Préparation d'échantillons à haut débit pour le diagnostic des mitochondries
Les diagnostics mitochondriaux en recherche et en clinique sont réalisés à l'aide de différentes techniques telles que le séquençage, la PCR et les tests biochimiques. Ces méthodes sont utilisées pour identifier les mutations de l'ADN et mesurer la fonction mitochondriale. Le séquençage permet de détecter les mutations génétiques, tandis que la PCR permet de quantifier des séquences d'ADN spécifiques. Les tests biochimiques évaluent la fonctionnalité des protéines et des enzymes mitochondriales.
Le diagnostic des maladies mitochondriales est particulièrement difficile en raison de la variabilité clinique prononcée de ces maladies et de l'interaction complexe entre deux génomes hérités différemment : l'ADN mitochondrial (ADNmt) et le génome nucléaire.
Extraction et fragmentation de l'ADN par sonication
L'extraction de l'ADN du tissu musculaire est particulièrement utile lorsque l'on soupçonne des modifications de l'ADNmt spécifiques à un tissu. Ces modifications peuvent inclure des délétions de l'ADNmt dans l'ophtalmoplégie externe progressive chronique (OEPC), des mutations ponctuelles de l'ADNmt dans les myopathies mitochondriales ou une déplétion de l'ADNmt dans le syndrome d'Alpers. L'ADN extrait du tissu musculaire peut ensuite être utilisé pour divers tests génétiques, tels que le Southern blot et la PCR à longue portée pour les délétions, la PCR en temps réel pour la déplétion ou le séquençage pour les mutations ponctuelles.
La sonication, qui utilise des ondes ultrasonores intenses, est utilisée pour plusieurs applications dans le diagnostic des mitochondries. Elle est utilisée pour lyser les cellules afin d'en extraire le contenu intracellulaire tel que les mitochondries et l'ADN, pour cisailler l'ADN tel que l'ADNmt et l'ADNn pour le séquençage, et pour homogénéiser les échantillons.
Sonicateur de plaques UIP400MTP pour la préparation d'échantillons à haut débit sonifie uniformément les échantillons dans les plaques multi-puits et 96 puits
Comment isoler les mitochondries des cellules et des tissus ?
L'isolement des mitochondries comprend deux étapes essentielles : l'interruption des cellules pour libérer leur contenu et la centrifugation différentielle pour séparer et récupérer les fractions mitochondriales.
Sonication
Les sonicateurs Hielscher sont compatibles avec les tampons et kits de lyse standard, ce qui les rend adaptés à l'isolement des mitochondries. La sonication a deux objectifs principaux :
- Lyse cellulaire : Les ondes ultrasoniques perturbent les membranes cellulaires, libérant le contenu intracellulaire.
- Perturbation des mitochondries : Lors d'une étape ultérieure, la sonication peut ouvrir les mitochondries pour libérer les protéines ou l'ADN mitochondriaux.
- Fragmentation de l'ADNmt : La sonication est une technique fiable pour cisailler l'ADN mitochondrial en vue de son séquençage.
Le sonicateur pour plaques multi-puits UIP400MTP permet une préparation à haut débit des échantillons mitochondriaux. Associée à la centrifugation différentielle, la sonication améliore l'efficacité de l'isolement des mitochondries, garantissant des rendements élevés de mitochondries intactes adaptées à diverses applications en aval.
Hielscher UIP400MTP sonicateur de plaques multipuits fonctionne avec n'importe quelle plaque standard
Le sonicateur pour plaques multi-puits UIP400MTP offre de nombreux avantages pour la préparation d'échantillons à haut débit, par exemple pour le diagnostic des mitochondries.
Sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP pour la préparation d'échantillons à haut débit dans le cadre du diagnostic des biomarqueurs.
Instructions types pour la fragmentation ultrasonique de l'ADNmt
Préparation et extraction :
- Les souris C57BL/6 ont été tuées par dislocation cervicale.
- Les foies ont été rapidement extraits et lavés dans du PBS stérile refroidi à la glace.
Isolement des mitochondries :
- Les mitochondries ont été isolées à l'aide d'un broyeur de tissus Dounce de 2 ml et d'un kit d'isolement des mitochondries pour les tissus.
- Centrifugation initiale à 700× g et 3 000× g.
- Effectuer deux étapes de lavage supplémentaires avec le tampon C.
Isolement de l'ADN :
- Le culot issu de la première centrifugation à 700× g a été utilisé pour isoler l'ADN nucléaire (ADNn).
- L'ADN a été isolé à l'aide de colonnes d'essorage.
- L'ADN mitochondrial (ADNmt) a été extrait des mitochondries isolées.
- L'ADN nucléaire (ADNn) a été extrait d'extraits nucléaires bruts, provenant tous deux de tissus hépatiques de souris.
Fragmentation de l'ADN :
- L'ADN a été fragmenté sur la glace à l'aide d'un sonicateur ultrasonique UP50H 30-kHz/50-W avec une sonotrode à micro-pointe de 0,5 mm à 14 μm pendant 2 × 30 secondes.
Visualisation et quantification de la fragmentation :
- La fragmentation après ultrasonification a été visualisée sur un gel d'agarose à 1 % avec le colorant d'ADN SYBR safe.
- L'abondance relative de l'ADNmt et de l'ADNn a été déterminée par qPCR.
(cf. Mariero et al., 2019)
Pour la préparation d'échantillons à haut débit, le sonicateur pour plaques multi-puits UIP400MTP facilite la préparation d'un grand nombre d'échantillons dans des plaques standard à 96 puits, multi-puits et microtitres.
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Conseils pour un isolement optimal des mitochondries par sonication :
- Contrôle de la température : Effectuer toutes les étapes à une température comprise entre 0°C et 4°C. Ceci est essentiel pour maintenir l'intégrité et la fonctionnalité des mitochondries.
- Efficacité et rapidité : Travaillez rapidement et ne purifiez les mitochondries que dans la mesure nécessaire à votre application spécifique. Une manipulation excessive peut entraîner des pertes importantes de contenu mitochondrial.
- Dilution des suspensions : Maintenir de faibles concentrations de suspensions de cellules et d'organelles tout au long du processus d'isolement. Cela permet de minimiser les risques de piégeage et d'agglutination, améliorant ainsi la pureté des mitochondries isolées.
- Volume de l'échantillon : Optez pour plusieurs préparations à petite échelle plutôt que pour une seule grande. Cette approche permet généralement d'obtenir de meilleurs rendements, car la mise à l'échelle n'augmente pas proportionnellement la quantité de mitochondries récupérables. Le sonicateur pour plaques multi-puits UIP400MTP facilite la lyse rapide et fiable des cellules pour l'isolement des mitochondries ainsi que l'extraction des protéines des mitochondries.
Ces lignes directrices rendront plus efficace le processus d'isolement par lyse ultrasonique et centrifugation, ce qui permettra d'obtenir des préparations mitochondriales de haute qualité adaptées aux applications en aval.
Sonicateurs Hielscher – Qualité Made in Germany
Les ultrasons Hielscher sont réputés pour leur qualité et leurs normes de conception les plus élevées. La robustesse et la facilité d'utilisation permettent une intégration aisée de nos ultrasons dans les installations industrielles. Les conditions difficiles et les environnements exigeants sont facilement gérés par les ultrasons Hielscher.
Hielscher Ultrasonics est une entreprise certifiée ISO et met l'accent sur les ultrasons de haute performance, dotés d'une technologie de pointe et d'une grande facilité d'utilisation. Bien entendu, les ultrasons Hielscher sont conformes à la norme CE et répondent aux exigences des normes UL, CSA et RoHs.
Sonicateur pour plaques 96 puits UIP400MTP pour la sonification de plaques de microtitration et de plaques multipuits
Littérature / Références
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Questions fréquemment posées sur les mitochondries et le diagnostic mitochondrial
Que sont les mitochondries ?
Les mitochondries sont des organites membranaires présents dans les cellules de la plupart des organismes eucaryotes. Elles sont connues comme les centrales électriques de la cellule car elles produisent de l'énergie sous forme d'adénosine triphosphate (ATP) par le biais du processus de respiration cellulaire. En outre, les mitochondries possèdent leur propre ADN et jouent un rôle clé dans d'autres processus cellulaires, notamment la régulation du cycle cellulaire et la mort cellulaire.
Qu'est-ce qui différencie l'ADNmt de l'ADN génomique ?
L'ADN mitochondrial (ADNmt) diffère de l'ADN génomique (ADNg) sur plusieurs points essentiels. L'ADNmt est situé dans les mitochondries, est circulaire et est hérité de la mère, alors que l'ADNg est situé dans le noyau cellulaire, est linéaire et est hérité des deux parents. L'ADNmt est beaucoup plus petit, ne codant que 37 gènes, alors que l'ADNg contient environ 20 000 à 25 000 gènes. L'ADNmt est présent en plusieurs copies par cellule, présente un taux de mutation plus élevé et code principalement pour des protéines impliquées dans la fonction mitochondriale. En revanche, l'ADNg est généralement diploïde, présente un taux de mutation plus faible et code pour une vaste gamme de gènes nécessaires au développement et au fonctionnement de l'organisme. En outre, la transcription et la traduction de l'ADNmt ont lieu dans les mitochondries, tandis que la transcription de l'ADNg a lieu dans le noyau et la traduction dans le cytoplasme. Ces différences reflètent leurs rôles distincts et leurs origines évolutives.
Qu'est-ce que l'extrait exempt de cellules ?
Un extrait acellulaire est une solution contenant le contenu de cellules lysées, notamment des protéines, des acides nucléiques et d'autres composants cellulaires, mais sans membranes cellulaires intactes. Cet extrait est utilisé dans la recherche en biochimie et en biologie moléculaire pour étudier les processus cellulaires in vitro, ce qui permet aux chercheurs d'analyser les réactions et les mécanismes en dehors des cellules vivantes.
Quel rôle jouent les tests PCR dans le diagnostic mitochondrial ?
Les tests PCR jouent un rôle essentiel dans le diagnostic mitochondrial en permettant la détection de mutations, de délétions ou de variations du nombre de copies dans l'ADN mitochondrial (ADNmt). Ils permettent l'amplification de régions spécifiques de l'ADNmt afin d'identifier les variantes pathogènes associées aux troubles mitochondriaux. Les techniques basées sur la PCR, telles que la PCR quantitative (qPCR) et la PCR à longue portée, sont également utilisées pour évaluer l'intégrité de l'ADNmt, les niveaux d'hétéroplasmie et la déplétion de l'ADNmt, fournissant ainsi des informations essentielles sur la fonction et la maladie mitochondriales.
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Qu'est-ce que la centrifugation différentielle ?
La centrifugation différentielle est une technique largement utilisée pour le fractionnement cellulaire et l'isolement des mitochondries. Cette méthode permet de séparer les structures cellulaires en fonction de leur coefficient de sédimentation, qui dépend à la fois de la densité et de la forme. Le processus consiste à appliquer différents niveaux de force centrifuge à des échantillons dans des solutions salines tamponnées ayant des densités spécifiques. Les structures ayant des coefficients de sédimentation similaires se déposeront au fond du tube de collecte en même temps, ce qui permettra de les récupérer.
Comment la centrifugation différentielle est-elle utilisée pour l'isolement des mitochondries ?
La centrifugation différentielle permet aux chercheurs de séparer efficacement les fractions mitochondriales des autres composants cellulaires. L'isolement des mitochondries implique plusieurs étapes de centrifugation et la récupération ultérieure de l'isolat.
Centrifugation initiale : Appliquer une faible force centrifuge pour sédimenter les gros débris cellulaires et les noyaux.
Centrifugations ultérieures : Augmenter la force centrifuge par étapes pour culotter les fractions enrichies en mitochondries. Chaque étape de centrifugation élimine les structures dont le coefficient de sédimentation est progressivement plus élevé.
Récupération des fractions : Après chaque centrifugation, le culot est recueilli et le surnageant est soumis à des forces g plus élevées pour isoler la fraction suivante. Cette opération est répétée jusqu'à ce que la pureté souhaitée des mitochondries soit atteinte.