שיפור ניתוח HPLC באמצעות הכנת דגימות אמינה
כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) נותרה אחת הטכניקות האנליטיות החשובות ביותר לזיהוי וכמות של תרכובות במטריצות מורכבות. מבקרת איכות תרופות ועד ניטור סביבתי וניתוח מזון, שיטות HPLC מוערכות בזכות הרגישות, הסלקטיביות והשחזוריות שלהן. עם זאת, אמינות הנתונים הכרומטוגרפיים תלויה במידה רבה בשלב מכריע אחד: הכנת דגימות HPLC.
מחקרים ונהלי הכנת דגימות מראים כי מיצוי והכנת דגימות בסיוע אולטרסאונד משפרים באופן משמעותי את היעילות, הדיוק והמהירות של ניתוח HPLC. באמצעות שימוש באנרגיה אולטרסונית לפירוק המטריצות ולשיפור העברת החומר הנבדק לממסים, מעבדות יכולות להשיג שיעורי התאוששות גבוהים יותר, זמני מיצוי קצרים יותר ותוצאות אנליטיות בעלות רמת שחזור גבוהה יותר.
מדוע הכנת הדגימה חשובה ב-HPLC
בזרימות עבודה אנליטיות רבות, מטריצת הדגימה – כגון חומר צמחי, רקמה ביולוגית, אדמה או מים – מכיל תערובות מורכבות של תרכובות העלולות להפריע להפרדה כרומטוגרפית. לפיכך, נדרשת הכנה יעילה של הדגימה על מנת לבודד את החומרים הנבדקים, להסיר חומרים מפריעים ולרכז את התרכובות הרצויות לפני הזרקתן למערכת HPLC.
טכניקות מיצוי מסורתיות כרוכות לעתים קרובות בהליכים ממושכים, בכמויות גדולות של ממסים אורגניים ובשלבים מרובים של ניקוי. שיטות אלה עלולות לגרום לשונות, להגדיל את עלויות התפעול ולהאריך את משך הזמן הכולל של הניתוח.
הכנת דגימות באמצעות אולטרסאונד מציעה חלופה יעילה. תהליך הסוניקציה מכניס אנרגיה אקוסטית בתדר גבוה לתוך מדיום נוזלי, ויוצר בועות קוויטציה מיקרוסקופיות. כאשר בועות אלה מתפוצצות, הן מייצרות כוחות גזירה מקומיים ואפקטים של ערבוב מיקרוסקופי, המשבשים את המטריצות המוצקות ומאיצים את העברת המסה. תהליך זה משפר באופן דרמטי את יעילות החילוץ.
UIP400MTP סוניקטור בעל תפוקה גבוהה עם מתקן צינורות לבקבוקוני דוגם אוטומטי
ראיות מדעיות: סוניקציה משפרת את הביצועים האנליטיים
מספר מחקרים שנבדקו על ידי עמיתים הוכיחו את היתרונות של מיצוי קולי בתהליכי עבודה של HPLC.
לדוגמה, שיטה שפותחה לניטור שאריות חומרי הדברה בדגימות מים השתמשה באולטרסוניקה בשילוב עם ניתוח LC–MS/MS כדי לקבוע את ריכוזי חומר ההדברה קרבריל. בגישה זו, דגימות המים הופקו עם אצטוניטריל תחת טיפול אולטרסוני לפני ניתוח כרומטוגרפי. השיטה השיגה ביצועים אנליטיים חזקים, כולל התאוששות בין 89.53% ל-101.72%, מה שמאשר את הדיוק והאמינות של הליך הכנת הדגימות האולטרסוני.
