן להאיץ באופן דרמטי את תהליכי העבודה האנליטיים.
3. צריכת ממסים נמוכה יותר
   מכיוון שאולטרסאונד משפר את מעבר המסה, בדרך כלל נדרשים נפחים קטנים יותר של ממסים. הפחתת השימוש בממסים משפרת את הקיימות במעבדה ומפחיתה את עלויות התפעול.
4. הדירות משופרת
   פיזור אחיד של אנרגיית האולטרסאונד מבטיח פירוק ומיצוי עקביים של הדגימות בין חזרות, ומוביל לדיוק טוב יותר במדידות אנליטיות.
5. תאימות לשיטות כרומטוגרפיות מודרניות
   מיצוי באולטרסאונד משתלב בקלות עם מערכות HPLC, UHPLC ו-LC-MS, ולכן מתאים לסביבות אנליטיות בעלות תפוקה גבוהה.

כרומטוגרמת HPLC של תרכובות פנוליות מתמצית של עלי Annona muricata שבודדה באולטרסאונד באמצעות הסוניקטור UP400S.
(מחקר ותרשים: ©Nolasco-González et al., 2022)

חשיבות מדעית לכימיה אנליטית

ככל שהכימיה האנליטית מתקדמת לעבר שיטות עבודה מעבדתיות מהירות ובנות־קיימא יותר, הכנת דגימות באולטרסאונד הפכה לטכנולוגיה רבת־עוצמה המאפשרת התקדמות זו. סוניקציה תומכת בפיתוח שיטות אנליטיות מהירות עם צריכת ממסים נמוכה יותר, יעילות מיצוי משופרת ופרמטרי תיקוף איתנים.
הספרות המדעית ההולכת ומתרחבת בנושא מיצוי באולטרסאונד מראה שהכנת דגימות ל-HPLC בסיוע סוניקציה אינה רק אמצעי נוחות – זוהי גישה שעברה תיקוף מדעי ומשפרת את הביצועים האנליטיים. באמצעות שילוב מיצוי באולטרסאונד עם טכניקות כרומטוגרפיות מודרניות, מעבדות יכולות להשיג גילוי אמין של אנליטים בריכוזי עקבות במטריצות דגימה שמורכבותן הולכת וגדלה.

תהליכי עבודה של HPLC המשופרים באמצעות סוניקציה

עם ההתקדמות המתמשכת במכשור האנליטי ובטכנולוגיות להכנת דגימות, סביר שמיצוי באולטרסאונד ימלא תפקיד גדול אף יותר במעבדות כרומטוגרפיה. יכולתו לייעל תהליכי עבודה, לשפר את איכות הנתונים ולהפחית את ההשפעה הסביבתית תואמת היטב את הדרישות המתפתחות של המדע האנליטי המודרני.
עבור כימאים אנליטיים ומעבדות תעשייתיות המבקשים למטב את הכנת הדגימות ל-HPLC, מיצוי באולטרסאונד מציע פתרון מוכח, הניתן להרחבה לקני מידה שונים ובעל בסיס מדעי איתן. באמצעות שילוב סוניקציה בפרוטוקולים שגרתיים להכנת דגימות, מעבדות יכולות לשפר במידה ניכרת הן את היעילות והן את האמינות של האנליזה הכרומטוגרפית.

תכנון, ייצור וייעוץ – איכות תוצרת גרמניה

המכשירים האולטרסוניים של Hielscher מוכרים בזכות הסטנדרטים הגבוהים ביותר שלהם לאיכות ולתכנון. עמידות וקלות תפעול מאפשרות שילוב חלק של המכשירים האולטרסוניים שלנו במתקנים תעשייתיים. המכשירים האולטרסוניים של Hielscher מתמודדים בקלות עם תנאים קשים וסביבות תובעניות.

Hielscher Ultrasonics היא חברה בעלת הסמכת ISO, והיא שמה דגש מיוחד על מכשירים אולטרסוניים בעלי ביצועים גבוהים המשלבים טכנולוגיה מהמתקדמות ביותר וידידותיות למשתמש. כמובן, המכשירים האולטרסוניים של Hielscher תואמים לדרישות CE ועומדים בדרישות UL, CSA ו-RoHs.

ספרות / מקורות

• M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
• Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
• Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.