Amüloidfibrillide moodustumine UIP400MTP mikroplaadi sonikaatoriga

Amüloidfibrillid, sarnaselt kristallidega, moodustuvad tuumastumise ja sellele järgneva kasvu kaudu. Tuumastumise kõrge vabaenergia barjääri tõttu toimub spontaanne amüloidfibrillide moodustumine aga alles pärast pikka lag-faasi. Ultraheli töötlus on kujunenud võimsaks vahendiks amüloidi tuumastumise esilekutsumiseks, kiirendades seeläbi oluliselt fibrillide moodustumist. Kombineerituna tioflaviin T (ThT) fluorestsentsi kasutava mikroplaadilugejaga võimaldab ultraheli töötlus amüloidfibrillide suure läbilaskevõimega tuvastamist mitmes proovis samaaegselt.

Ultrahelist esile kutsutud amüloidfibrillide moodustumine UIP400MTP mikroplaadi sonikaatoriga

UIP400MTP mitmekaevulise plaadi sonikaatoriga saab teadusuuringute jaoks kiiresti sünteesida suures koguses samaväärse kvaliteediga amüloidfibrille. See tõhus lähenemisviis võimaldab uurida valkude amüloidogeensust. See meetod hõlbustab kiiret ja reprodutseeritavat amüloidfibrillatsiooni, nagu on näidatud β2-mikroglobuliiniga (β2-m), amüloidogeense valguga, mis on seotud dialüüsiga seotud amüloidoosiga.

Lihtne katsemeetod: ultrahelist esile kutsutud amüloidfibrillatsioon

Fibrillide moodustumise esilekutsumiseks asetati 96-kaevuline mikroplaat UIP400MTP mitmekaevulise plaadi sonikaatori keskele, mis tagab ühtlase ultraheli kokkupuute kõigis kaevudes. Katsetingimused olid järgmised:

1. Iga kaev sisaldas 0,2 ml β2-mikroglobuliini lahust (0,3 mg/ml, pH 2,5), millele oli lisatud 5 μM ThT-d.
2. Plaati töödeldi ultraheli töötluse tsüklitena, näiteks 1-minutiline ultraheli töötlus, millele järgnes 9-minutiline paus.
3. Pärast sonikeerimist mõõdeti ThT fluorestsentsi mikroplaadilugejaga.

(vrd So et al., 2011)

Võrdlus tavapärase loksutamisega

Võrreldes traditsiooniliste loksutamismeetoditega lühendas ultraheli töötlus fibrillide moodustumise lag-faasi drastiliselt. Tavapärastes mikroplaadi loksutamistingimustes suurenes ThT fluorestsents 20 tunni möödudes vaid 1 kaevus 10-st. Seevastu tsükliliselt ultraheli töötlust kasutades (15 minutit sonikeerimist, millele järgnes 5 minutit rahuolekut) tuvastati ThT fluorestsentsi oluline tõus kohe pärast esimest sonikeerimist.

Fibrillatsioonikineetika kiire kiirenemine

So et al. (2011) saadud tulemused näitasid, et β2-mikroglobuliini spontaanset fibrillide moodustumist pH 2,5 juures saab ultraheli töötlusega kiirendada mitmest tunnist vaid 10–15 minutini.
Aatomjõumikroskoopia (AFM) kujutised kinnitasid, et fibrillid, mis tekkisid 10-minutilise ultraheli töötlusega iga 15 minuti järel, olid morfoloogiliselt eristamatud neist, mis tekkisid 1-minutilise ultraheli töötlusega iga 10 minuti järel. See toob esile ultrahelist esile kutsutud amüloidfibrillatsiooni reprodutseeritavuse ja töökindluse.

Amüloidfibrillide AFM-kujutised, mis tekkisid 1-minutilise ultraheli töötlusega iga 10 minuti järel (i), 10-minutilise sonikeerimisega iga 15 minuti järel (ii) ning seemnereaktsiooniga ilma ultraheli töötluseta (iii). Valge skaalariba tähistab 1 μm.
Uuring ja kujutised: ©So et al., 2011

Fibrillatsioon neutraalse pH tingimustes

Isegi neutraalse pH tingimustes saavutati fibrillide moodustumine 1,5-tunnise lag-aja järel, mis näitab, et ultraheli töötlus langetab oluliselt tuumastumise ja kasvu energeetilist barjääri. See toetab veelgi hüpoteesi, et amüloidfibrillatsioon on peamiselt füüsikaline reaktsioon, mida piirab suuresti tuumastumise energiabarjäär, mida ultraheli töötlus tõhusalt vähendab.

Mõju amüloidiga seotud haiguste uurimisele

Amüloidfibrillide lihtne ja usaldusväärne moodustamine UIP400MTP mikroplaadi sonikaatoriga on oluline Alzheimeri tõve (AD) uurimisele ja teistele amüloidiga seotud haigustele, nagu Parkinsoni tõbi, II tüüpi diabeet ja süsteemsed amüloidoosid. AD korral on amüloid-β (Aβ) agregatsioon patoloogia võtmetunnus, kuid selle fibrillatsioonikineetika uurimine on endiselt keeruline pikkade lag-faaside ja tavameetodite varieeruvuse tõttu. Ultrahelil põhinev fibrillide moodustumine kiirendab tuumastumist, tagades kõrge reprodutseeritavuse ja väiksema varieeruvuse, mis on oluline potentsiaalsete inhibiitorite sõeluuringuks ja amüloidogeensete mehhanismide mõistmiseks. Lisaks võimaldab UIP400MTP suur läbilaskevõime ulatuslikke uuringuid valkude valesti voltumise ja agregatsiooni kohta, hõlbustades terapeutiliste ainete avastamist, mis võivad moduleerida fibrillide moodustumist ja potentsiaalselt leevendada neurodegeneratiivset progresseerumist.

See uuring tõestab, et ultraheli töötlus UIP400MTP mitmekaevulise plaadi sonikaatoriga on väga tõhus meetod amüloidfibrillide moodustumise kiirendamiseks. Selle lähenemisviisi peamised eelised on järgmised:

• Fibrillatsiooni lag-aja drastiline lühenemine.
• Ühtlane ultraheli kokkupuude kõigis kaevudes, mis võimaldab reprodutseeritavat fibrillide moodustumist.
• Suure läbilaskevõimega sõeluuringu võimekus, mis muudab meetodi sobivaks valkude amüloidogeensuse genoomiülesteks otsinguteks.

Ultraheli töötluse ja ThT fluorestsentsi tuvastuse integreerimisega pakub see meetod kiiret, skaleeritavat ja usaldusväärset platvormi amüloidfibrillatsiooni uurimiseks. Arvestades selle tõhusust ja suurt läbilaskevõimet, võib see lähenemisviis hõlbustada amüloidfibrillide lihtsat sünteesi biofüüsikalisteks ja farmaatsiauuringuteks, pakkudes paljutõotavat vahendit amüloidiga seotud uuringuteks ja ravimite sõeluuringuks.