Préparation d’échantillons à haut débit pour le diagnostic mitochondrial
Le diagnostic mitochondrial, en recherche comme en clinique, fait appel à diverses techniques telles que le séquençage, la PCR et les dosages biochimiques. Ces méthodes servent à identifier les mutations de l’ADN et à mesurer la fonction mitochondriale. Le séquençage permet de détecter les mutations génétiques, tandis que la PCR peut quantifier des séquences d’ADN spécifiques. Les dosages biochimiques évaluent la fonctionnalité des protéines et des enzymes mitochondriales.
Le diagnostic des maladies mitochondriales est particulièrement difficile en raison de la variabilité clinique prononcée de ces maladies, mais aussi de l’interaction complexe entre deux génomes transmis selon des modes différents : l’ADN mitochondrial (ADNmt) et le génome nucléaire.
Extraction et fragmentation de l’ADN par sonication
L’extraction d’ADN à partir de tissu musculaire est particulièrement utile lorsque l’on suspecte des altérations de l’ADNmt spécifiques à un tissu. Ces altérations peuvent comprendre des délétions de l’ADNmt dans l’ophtalmoplégie externe progressive chronique (CPEO), des mutations ponctuelles de l’ADNmt dans les myopathies mitochondriales ou une déplétion de l’ADNmt dans le syndrome d’Alpers. L’ADN extrait du tissu musculaire peut ensuite servir à divers tests génétiques, tels que le Southern blot et la PCR longue distance pour les délétions, la PCR en temps réel pour la déplétion, ou le séquençage pour les mutations ponctuelles.
La sonication, qui utilise des ondes ultrasonores intenses, est employée pour plusieurs applications du diagnostic mitochondrial. Elle sert à lyser les cellules afin d’en extraire le contenu intracellulaire, comme les mitochondries et l’ADN, à fragmenter par cisaillement l’ADN, tel que l’ADNmt et l’ADNn, en vue du séquençage, et à homogénéiser les échantillons.
Sonicateur pour plaques UIP400MTP pour la préparation d’échantillons à haut débit sonique uniformément les échantillons dans des plaques multipuits et 96 puits
Comment isoler les mitochondries à partir de cellules et de tissus
L’isolement des mitochondries comporte deux étapes essentielles : la désintégration des cellules pour libérer leur contenu, puis la centrifugation différentielle pour séparer et récupérer les fractions mitochondriales.
Sonication
Les sonicateurs Hielscher sont compatibles avec les tampons et kits de lyse standard, ce qui les rend adaptés à l’isolement des mitochondries. La sonication remplit deux fonctions principales :
- Lyse cellulaire : Les ondes ultrasonores rompent les membranes cellulaires et libèrent le contenu intracellulaire.
- Désintégration des mitochondries : Une sonication lors d’une étape ultérieure peut ouvrir les mitochondries afin de libérer les protéines mitochondriales ou l’ADN mitochondrial.
- Fragmentation de l’ADNmt : La sonication est une technique fiable pour fragmenter par cisaillement l’ADN mitochondrial en vue du séquençage.
Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP permet la préparation à haut débit d’échantillons mitochondriaux. Associée à la centrifugation différentielle, la sonication améliore l’efficacité de l’isolement des mitochondries et garantit des rendements élevés de mitochondries intactes, adaptées à diverses applications en aval.
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Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP offre de nombreux avantages pour la préparation d’échantillons à haut débit, par exemple dans le diagnostic mitochondrial.
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Exemple de protocole pour la fragmentation ultrasonore de l’ADNmt
Préparation et prélèvement :
- Des souris C57BL/6 ont été mises à mort par dislocation cervicale.
- Les foies ont été rapidement prélevés et lavés dans du PBS stérile glacé.
Isolement des mitochondries :
- Les mitochondries ont été isolées à l’aide d’un broyeur de tissus Dounce 2-mL et d’un Mitochondria Isolation Kit for Tissue.
