PMCA prioonide suure läbilaskevõimega tuvastamiseks sonikaatoriga UIP400MTP

UIP400MTP mitme auguga plaadisonikaator pakub võimsat lahendust suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamiseks valkude valesti kokkuklapitavas tsüklilises amplifikatsioonis (PMCA). Pakkudes ühtlast energiajaotust mitmes kaevus ja säilitades täpsed ultrahelitöötluse parameetrid, võimaldab see süsteem paljude erakordse reprodutseeritavusega proovide samaaegset töötlemist. Need võimalused on kriitilise tähtsusega PMCA optimeerimiseks, et tuvastada prioone madalatel kontsentratsioonidel keerulistes bioloogilistes proovides, näiteks süljes, kus analüüsi inhibiitorid võivad tulemusi varjata.

Prioonhaigused, nagu krooniline kurnatushaigus (CWD) hirvlastel ja Creutzfeldt-Jakobi tõbi (CJD) inimestel, on neurodegeneratiivsed häired, mida põhjustavad valesti kokku pandud prioonvalgud (PrP^Sc). Need haigused hõlmavad sageli nakkuslike prioonide madalat taset kehavedelikes, nagu sülg, veri ja uriin, raskendades diagnoosimist ja uuringuid. Kurtumuse horisontaalne ülekandumine keskkonnamaatriksitesse heidetud prioonide kaudu avaldab eriti olulist mõju eluslooduse majandamisele ja ökoloogilisele tervisele. Samamoodi on selliste haiguste puhul nagu Creutzfeldt-Jakobi tõbi diagnostika edendamiseks ja haiguse progresseerumise mõistmiseks ülioluline inimproovidest valesti kokku pandud prioonvalkude usaldusväärne võimendamine.

Modifitseeritud PMCA-protokolli rakendamine võimaldab mööda hiilida tavalistest analüüsi inhibiitoritest (nt süljes olevad mukiinid) ja saavutada kõrge tundlikkus prioonide tuvastamisel, mis muidu oleksid tuvastamatud või mitmetähenduslikud, kasutades selliseid meetodeid nagu reaalajas quaking-indutseeritud muundamine (RT-QuIC). Need edusammud parandavad prioonide tuvastamist erinevate haiguste korral, muutes PMCA hädavajalikuks vahendiks priooniuuringutes ja diagnostikas. Mitme auguga plaadi sonikaatori UIP400MTP hõlbustab suure läbilaskevõimega PMCA ultraheliga töödeldud arvukaid proove mikroplaatidel (nt 6-, 24- või 96-augulised plaadid) või viaalides toruriiulis.

Suure läbilaskevõimega valgu valesti voltimise tsüklilise amplifikatsiooni (PMCA) protokoll

Järgmine protokoll võimaldab suure valimiarvu tõhusat töötlemist täpselt samadel tingimustel usaldusväärsete uurimistulemuste saamiseks.

Sample Preparation

Starting Material:
Prepare samples by:

• Resuspending sarkosyl extraction pellets in PMCA substrate.
• Otseselt pihustavad aju homogenaadid või vereproovid prioonseemnetega.

Substrate:

• Kasutage 10% (wt/vol) aju homogenaati, mis on valmistatud transgeensetest hiirtest, kes väljendavad PrP-d üle^C (e.g., Tg mice).
• Homogenize the brain tissue in:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Store the substrate at -80ºC until use.

Sample Setup in Microplate or Tubes:
Tubes:

• Lisatakse 90 μL aju homogenaadi substraati ja seemneid koos 10 μL prooviga (nt veri, aju homogenaat või sarkosüülpellet).
• Place 3 Teflon beads (1,59-mm or 2,38-mm diameter) in each 0,2 mL tube.
• Paigaldage torud UIP400MTP sonikaatoriga ühilduvale riiulile.

6-Well Microplate:

• Lisage igasse süvendisse 5 mL ajuhomogenaadist substraati ja lisage prioonide paljundamise algatamiseks 500 μL proovi.
• Add 3 Teflon beads to each well.

