Producción ultrasónica de betaglucanos de esquizofilano altamente purificados

Schizophyallan es un β-glucano fúngico con propiedades inmunomoduladoras. Para ejercer efectos medicinales de elevada actividad, el esquizofilano debe tener un peso molecular bajo que permita mejorar su biodisponibilidad. Se ha demostrado que la ultrasonicación reduce el peso molecular del esquizofilano. Como método fiable y eficaz, la sonicación puede aplicarse fácilmente a la producción de esquizofilano de bajo peso molecular.

Hongos Schizophyllum y extracción ultrasónica de betaglucanos

Las especies del género Schizophyllum crecen en la naturaleza sobre árboles en descomposición después de las temporadas de lluvias. Los cuerpos fructíferos se recolectan durante la siguiente temporada seca. Las especies de Schizophyllum son ricas en compuestos bioquímicos como los glucanos y, por ello, se consumen especialmente en países tropicales como alimento y medicamento. Debido a sus propiedades inmunomoduladoras, antifúngicas, antineoplásicas y antivirales, Schizophyllum commune, también conocido como hongo de láminas partidas, ha atraído el interés de empresas biotecnológicas y farmacéuticas.
El polisacárido esquizofilano, también conocido como sizofiran, sonifilan o sizofilan, es el principal β-glucano presente en los hongos Schizophyllum, que proporcionan este β-glucano bioactivo de gran eficacia.
Los hongos Schizophyllum commune crecen en la naturaleza sobre árboles; el micelio también puede cultivarse en caldo de fermentación. Para aplicaciones farmacéuticas y cosméticas, el esquizofilano de bajo peso molecular es mucho más eficaz que el de alto peso molecular. Esto se debe a que el esquizofilano de bajo peso molecular presenta una biodisponibilidad y unas tasas de absorción significativamente mejores. Además, el esquizofilano de alto peso molecular suele plantear problemas en las aplicaciones, ya que sus soluciones acuosas presentan una elevada viscosidad.
La reducción de tamaño por ultrasonidos es una técnica muy eficaz y fiable para disminuir el peso molecular del esquizofilano y, con ello, mejorar la calidad de la molécula de β-glucano.

Protocolo para la producción de esquizofilano de bajo peso molecular

Dado que el esquizofilano de peso molecular presenta una biodisponibilidad y unas propiedades de aplicación considerablemente mejores, el equipo de investigación de Smirnou estudió la ultrasonicación para la escisión y la reducción de tamaño de la molécula del β-glucano esquizofilano.

Ultrasonicación del esquizofilano

El β-1.3(1.6)-glucano esquizofilano (SPG) se produjo mediante el cultivo sumergido del hongo S. commune en un biorreactor, utilizando sacarosa como sustrato.
Una vez finalizado el cultivo, el caldo de cultivo se diluyó con agua desmineralizada hasta alcanzar una concentración de esquizofilano de 2 g/L y se trató por ultrasonicación con el Procesador ultrasónico UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Alemania) en modo de recirculación con los siguientes parámetros y condiciones: caudal del medio de 50 mL/s, frecuencia de 20 kHz, potencia de salida de 2000 W, sonotrodo tipo BS2d22, amplificador de amplitud tipo B2-1.4 y amplitud del 100%. La temperatura del caldo de cultivo al inicio de la sonicación era de 25 °C. El caldo de cultivo tratado por ultrasonicación (aporte de energía específico de 100 Ws/mL) se filtró a través de un filtro de profundidad Seitz HS800 a una presión de 1,5 bar y a 40 °C. El esquizofilano tratado por ultrasonicación (uSPG) destinado a la caracterización química se precipitó del filtrado con una cantidad triple de alcohol isopropílico a temperatura de laboratorio y se secó a 60 °C durante 12h. Las soluciones de uSPG para los estudios inmunológicos se prepararon del siguiente modo: (1) el filtrado del caldo de cultivo tratado por ultrasonicación se sometió a diafiltración a través de un casete PES Pall Centramate de la serie T de 0,1m2 (umbral de corte de 100 kDa) a 0,8 bar, y la diafiltración continuó hasta que la conductividad del retenido fue de 20 μS/cm; (2) la solución se concentró mediante diafiltración hasta alcanzar una concentración de uSPG de 1 g/L y se esterilizó en autoclave a 120 °C/20 min. El uSPG desnaturalizado se preparó de forma similar, salvo que se añadió NaOH al filtrado del caldo de cultivo a una concentración de 0,2 M y la solución alcalinizada se incubó durante 30 min a temperatura de laboratorio antes de la diafiltración.