שלב החילוץ הקולי איפשר העברה יעילה של חומרים נבדקים מהמטריצה המימית לממס האורגני, מה שהפחית את צריכת הממס וחיסל את הצורך בהליכי ניקוי נרחבים. השיטה האנליטית המאושרת הפגינה ליניאריות, דיוק וגבולות כימות מצוינים, והדגישה את היעילות של השימוש בקולי בזרמי עבודה כרומטוגרפיים מודרניים. (ראה Roudani et al., 2018)
מחקר אחר הציג פיזור שלב מוצק במטריצה בסיוע אולטרסאונד (UA-MSPD) לקביעת רמת האולאורופין בעלים של עץ הזית באמצעות ניתוח HPLC. בטכניקה זו, אבקת הצמח וחומר הסופח עורבבו ואז נחשפו לגלי אולטרסאונד בשלב השטיפה. האולטרסאונד שיפר את התנתקות החומר הנבדק ממשטח הסופח ובמקביל שיפר את החילוץ ממטריצת הדגימה. (ראו Rashidipour ו-Heydari, 2018)
ההליך האולטראסוני המותאם הביא לשיפורים אנליטיים משמעותיים, כולל:
- עקומות כיול ליניאריות עם R² = 0.9979
- גבולות זיהוי נמוכים עד 0.03 מיקרוגרם למ"ל
- שיעורי ההחלמה נעים בין 90.2% ל-96.7%
תוצאות אלה מאשרות כי מיצוי בסיוע אולטרסאונד לא רק מאיץ את הכנת הדגימה, אלא גם מגדיל את תפוקת המיצוי בהשוואה לטכניקות פיזור שלב מוצק מטריקס קלאסיות.
סוניק מסוג בדיקה UP200St להכנת דגימות HPLC
יתרונות מרכזיים של הכנת דגימות באמצעות אולטרסאונד עבור HPLC
השימוש הגובר בחילוץ קולי במעבדות אנליטיות נובע ממספר יתרונות מדידים.
- יעילות מיצוי גבוהה יותר
קביטציה אקוסטית מפרקת מטריצות מוצקות ומשפרת את חדירת הממס. הדבר משפר את שחרור החומר הנבדק ומגביר את קצב ההחזר, במיוחד עבור תרכובות ברמות זעירות בדגימות מורכבות. - זמן הכנת הדגימה קצר יותר
מיצוי קולי יכול לעתים קרובות להשלים את הכנת הדגימה בתוך שניות או דקות. לדוגמה, פרמטרים מיטביים של מיצוי קולי ב-UA-MSPD השיגו התאוששות יעילה של החומר הנבדק תוך כ-30 שניות של סוניקציה, מה שמדגים עד כמה ניתן להאיץ את תהליכי העבודה של הניתוח. - צריכת ממס נמוכה יותר
מכיוון שהאולטרסאונד משפר את העברת המסה, נדרשים בדרך כלל נפחי ממס קטנים יותר. הפחתת השימוש בממס משפרת את הקיימות במעבדה ומפחיתה את עלויות התפעול. - שיפור השחזור
חלוקת אנרגיית אולטרה-סאונד אחידה מבטיחה פירוק וחילוץ עקביים של הדגימות בכל השכפולים, מה שמוביל לדיוק רב יותר במדידות האנליטיות. - תאימות עם שיטות כרומטוגרפיות מודרניות
מיצוי קולי משתלב בקלות עם מערכות HPLC, UHPLC ו-LC-MS, מה שהופך אותו מתאים לסביבות אנליטיות בעלות תפוקה גבוהה.
כרומטוגרמה HPLC של תרכובות פנוליות מתמצית מבודדת באולטרה-סאונד של עלי אנונה מוריקטה באמצעות האולטרסוניקטור UP400S.
(מחקר וגרפיקה: ©Nolasco-González et al., 2022)
פתרונות סוניקציה מעשיים להכנת דגימות HPLC
למעבדות המשתמשות במיצוי קולי, מכשירי הסוניקציה של Hielscher מאפשרים שליטה מדויקת בפרמטרים כגון משרעת, זמן ומצב פולסים. לפיכך, מכשירי הסוניקציה למעבדות של Hielscher מתאימים במיוחד למעבדות אנליטיות.
