Fragmentación de alfa-sinucleína con el sonicador VialTweeter
Las fibrillas y cintas de α-sinucleína se fragmentan en la investigación científica para generar fragmentos de fibrillas más pequeños o incluso moléculas de proteína individuales, que pueden analizarse más fácilmente mediante diversas técnicas experimentales. El VialTweeter Sonicator es uno de los ultrasonidos más utilizados para la fragmentación eficaz y fiable de la alfa-sinucleína.
α-Sinucleína en la investigación
Las fibrillas de alfa-sinucleína son agregados proteicos fuertemente asociados a trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Parkinson y ciertas formas de demencia, incluida la demencia con cuerpos de Lewy. La investigación centrada en las fibrillas de alfa-sinucleína pretende comprender su papel en la progresión de la enfermedad y desarrollar posibles intervenciones terapéuticas. Al descomponer las fibrillas de alfa-sinucleína en fragmentos más pequeños, los investigadores pueden estudiar sus características estructurales específicas. Por ejemplo, fragmentar las fibrillas de alfa-sinucleína permite investigar sus interacciones con otras moléculas, como proteínas, lípidos o moléculas pequeñas. Al producir fragmentos más pequeños, se pueden sondear más eficazmente los sitios de unión y la afinidad por estos socios interactivos. Los fragmentos y cintas de α-Syn más pequeños también pueden mostrar una toxicidad y unos efectos bioquímicos alterados. Por lo tanto, es crucial disponer de una técnica de fragmentación fiable y eficiente, que produzca resultados reproducibles en un tratamiento de muestras rápido y sencillo.
Fragmentación ultrasónica Alpha-Syn: El sonicador VialTweeter es el sistema de preparación de muestras por ultrasonidos establecido que sonicará hasta 10 viales simultáneamente en exactamente las mismas condiciones. Los ajustes programables permiten la repetición sencilla y rápida de los mismos experimentos, lo que proporciona resultados altamente fiables y reproducibles en la fragmentación de fibrillas de alfa-sinucleína.

Sonicador VialTweeter para la fragmentación ultrasónica simultánea de múltiples muestras de alfa-sinucleína.
Preparación de muestras de α-sinucleína con un sonicador
Un método para estudiar las fibrillas de alfa-sinucleína consiste en extraerlas y fragmentarlas mediante técnicas como la sonicación. La sonicación es un proceso que utiliza ondas ultrasónicas de alta intensidad y baja frecuencia para romper los agregados de proteínas y liberar fibrillas más pequeñas o moléculas de proteínas individuales. El sonicador VialTweeter es un dispositivo de uso común en los estudios de investigación relacionados con la α-sinucleína para este fin.
Numerosos estudios de investigación describen protocolos precisos de preparación de muestras para la sonicación de fibrillas de alfa-sinucleína, que utilizan el VialTweeter de Hielscher para una fragmentación eficiente y fiable de las fibrillas de α-sinucleína. Al fragmentar las fibrillas por ultrasonidos, los investigadores pueden analizar los productos resultantes y examinar su estructura, toxicidad e interacciones con otras moléculas. Esta investigación aporta importantes conocimientos sobre los mecanismos subyacentes a la neurodegeneración y puede identificar nuevas dianas terapéuticas. Los protocolos de sonicación de α-sinucleína bien establecidos que utilizan el sonicador VialTweeter permiten obtener resultados fiables y reproducibles.