Métodos analíticos

El rendimiento de micelio se estimó gravimétricamente: el caldo de cultivo se diluyó con agua en una proporción de 1:4 y se centrifugó a 10.000 × g a 25 °C durante 20 min; el precipitado se lavó con una cantidad triple de agua, se secó a 60 °C y se pesó. El esquizofilano se precipitó del sobrenadante con una cantidad triple de alcohol isopropílico, se secó a 60 °C durante 24h y su rendimiento se determinó gravimétricamente. La pO2 del caldo de cultivo se midió mediante una sonda óptica Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Suiza).
La viscosidad dinámica del caldo de cultivo se midió con un HAAKE Visco Tester 6 L con husillos 1 L y 2 L a 4 °C y una velocidad de rotación de 30 rpm. La velocidad de filtración se calculó a partir del tiempo de filtración de 500 mL de caldo de cultivo a través de un filtro de profundidad Seitz HS800 (Pall, EE. UU.) de 200 × 200 mm a una presión de 1,5 bar y a 40 °C.
El peso molecular del uSPG se midió mediante SEC-MALLS en un sistema HPLC Alliance (Waters) con columnas PL aquagel OH60 y PL aquagel OH40 conectadas en serie, y el detector miniDAWN TREOS (Wyatt) se concentró mediante diafiltración hasta alcanzar una concentración de uSPG de 1 g/L y se esterilizó en autoclave a 120 °C/20 min. El uSPG desnaturalizado se preparó de forma similar, salvo que se añadió NaOH al filtrado del caldo de cultivo a una concentración de 0,2 M y la solución alcalinizada se incubó durante 30 min a temperatura de laboratorio antes de la diafiltración.

Resultados:
El tratamiento por ultrasonicación se aplicó directamente al caldo de cultivo de S. commune de 144-h con micelio para facilitar el procesamiento posterior del SPG.
 
Características del esquizofilano sonicado: El esquizofilano tratado por ultrasonicación (uSPG) se precipitó del filtrado del caldo de cultivo mediante alcohol y se caracterizó. Mediante SEC-MALLS se estimó que el Mw del uSPG era de aproximadamente 1 MDa. El peso molecular medio del esquizofilano obtenido por fermentación líquida es de aproximadamente 5 MDa, mientras que en el cultivo en estado sólido puede alcanzar hasta 10 MDa. Al comparar el peso molecular del esquizofilano tratado por ultrasonicación con los pesos moleculares del esquizofilano nativo sin tratar, se observa una reducción del peso molecular de entre 5 y 10 veces debida a la ultrasonicación.
El polisacárido sonicado uSPG contenía un 0,7%w/w de proteínas y un 1,0%w/w de residuo tras la calcinación. El hidrolizado de uSPG estaba compuesto por glucosa en más del 99%. Los resultados analíticos indican que la sonicación escinde aleatoriamente la cadena principal del β-glucano, mientras que las ramificaciones laterales permanecen intactas, lo que reduce el tamaño y el peso molecular del esquizofilano. Los estudios inmunológicos realizados con uSPG prácticamente libre de proteínas y endotoxinas mostraron que el esquizofilano de bajo Mw tratado por ultrasonicación presenta una marcada actividad inmunomoduladora.