בחר את הסוניקטור המתאים ביותר לדגימות HPLC שלך
| דגם סוניקטור | יתרונות עבור HPLC | השימוש הטוב ביותר בהכנת דגימות HPLC |
| VialTweeter Multi-Tube Sonicator |
• סוניקציה סימולטנית של עד 10 בקבוקונים אטומים עם אנרגיית אולטרה-סאונד זהה • סטרילי: אין זיהום צולב מכיוון שהדגימות נשארות סגורות • תנאי מיצוי בעלי רמת שחזור גבוהה בין אצוות • קוויטציה יעילה לדגימות אנליטיות בנפח קטן |
• הכנה בתפוקה גבוהה של דגימות סביבתיות, מזון או תרופות • מיצוי חומר נבדק לפני ניתוח HPLC, UHPLC או LC-MS • תהליכי עבודה סטנדרטיים הדורשים טיפול זהה במספר דגימות |
| סוניק Microplate UIP400MTP |
• סוניקציה ללא מגע של מיקרו-צלחות שלמות (בפורמטים של 96 ו-384 שקעים) • חלוקת אנרגיה אולטראסונית אחידה בכל הבארות • מאפשר אוטומציה ושילוב רובוטי עבור תהליכי עבודה אנליטיים • תפוקה גבוהה עם שליטה מדויקת על משרעת וזמן הסוניקציה |
• תהליכי סינון UHPLC בעלי תפוקה גבוהה • ספריות תרכובות תרופתיות והכנת דגימות למטבולומיקה • מיצוי מבוסס צלחת עבור צינורות אנליטיים LC-MS או UHPLC |
| סוניקטורים מעבדה עם קצה מיקרו (הפעלת קול ישירה) |
• עוצמת אולטרה-סאונד מרבית להפרעה יעילה במטריצה • מיצוי מהיר מאוד של חומרים נבדקים מדגימות מוצקות, צמיגות או הטרוגניות • פרמטרים מתכווננים של משרעת ודופק לתנאי מיצוי מיטביים • אנרגיית קוויטציה גבוהה משפרת את התאוששות החומר הנבדק ואת תפוקת החילוץ |
• מיצוי ממטריצות קשות כגון רקמות צמחיות, דגימות מזון או פולימרים • הומוגניזציה לפני SPE, סינון או מיצוי נוזל-נוזל • פיתוח שיטה להכנת דגימות HPLC באמצעות אולטרסאונד |
| קופהורן (“אמבטיה בעוצמה גבוהה” לכוסות מדידה ולמבחנות) |
• סוניקציה עקיפה מונעת זיהום של החללית • שדה אולטראסוני אחיד למספר צינורות בו-זמנית • אידיאלי לדגימות סטריליות, מסוכנות או נדיפות שחייבות להישאר אטומות • מפשט את הטיפול תוך שמירה על אנרגיית קוויטציה חזקה |
• מיצוי מקביל של מספר דגימות HPLC בצינורות צנטריפוגה אטומים • הכנת דגימות ביולוגיות, פרמצבטיות או סביבתיות • תהליכי עבודה בהם נדרשת סוניקציה עקיפה ללא זיהום |
רלוונטיות מדעית לכימיה אנליטית
עם התקדמות הכימיה האנליטית לעבר שיטות מעבדה מהירות וברות-קיימא יותר, הכנת דגימות באמצעות אולטרסאונד הפכה לטכנולוגיה מאפשרת עוצמתית. סוניקציה תומכת בפיתוח שיטות אנליטיות מהירות עם צריכת ממס נמוכה יותר, יעילות מיצוי משופרת ופרמטרים אימות חזקים.
הספרות ההולכת וגדלה בנושא מיצוי קולי מראה כי הכנת דגימות HPLC בסיוע סוניקציה אינה רק עניין של נוחות. – זוהי גישה מאושרת מדעית המשפרת את ביצועי הניתוח. על ידי שילוב של מיצוי קולי עם טכניקות כרומטוגרפיות מודרניות, מעבדות יכולות להשיג זיהוי אמין של חומרים נבדקים בכמויות זעירות במטריצות דגימה מורכבות יותר ויותר.
