Amüloidfibrilli moodustumine, kasutades UIP400MTP mikroplaadi ultrahelimasinat

Amüloidfibrillid, sarnaselt kristallidega, moodustuvad tuumade moodustumise ja sellele järgneva kasvu käigus. Kuid tuumade moodustumise kõrge vaba energia barjääri tõttu toimub spontaanne amüloidfibrilli moodustumine alles pärast pikaajalist viivitusfaasi. Ultraheli on muutunud võimsaks vahendiks amüloidi tuumade esilekutsumiseks, kiirendades seeläbi oluliselt fibrillide moodustumist. Kombineerituna mikroplaadilugejaga, mis kasutab tioflaviin T (ThT) fluorestsentsi, võimaldab ultraheli tuvastada amüloidfibrillide suure läbilaskevõimega mitmes proovis samaaegselt.

Ultraheliga indutseeritud amüloidfibrilli moodustumine UIP400MTP mikroplaadi sonikaatoriga

UIP400MTP mitme süvendiga plaadi sonikaatoriga saab sama kvaliteediga amüloidfibrille suurtes kogustes kiiresti sünteesida teadusuuringute eesmärgil. See tõhus lähenemisviis võimaldab uurida valkude amüloidogeensust. See meetod hõlbustab kiiret ja reprodutseeritavat amüloidfibrillatsiooni, nagu on näidatud dialüüsiga seotud amüloidoosiga seotud amüloidoosiga seotud amüloidogeense valgu β2-mikroglobuliiniga (β2-m).

Lihtne eksperimentaalne lähenemine: ultraheliga indutseeritud amüloidvirvendusarütmia

Fibrilli moodustumise esilekutsumiseks asetati UIP400MTP mitme süvendiga plaadi sonikaatori keskele 96 süvendiga mikroplaat, mis tagab ühtlase ultraheli kokkupuute kõigis süvendites. Katsetingimused olid järgmised:

1. Iga süvend sisaldas 0,2 ml β2-mikroglobuliini lahust (0,3 mg/ml, pH 2,5), millele oli lisatud 5 μM ThT.
2. Plaadile tehti ultrahelitsüklid, näiteks 1-minutiline ultraheli, millele järgnes 9-minutiline paus.
3. Pärast ultrahelitöötlust mõõdeti ThT fluorestsentsi mikroplaadilugeja abil.

(vrd So et al., 2011)

Võrdlus tavapärase segamisega

Võrreldes traditsiooniliste segamismeetoditega vähendas ultraheli drastiliselt fibrillide moodustumise viivitusfaasi. Tavapärastes mikroplaatide raputamise tingimustes suurenes ThT fluorestsents 20 tunni pärast ainult 1 augus 10-st. Seevastu tsüklilise ultraheli kasutamisel (15-minutiline ultrahelitöötlus, millele järgneb 5-minutiline vaiksus) tuvastati kohe pärast esimest ultrahelitöötlust märkimisväärne ThT fluorestsentsi suurenemine.

Fibrillatsiooni kineetika kiire kiirendus

Saadud tulemused So et al. (2011) näitasid, et β2-mikroglobuliini spontaanset fibrilli moodustumist pH 2,5 juures saab ultraheliga kiirendada mitmelt tunnilt vaid 10–15 minutini.
Aatomijõu mikroskoopia (AFM) pildid kinnitasid, et iga 10-minutilise ultraheli abil iga 15 minuti järel genereeritud fibrillid olid morfoloogiliselt eristamatud neist, mis moodustati 1-minutilise ultraheli abil iga 10 minuti järel. See rõhutab ultraheliga indutseeritud amüloidvirvendusarütmia reprodutseeritavust ja vastupidavust.

AML-pildid amüloidfibrillidest, mis on toodetud 1-minutilise ultraheliga iga 10 minuti järel (i), 10-minutilise ultrahelitöötlusega iga 15 minuti järel (ii) ja külvireaktsiooniga ilma ultrahelita (iii). Valge skaalariba tähistab 1 μm.
Uuring ja pildid: ©So et al., 2011

Virvendusarütmia neutraalse pH tingimustes

Isegi neutraalse pH tingimustes saavutati fibrilli moodustumine pärast 1,5-tunnist viivitust, mis näitab, et ultraheli alandab oluliselt tuumade ja kasvu energeetilist barjääri. See toetab veelgi hüpoteesi, et amüloidfibrillatsioon on peamiselt füüsikaline reaktsioon, mida suuresti piirab tuumade energiabarjäär, mida ultraheli tõhusalt vähendab.

Mõju amüloididega seotud haiguste uurimisele

Amüloidfibrillide lihtne ja usaldusväärne moodustumine UIP400MTP mikroplaadi sonikaatori abil mõjutab oluliselt Alzheimeri tõve (AD) uuringuid ja muid amüloidiga seotud häireid, nagu Parkinsoni tõbi, II tüüpi diabeet ja süsteemsed amüloidoosid. AD korral on amüloid-β (Aβ) agregatsioon peamine patoloogiline tunnus, kuid selle virvendusarütmia kineetika uurimine on pikkade viivitusfaaside ja tavapäraste meetodite varieeruvuse tõttu endiselt keeruline. Ultraheliga juhitud fibrillide moodustumine kiirendab tuumade moodustumist, tagades kõrge reprodutseeritavuse ja väiksema varieeruvuse, mis on potentsiaalsete inhibiitorite sõelumiseks ja amüloidogeensete mehhanismide mõistmiseks ülioluline. Lisaks võimaldab UIP400MTP suure läbilaskevõime suuremahulisi uuringuid valkude valesti voltimise ja agregatsiooni kohta, hõlbustades terapeutiliste ainete avastamist, mis võivad moduleerida fibrillide moodustumist ja potentsiaalselt leevendada neurodegeneratiivset progresseerumist.

See uuring kehtestab ultraheli, kasutades UIP400MTP mitme süvendiga plaadi sonikaatorit, mis on väga tõhus meetod amüloidfibrilli moodustumise kiirendamiseks. Selle lähenemisviisi peamised eelised on järgmised:

• Virvendusarütmia viivitusaja dramaatiline lühenemine.
• Ühtlane ultraheliga kokkupuude kõigis kaevudes, võimaldades reprodutseeritavat fibrilli moodustumist.
• Suure läbilaskevõimega sõeluuringu võimekus, mis muudab selle sobivaks valkude amüloidogeensuse genoomiülesteks otsinguteks.

Integreerides ultraheli ThT fluorestsentsi tuvastamisega, pakub see meetod kiiret, skaleeritavat ja usaldusväärset platvormi amüloidfibrillatsiooni uurimiseks. Arvestades selle tõhusust ja suurt läbilaskevõimet, võib see lähenemisviis hõlbustada amüloidfibrillide lihtsat sünteesi biofüüsikalistes ja farmatseutilistes uuringutes, pakkudes paljutõotavat vahendit amüloididega seotud uuringuteks ja ravimite sõeluuringuteks.