 
Reducción de la viscosidad: La ultrasonicación produjo una disminución significativa de la viscosidad del caldo de cultivo. Durante la ultrasonicación, la viscosidad del caldo de cultivo cambió de forma no lineal: la disminución fue rápida al inicio de la ultrasonicación, pero posteriormente se ralentizó. Un aporte de energía específico de 100 Ws/mL fue suficiente para reducir la viscosidad del caldo de cultivo casi 7 veces.

Mejora de la filtración: El caldo de cultivo tratado con ultrasonidos pasó a través del filtro más rápidamente que el caldo de cultivo sin tratar (aporte de energía específico de 0 Ws/mL) con SPG de alto peso molecular. Además, la ultrasonicación redujo significativamente la pérdida de producto durante la filtración. El filtrado del caldo de cultivo sin tratar con SPG de alto peso molecular (aporte de energía específico de 0 Ws/mL) contenía 0,3 ± 0,07 g/L de SPG, mientras que la concentración de SPG antes de la filtración en profundidad era de 2 g/L. En cambio, el filtrado del caldo de cultivo tratado por ultrasonicación con 100 Ws/mL contenía SPG a una concentración de 2,2 ± 0,2 g/L, lo que corresponde a una pérdida de producto prácticamente nula.

Conclusión: En su conclusión, el equipo de investigación señala que el procesamiento ultrasónico es una tecnología eficiente para la fabricación de esquizofilano de bajo peso molecular, que posteriormente puede utilizarse en cosmética y medicina. La ultrasonicación, cuando se aplica al caldo de cultivo completo con micelio, aporta ciertas ventajas a la producción de esquizofilano. Reduce las pérdidas de producto durante el procesamiento posterior y permite producir polisacáridos altamente purificados gracias al uso eficiente de la ultrafiltración.
Además, los investigadores observaron que el procesamiento ultrasónico del esquizofilano puede ampliarse de escala fácilmente. Una unidad del desintegrador ultrasónico UIP2000hdT de la planta piloto procesó 1 litro de caldo de cultivo en 110 s en modo de flujo. La productividad del sistema puede aumentarse fácilmente mediante la conexión en serie de unidades de ultrasonidos adicionales.

 
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Equipos ultrasónicos de alto rendimiento para el procesamiento de glucanos fúngicos

La fragmentación de polisacáridos como los glucanos, así como de otros compuestos bioactivos como la quitina y el quitosano, puede realizarse de forma fiable con los equipos ultrasónicos de alto rendimiento de Hielscher. Nuestros ultrasonicadores pueden proporcionar amplitudes elevadas, permiten controlar con precisión los parámetros del proceso y pueden funcionar 24/7 bajo cargas elevadas y en entornos exigentes. La gama de equipos de Hielscher Ultrasonics cumple estos requisitos de forma fiable. Además de su excelente rendimiento ultrasónico, los ultrasonicadores de Hielscher ofrecen una elevada eficiencia energética, lo que supone una ventaja económica significativa – especialmente cuando se utilizan en la producción comercial a gran escala.
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La pantalla digital en color, la opción de preconfigurar los ciclos de sonicación, el registro automático de datos en una tarjeta SD integrada, el control remoto desde el navegador y muchas otras funciones garantizan el máximo control del proceso y facilidad de uso. Gracias también a su robustez y a su capacidad para soportar cargas elevadas, los sistemas ultrasónicos de Hielscher son equipos fiables para el trabajo continuo en producción.
La reducción del peso molecular de β-glucanos como el esquizofilano requiere ultrasonidos potentes para lograr la escisión deseada y obtener un producto final de esquizofilano de alta calidad que pueda utilizarse en aplicaciones farmacéuticas.
 
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La siguiente tabla le ofrece una indicación de la capacidad aproximada de procesamiento de nuestros ultrasonicadores: