PMCA prioonide suure läbilaskevõimega tuvastamiseks UIP400MTP Sonicatori abil

UIP400MTP mitme auguga plaadisonikaator pakub võimsat lahendust suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamiseks valkude valesti kokkuklapitavas tsüklilises amplifikatsioonis (PMCA). Pakkudes ühtlast energiajaotust mitmes kaevus ja säilitades täpsed ultrahelitöötluse parameetrid, võimaldab see süsteem paljude erakordse reprodutseeritavusega proovide samaaegset töötlemist. Need võimalused on kriitilise tähtsusega PMCA optimeerimiseks, et tuvastada prioone madalatel kontsentratsioonidel keerulistes bioloogilistes proovides, näiteks süljes, kus analüüsi inhibiitorid võivad tulemusi varjata.

Prioonhaigused, nagu krooniline kurnatushaigus (CWD) hirvlastel ja Creutzfeldt-Jakobi tõbi (CJD) inimestel, on neurodegeneratiivsed häired, mida põhjustavad valesti kokku pandud prioonvalgud (PrP^Sc). Need haigused hõlmavad sageli nakkuslike prioonide madalat taset kehavedelikes, nagu sülg, veri ja uriin, raskendades diagnoosimist ja uuringuid. Kurtumuse horisontaalne ülekandumine keskkonnamaatriksitesse heidetud prioonide kaudu avaldab eriti olulist mõju eluslooduse majandamisele ja ökoloogilisele tervisele. Samamoodi on selliste haiguste puhul nagu Creutzfeldt-Jakobi tõbi diagnostika edendamiseks ja haiguse progresseerumise mõistmiseks ülioluline inimproovidest valesti kokku pandud prioonvalkude usaldusväärne võimendamine.

Modifitseeritud PMCA-protokolli rakendamine võimaldab mööda hiilida tavalistest analüüsi inhibiitoritest (nt süljes olevad mukiinid) ja saavutada kõrge tundlikkus prioonide tuvastamisel, mis muidu oleksid tuvastamatud või mitmetähenduslikud, kasutades selliseid meetodeid nagu reaalajas quaking-indutseeritud muundamine (RT-QuIC). Need edusammud parandavad prioonide tuvastamist erinevate haiguste korral, muutes PMCA hädavajalikuks vahendiks priooniuuringutes ja diagnostikas. Mitme auguga plaadi sonikaatori UIP400MTP hõlbustab suure läbilaskevõimega PMCA ultraheliga töödeldud arvukaid proove mikroplaatidel (nt 6-, 24- või 96-augulised plaadid) või viaalides toruriiulis.

Suure läbilaskevõimega valgu valesti voltimise tsüklilise amplifikatsiooni (PMCA) protokoll

Järgmine protokoll võimaldab suure valimiarvu tõhusat töötlemist täpselt samadel tingimustel usaldusväärsete uurimistulemuste saamiseks.

Proovi ettevalmistamine

Lähtematerjal:
Valmistage proovid ette:

• Sarkosüüli ekstraheerimisgraanulite suspendeerimine PMCA substraadis.
• Otseselt pihustavad aju homogenaadid või vereproovid prioonseemnetega.

Alusmaterjal:

• Kasutage 10% (wt/vol) aju homogenaati, mis on valmistatud transgeensetest hiirtest, kes väljendavad PrP-d üle^C (nt Tg hiired).
• Homogeniseerige ajukoe:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Kuni kasutamiseni hoidke aluspinda temperatuuril -80 ° C.

Proovi seadistamine mikroplaadil või torudes:
Torud:

• Lisatakse 90 μL aju homogenaadi substraati ja seemneid koos 10 μL prooviga (nt veri, aju homogenaat või sarkosüülpellet).
• Igasse 0,2 ml torusse asetatakse 3 teflonhelmest (läbimõõt 1,59 mm või 2,38 mm).
• Paigaldage torud UIP400MTP sonikaatoriga ühilduvale riiulile.

6-auguline mikroplaat:

• Lisatakse 5 ml aju homogenaadi substraati ja seemneid 500 μL prooviga süvendi kohta.
• Lisage igasse auku 3 teflonhelmest.

PMCA protseduur

Paigutuse:
Asetage toruriiul või 6-auguline mikroplaat sonikaatori UIP400MTP vastavalt tootja juhistele.

Rattasõidu programm:
Tehke 144 PMCA tsüklit järgmiselt:

• Inkubeerimine: 29 minutit ja 30 sekundit temperatuuril 37 °C.
• Sonikatsioon: 30 sekundit 60% amplituudil.
• Jälgige temperatuuri: kasutage ühendatavat temperatuuriandurit, et jälgida proovi temperatuuri ja programmeerida UIP400MTP maksimaalsele temperatuurile 48–50 ° C.

Järgnevad voorud:
Pärast 144 tsüklist koosneva esimese vooru läbimist viige üle võimendatud materjali alikvoot:

• Lahjendage 10 korda värskeks transgeenseks hiire aju homogenaadi substraadiks.
• Tehke 96 PMCA tsüklit järgnevate voorude jaoks, säilitades samad ultrahelitöötluse parameetrid.
• Jätkake soovitud arvu ringidega (tavaliselt kuni 5).

PrP tuvastamine^Sc

1. Proteinaas K seedimine:
   – Proove töödeldakse proteinaasiga K (50 μg/ml) 37 °C juures 1 tund.
   – Seedimine lõpetatakse SDS-proovipuhvri lisamisega ja keedetakse 10 minutit.
2. Western Blot analüüs:
   – Lagundatud proove analüüsitakse, kasutades:
   – 6H4 või PRC1 anti-PrP antikehad.
   – Tehke SDS-PAGE ja viige tuvastamiseks PVDF-membraanidele.

 

 

Töödelge rohkem proove, et saada kindlamaid tulemusi

Mitme auguga plaadisonikaatori UIP400MTP suurendab märkimisväärselt valgu valesti voltimise tsüklilise amplifikatsiooni (PMCA) tõhusust ja mastaapsust, käsitledes protseduuri traditsiooniliselt aeganõudvat olemust. Lubades kuni 96 proovi samaaegset töötlemist 96-süvendi plaadil, lihtsustab süsteem PMCA töövooge, säilitades samal ajal täpsed ja ühtlased ultrahelitöötluse tingimused kõigis kaevudes. See suure läbilaskevõimega võime minimeerib käsitsi käsitsemist, vähendab töömahukaid samme ja tagab reprodutseeritavuse, muutes selle priooniuuringute jaoks hädavajalikuks tööriistaks. Olenemata sellest, kas uuritakse kroonilist raiskamishaigust või Creutzfeldt-Jakobi tõbe, hõlbustab UIP400MTP suuremahulisi uuringuid suurema tõhususega, võimaldades teadlastel rahuldada kaasaegsete diagnostiliste ja teaduslike rakenduste nõudmisi.

---

---

Kirjandus / Viited

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.