תהליכי עבודה משופרים באמצעות סוניקציה ב-HPLC
עם ההתקדמות המתמשכת בתחום מכשירי הניתוח וטכנולוגיות הכנת הדגימות, סביר להניח שהמיצוי הקולי ימלא תפקיד חשוב עוד יותר במעבדות כרומטוגרפיות. יכולתו לייעל את זרימת העבודה, לשפר את איכות הנתונים ולהפחית את ההשפעה הסביבתית תואמת היטב את הדרישות המשתנות של מדע הניתוח המודרני.
לכימאים אנליטיים ומעבדות תעשייתיות המבקשים לייעל את הכנת הדגימות ל-HPLC, מיצוי קולי מציע פתרון מוכח, ניתן להרחבה ומבוסס מדעית. על ידי שילוב של סוניקציה בפרוטוקולים שגרתיים להכנת דגימות, מעבדות יכולות לשפר באופן משמעותי את היעילות והאמינות של ניתוח כרומטוגרפי.
תכנון, ייצור וייעוץ – איכות תוצרת גרמניה
Hielscher ultrasonicators ידועים באיכות הגבוהה ביותר שלהם סטנדרטים עיצוב. חוסן ותפעול קל מאפשרים שילוב חלק של האולטרסאונד שלנו במתקנים תעשייתיים. תנאים קשים וסביבות תובעניות מטופלים בקלות על ידי אולטרסוניקטורים Hielscher.
Hielscher Ultrasonics היא חברה מוסמכת ISO לשים דגש מיוחד על ultrasonicators ביצועים גבוהים שמציעות טכנולוגיה חדישה וידידותיות למשתמש. כמובן, Hielscher ultrasonicators הם תואמי CE ולעמוד בדרישות של UL, CSA ו RoHs.
ספרות / מקורות
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
שאלות נפוצות
מהו HPLC?
כרומטוגרפיה נוזלית ביצועית גבוהה (HPLC) היא טכניקת הפרדה אנליטית המשמשת לזיהוי, כימות וטיהור רכיבים בתוך תערובת. ב-HPLC, שלב נייד נוזלי נושא חומרים מנותחים מומסים דרך עמודה מלאה בשלב נייח בלחץ גבוה. הבדלים באינטראקציות בין החומרים המנותחים, השלב הנייח והשלב הנייד גורמים לתרכובות להפרד בזמן שהן עוברות דרך העמודה. גלאים כגון UV-Vis, פלואורסצנטיות או ספקטרומטריית מסה מודדים את התרכובות המופרדות, ומאפשרים ניתוח איכותי וכמותי מדויק.
מהם סוגי הכרומטוגרפיה הנוזלית?
כרומטוגרפיה נוזלית ניתן לסווג על פי מנגנון ההפרדה המשמש בין החומר הנבדק, השלב הנייח והשלב הנייד. הסוגים הנפוצים ביותר הם כרומטוגרפיה שלב הפוך, שבה שלב נייח לא קוטבי מפריד תרכובות על בסיס אינטראקציות הידרופוביות; כרומטוגרפיה שלב רגיל, המשתמשת בשלב נייח קוטבי ומפרידה תרכובות על פי קוטביות; כרומטוגרפיה של חילוף יונים, שבה שלבים נייחים טעונים מפרידים אנליטים על בסיס אינטראקציות יוניות; וכרומטוגרפיה של חילוף גודל, המפרידה מולקולות על פי גודלן ההידרודינמי ומשקלן המולקולרי. שיטות מיוחדות נוספות כוללות כרומטוגרפיה זיקה וכרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופילית (HILIC), המכוונות לאינטראקציות מולקולריות ספציפיות או לתרכובות קוטביות.
אילו בקבוקונים משמשים ל-HPLC?
בניתוחי HPLC נעשה בדרך כלל שימוש בבקבוקונים קטנים מזכוכית או מפולימר, המיועדים להכיל דגימות מוכנות לפני הזרקתן למערכת הכרומטוגרפית. הפורמט הנפוץ ביותר הוא בקבוקון אוטומטי בנפח 2 מ"ל, התואם לרוב המדגמים האוטומטיים של HPLC. בקבוקונים אלה עשויים בדרך כלל מזכוכית בורוסיליקט כדי להבטיח עמידות כימית ואינטראקציה מינימלית עם ממסים וחומרים נבדקים. בהתאם לסוג הדגימה, הבקבוקונים עשויים לכלול תוספות לדגימות בנפח נמוך, מכסים הברגה או מכסים מלחציים, ומחיצות מחומרים כגון PTFE/סיליקון כדי לשמור על שלמות הדגימה.
מהם בקבוקוני דגימה אוטומטיים?
בקבוקוני אוטוסמפלר הם מיכלים מיוחדים לדגימות, המיועדים למערכות הזרקה אוטומטיות במכשירי HPLC ו-UHPLC. הם מכילים את תמיסת הדגימה המוכנה ומונחים במגש האוטוסמפלר של המכשיר, שם המערכת שואבת באופן אוטומטי נפח מוגדר להזרקה לעמודת הכרומטוגרפיה. בקבוקוני הדוגם האוטומטי מיוצרים במידות מדויקות כדי להבטיח תאימות עם מחטי דגימה רובוטיות ולמזער אידוי, זיהום או ספיחה של הדגימה. העיצוב שלהם מאפשר ניתוח בר-שחזור ובעל תפוקה גבוהה במעבדות כרומטוגרפיות מודרניות.
מהם השלבים בתהליך HPLC?
תהליך העבודה הטיפוסי של כרומטוגרפיה נוזלית ביצועית גבוהה (HPLC) מורכב מכמה שלבים עוקבים המבטיחים הפרדה וזיהוי אמינים של חומרים נבדקים.
- ראשית, מתבצע הכנת הדגימה על מנת להמיס את החומר הנבדק, להסיר חלקיקים, ולעתים קרובות להפיק או לרכז תרכובות יעד ממטריצת הדגימה. שלב זה עשוי לכלול סינון, דילול או טכניקות הפקה כגון הפקה אולטראסונית, הפקה בשלב מוצק או הפקה נוזל-נוזל.
- לאחר מכן, הדגימה המוכנה מונחת בבקבוקון HPLC ומועמסת למכשיר הדגימה האוטומטי. מכשיר הדגימה האוטומטי מזריק נפח מדויק של הדגימה לשלב הנייד הזורם.
- שלב אספקת השלב הנייד מעביר את הדגימה שהוזרקה דרך המערכת באמצעות משאבה בלחץ גבוה. השלב הנייד מעביר את החומרים הנבדקים דרך עמודת הכרומטוגרפיה בקצב זרימה מבוקר.
- בתוך עמודת הכרומטוגרפיה מתרחשת הפרדה. העמודה מכילה שלב נייח, בדרך כלל חלקיקים ארוזים בעלי תכונות כימיות מוגדרות. כאשר החומרים הנבדקים עוברים בעמודה, הם מקיימים אינטראקציה שונה עם השלב הנייח והשלב הנייד, מה שגורם להם להשתחרר בזמנים שונים.
- לאחר ההפרדה, התרכובות עוברות דרך גלאי, כגון גלאי UV-Vis, פלואורסצנטי או ספקטרומטריית מסה. הגלאי מודד את נוכחותן וריכוזן של התרכובות המשתחררות וממיר את האות לנתונים אלקטרוניים.
- לבסוף, איסוף וניתוח הנתונים מתבצעים באמצעות תוכנת כרומטוגרפיה. המערכת מייצרת כרומטוגרמה שבה השיאים מתאימים לתרכובות בודדות. זמני השמירה של השיאים מסייעים בזיהוי החומרים הנבדקים, בעוד ששטחי השיאים או גובהם מאפשרים קביעה כמותית של ריכוזם.
Hielscher Ultrasonics מייצרת הומוגנייזרים קוליים בעלי ביצועים גבוהים מ המעבדה ל גודל תעשייתי.