- Centrifugation initiale à 700× g et 3 000× g.
- Effectuer deux étapes de lavage supplémentaires avec le tampon C.
Isolement de l’ADN :
- Le culot issu de la première centrifugation à 700× g a servi à isoler l’ADN nucléaire (ADNn).
- L’ADN a été isolé à l’aide de colonnes de centrifugation.
- L’ADN mitochondrial (ADNmt) a été extrait des mitochondries isolées.
- L’ADN nucléaire (ADNn) a été extrait d’extraits nucléaires bruts, tous deux provenant de tissu hépatique de souris.
Fragmentation de l’ADN :
- L’ADN a été fragmenté sur glace à l’aide d’un sonicateur à ultrasons UP50H 30-kHz/50-W équipé d’une sonotrode micro-pointe 0,5-mm, à 14 μm pendant 2 × 30 secondes.
Visualisation et quantification de la fragmentation :
- La fragmentation après ultrasonication a été visualisée sur un gel d’agarose à 1% avec le colorant d’ADN SYBR safe.
- L’abondance relative de l’ADNmt et de l’ADNn a été déterminée par qPCR.
(cf. Mariero et al., 2019)
Pour la préparation d’échantillons à haut débit, le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP facilite la préparation de grands nombres d’échantillons dans des plaques standard 96 puits, multipuits et de microtitration.
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Conseils pour un isolement optimal des mitochondries par sonication :
- Contrôle de la température : Réalisez toutes les étapes dans une plage de température de 0°C à 4°C. C’est essentiel pour préserver l’intégrité et la fonctionnalité des mitochondries.
- Efficacité et rapidité : Travaillez rapidement et ne purifiez les mitochondries que dans la mesure requise par votre application spécifique. Une manipulation excessive peut entraîner des pertes importantes de contenu mitochondrial.
- Dilution des suspensions : Maintenez de faibles concentrations des suspensions de cellules et d’organites tout au long du processus d’isolement. Cela permet de minimiser les risques de piégeage et d’agglutination, et d’améliorer ainsi la pureté des mitochondries isolées.
- Volume d’échantillon : Privilégiez plusieurs préparations à petite échelle plutôt qu’une seule préparation de grande taille. Cette approche donne généralement de meilleurs rendements, car l’augmentation d’échelle n’accroît pas proportionnellement la quantité de mitochondries récupérables. Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP facilite la lyse rapide et fiable des cellules pour l’isolement des mitochondries ainsi que l’extraction des protéines à partir des mitochondries.
Ces recommandations rendront le processus d’isolement par lyse ultrasonore et centrifugation plus efficace et permettront d’obtenir des préparations mitochondriales de haute qualité, adaptées aux applications en aval.
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Les ultrasonicateurs Hielscher sont réputés pour leurs standards de qualité et de conception les plus élevés. Leur robustesse et leur simplicité d’utilisation permettent une intégration aisée de nos ultrasonicateurs dans les installations industrielles. Les ultrasonicateurs Hielscher font face sans difficulté aux conditions difficiles et aux environnements exigeants.
Hielscher Ultrasonics est une entreprise certifiée ISO qui accorde une importance particulière à des ultrasonicateurs hautes performances alliant technologie de pointe et facilité d’utilisation. Bien entendu, les ultrasonicateurs Hielscher sont conformes CE et satisfont aux exigences UL, CSA et RoHs.
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Bibliographie / Références
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Questions fréquentes sur les mitochondries et le diagnostic mitochondrial
Que sont les mitochondries ?
Les mitochondries sont des organites entourés d’une membrane présents dans les cellules de la plupart des organismes eucaryotes. On les qualifie de centrales énergétiques de la cellule, car elles produisent de l’énergie sous forme d’adénosine triphosphate (ATP) par le processus de respiration cellulaire. En outre, les mitochondries possèdent leur propre ADN et jouent des rôles clés dans d’autres processus cellulaires, notamment la régulation du cycle cellulaire et la mort cellulaire.