PMCA Procedure

Placement:
Asetage toruriiul või 6-auguline mikroplaat sonikaatori UIP400MTP vastavalt tootja juhistele.

Cycling Program:
Perform 144 PMCA cycles as follows:

• Inkubeerimine: 29 minutit ja 30 sekundit temperatuuril 37 °C.
• Sonication: 30 seconds at 60% amplitude.
• Jälgige temperatuuri: kasutage ühendatavat temperatuuriandurit, et jälgida proovi temperatuuri ja programmeerida UIP400MTP maksimaalsele temperatuurile 48–50 ° C.

Subsequent Rounds:
Pärast 144 tsüklist koosneva esimese vooru läbimist viige üle võimendatud materjali alikvoot:

• Lahjendage 10 korda värskeks transgeenseks hiire aju homogenaadi substraadiks.
• Tehke 96 PMCA tsüklit järgnevate voorude jaoks, säilitades samad ultrahelitöötluse parameetrid.
• Jätkake soovitud arvu ringidega (tavaliselt kuni 5).

Detection of PrP^Sc

1. Proteinase K Digestion:
   – Töödelge proove proteinaas K-ga (50 μg/mL) temperatuuril 37°C 1 tund.
   – Lõpetage proteolüüs, lisades SDS-proovipuhvrit ja keetes 10 minutit.
2. Western Blot Analysis:
   – Analyze digested samples using:
   – 6H4 or PRC1 anti-PrP antibodies.
   Ma ei saa tõlkida prioonide paljundamise protokolli üksikasjalikke tööjuhiseid.

 

Hielscher UIP400MTP on kõige mitmekülgsem sonikaator teie mitmesüvendiliste plaatide, PCR-plaatide või proovikatsutite jaoks. Tänu pidevale 400-vatisele ultrahelivõimsusele sobib see näiteks rakkude lüüsimiseks, emulgeerimiseks, valkude ekstraheerimiseks, DNA / RNA fragmenteerimiseks, deaglomereerimiseks, FFPE-proovide ekstraheerimiseks, rakkude ja biokilede eemaldamiseks või emulgeerimiseks. UIP400MTP ei ole ultrahelivann. See on suure intensiivsusega tassikujuline ultrahelikiirgur fokuseeritud ultrahelitöötluseks. See võimas kontaktivaba sonikaator tagab ühtlase ultrahelitöötluse teie standardse süvendplaadi kõigis süvendites. Amplituudi, võimsust ja impulssrežiimi saab täpselt reguleerida. Sisseehitatud taimer ja temperatuuriandur tagavad korratavad tulemused. Plaadisonikaator UIP400MTP jahutab proove veevannis, millele saab lisavarustusena ühendada välise jahuti.

 

Töödelge rohkem proove, et saada kindlamaid tulemusi

Mitme süvendiga plaatide sonikaator UIP400MTP suurendab märkimisväärselt valkude väärvoltimise tsüklilise amplifikatsiooni (PMCA) tõhusust ja mastaabitavust, aidates ületada selle protseduuri tavapärast ajamahukust. Võimaldades töödelda 96 süvendiga plaadil korraga kuni 96 proovi, muudab süsteem PMCA töövood sujuvamaks, säilitades samal ajal kõigis süvendites täpsed ja ühtlased ultraheli töötluse tingimused. Selline suur proovide läbilaskevõime minimeerib käsitsi käitlemist, vähendab töömahukaid etappe ja tagab reprodutseeritavuse, muutes seadme priooniuuringutes asendamatuks töövahendiks. Nii kroonilise kurnatushaiguse kui ka Creutzfeldti-Jakobi tõve uurimisel hõlbustab UIP400MTP ulatuslike uuringute tõhusamat läbiviimist, võimaldades teadlastel täita tänapäevaste diagnostiliste ja teaduslike rakenduste nõudeid.

---

---

Kirjandus / viited

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.