Qu’est-ce qui distingue l’ADNmt de l’ADN génomique ?
L’ADN mitochondrial (ADNmt) se distingue de l’ADN génomique (ADNg) sur plusieurs points essentiels. L’ADNmt est situé dans les mitochondries, il est circulaire et transmis par la mère, tandis que l’ADNg est situé dans le noyau cellulaire, il est linéaire et transmis par les deux parents. L’ADNmt est beaucoup plus petit et ne code que 37 gènes, alors que l’ADNg contient environ 20 000–25 000 gènes. L’ADNmt est présent en de multiples copies par cellule, présente un taux de mutation plus élevé et code principalement des protéines impliquées dans la fonction mitochondriale. À l’inverse, l’ADNg est généralement diploïde, présente un taux de mutation plus faible et code un vaste ensemble de gènes nécessaires au développement et au fonctionnement de l’organisme. De plus, la transcription et la traduction de l’ADNmt ont lieu dans les mitochondries, tandis que la transcription de l’ADNg a lieu dans le noyau et la traduction dans le cytoplasme. Ces différences reflètent leurs rôles distincts et leurs origines évolutives.
Qu’est-ce qu’un extrait acellulaire ?
Un extrait acellulaire est une solution contenant le contenu de cellules lysées, notamment des protéines, des acides nucléiques et d’autres composants cellulaires, mais dépourvue de membranes cellulaires intactes. Cet extrait est utilisé dans la recherche en biochimie et en biologie moléculaire pour étudier les processus cellulaires in vitro, ce qui permet aux chercheurs d’analyser des réactions et des mécanismes en dehors des cellules vivantes.
Quel rôle jouent les tests PCR dans le diagnostic mitochondrial ?
Les tests PCR jouent un rôle essentiel dans le diagnostic mitochondrial, car ils permettent de détecter des mutations, des délétions ou des variations du nombre de copies de l’ADN mitochondrial (ADNmt). Ils permettent d’amplifier des régions spécifiques de l’ADNmt afin d’identifier des variants pathogènes associés aux maladies mitochondriales. Les techniques basées sur la PCR, telles que la PCR quantitative (qPCR) et la PCR longue distance, servent également à évaluer l’intégrité de l’ADNmt, les niveaux d’hétéroplasmie et la déplétion de l’ADNmt, fournissant ainsi des informations essentielles sur la fonction mitochondriale et les maladies.
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Qu’est-ce que la centrifugation différentielle ?
La centrifugation différentielle est une technique largement utilisée pour le fractionnement cellulaire et l’isolement des mitochondries. Cette méthode sépare les structures cellulaires en fonction de leur coefficient de sédimentation, qui dépend à la fois de la densité et de la forme. Le processus consiste à appliquer différents niveaux de force centrifuge à des échantillons placés dans des solutions salines tamponnées de densités spécifiques. Les structures ayant des coefficients de sédimentation similaires se déposent au fond du tube de collecte au même moment, ce qui permet de les récupérer.
Comment la centrifugation différentielle est-elle utilisée pour l’isolement des mitochondries ?
La centrifugation différentielle permet aux chercheurs de séparer efficacement les fractions mitochondriales des autres composants cellulaires. L’isolement des mitochondries comprend plusieurs étapes de centrifugation, suivies de la récupération de l’isolat.
Centrifugation initiale : Appliquez une faible force centrifuge pour sédimenter les gros débris cellulaires et les noyaux.
Centrifugations suivantes : Augmentez progressivement la force centrifuge pour culotter les fractions enrichies en mitochondries. Chaque étape de centrifugation élimine des structures ayant des coefficients de sédimentation de plus en plus élevés.
Récupération des fractions : Après chaque centrifugation, le culot est recueilli et le surnageant est soumis à des forces g plus élevées afin d’isoler la fraction suivante. Cette opération est répétée jusqu’à obtenir la pureté de mitochondries souhaitée.