Imágenes superiores: fibrillas de alfa-sinucleína no fragmentadas
Imágenes inferiores: Fibrillas de alfa-sinucleína fragmentadas por ultrasonidos con el sonicador VialTweeter.
(estudio e imágenes: ©Dieriks et al., 2022)
Fragmentación ultrasónica de fibrillas de α-sinucleína – Protocolos
Dado que numerosos investigadores utilizan el sonicador VialTweeter como técnica de fragmentación preferida para producir fragmentos uniformes de fibrillas de α-sinucleína, se dispone fácilmente de protocolos establecidos. A continuación encontrará algunos protocolos de fragmentación ejemplares.
Preparación de semillas ClearTau: Las fibrillas ClearTau se diluyeron a 10 μM en dH2O y se sonicaron al 70 % de amplitud durante 50 s con un ciclo de 1 s ON 1 s OFF en el tubo utilizando el sonicador UP200St con VialTweeter. Las semillas se caracterizaron mediante microscopía electrónica.
Medición de la fluorescencia del ThS: Las fibrillas ClearTau se diluyeron a 2,5 μM en dH2O y se sonicaron a una amplitud del 70 % durante 50 s con un ciclo de 1 s ON 1 s OFF en el tubo utilizando UP200St con VialTweeter. Como control se utilizó 2,5 μM de monómero Tau 4R2N de longitud completa. A la reacción de 100 μl se añadieron 100 μl de ThS (10 μM), obteniéndose concentraciones finales de proteína de 1,25 μM. Se midió la fluorescencia de ThS en un solo punto temporal utilizando placas de fondo transparente de 96 pocillos configuradas en un lector de microplacas FLUOstar Omega con excitación a 445 nm y se registró la emisión a 485 nm.
(cf. Limorenko et al., 2023)
Longitud uniforme de la α-sinucleína mediante sonicación: La heterogeneidad de longitud de las fibrillas y cintas de α-syn se redujo mediante sonicación durante 20 min en hielo en tubos Eppendorf de 2 ml en un VialTweeter ajustado a una amplitud del 75%, pulsos de 0,5 s.
(cf. Bousset et al., 2013)
Se llevó a cabo el control de calidad de la a-Syn humana recombinante monomérica WT o S129A y de los polimorfos fibrilares que generan, así como el de la a-Syn 1-110. Posteriormente, los polimorfos fibrilares se fragmentaron por sonicación durante 20 min en tubos Eppendorf de 2 ml en el ultrasonicador VialTweeter para generar partículas fibrilares con un tamaño medio de 42-52 nm aptas para endocitosis.
(cf. Shrivastava et al., 2020)

Caracterización de cinco polimorfos fibrilares de α-Syn. (A) Se muestran micrografías electrónicas de transmisión de polimorfos fibrilares de α-Syn teñidos negativamente, cintas, fibrillas-91, fibrillas-65 y fibrillas-110 antes (carril superior) y después de la fragmentación con el VialTweeter (carril inferior). (B) Se muestra la distribución de longitud de los polimorfos fibrilares fragmentados. Se indica el número (n) de conjuntos fibrilares de los que se obtuvieron los histogramas.
(estudio e imágenes: Shrivastava et al., 2020)
Las fibrillas de α-Syn se fragmentaron por sonicación durante 20 min en tubos Eppendorf de 2 ml en un VialTweeter para generar partículas fibrilares con un tamaño medio de 42-52 nm según se evaluó mediante análisis TEM.
(cf. Negrini et al., 2022)
Las fibrillas resuspendidas91 (en PBS) se fragmentaron antes de añadirlas a los cultivos celulares mediante sonicación durante 20 min en tubos Eppendorf de 2 mL utilizando el sonicador Vial Tweeter, se tomaron alícuotas, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron hasta su uso a -80 ̊C.
(cf. Vajhøj et al., 2021)
VialTweeter y sonicadores de laboratorio para la fragmentación de α-Syn
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Hielscher Ultrasonics es una empresa con certificación ISO y pone especial énfasis en los ultrasonidos de alto rendimiento con tecnología punta y facilidad de uso. Por supuesto, los sonicadores de Hielscher cumplen la normativa CE y los requisitos de UL, CSA y RoHs.
La tabla siguiente le ofrece una indicación de la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros ultrasonicadores de tamaño laboratorio:
Dispositivos recomendados | Volumen del lote | Tasa de flujo |
---|---|---|
UIP400MTP | placas multipocillo / microtituladoras | n.a. |
CupHorn ultrasónico | CupHorn para viales o vaso de precipitados | n.a. |
GDmini2 | reactor ultrasónico de microflujo | n.a. |
VialTweeter | 0,5 a 1,5 mL | n.a. |
UP100H | 1 a 500 mL | 10 a 200 mL/min. |
UP200Ht, UP400St | 10 a 2000 mL | 20 a 400 mL/min. |
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El VialTweeter se utiliza habitualmente para fragmentar la fibrilla de alfa-sinucleína como paso de la preparación preanalítica de la muestra
Literatura / Referencias
- Emil Dandanell Agerschou, Marie P. Schützmann, Nikolas Reppert, Michael M. Wördehoff, Hamed Shaykhalishahi, Alexander K. Buell, Wolfgang Hoyer (2021): β-Turn exchanges in the α-synuclein segment 44-TKEG-47 reveal high sequence fidelity requirements of amyloid fibril elongation. Biophysical Chemistry, Volume 269, 2021.
- Bousset, L., Pieri, L., Ruiz-Arlandis, G. et al. (2013): Structural and functional characterization of two alpha-synuclein strains. Nature Communications 4, 2575 (2013).
- Vajhøj, Charlott; Schmid, Benjamin; Alik, Ania; Melki, Ronald; Fog, Karina; Holst, Bjørn; Stummann, Tina (2021): Establishment of a human induced pluripotent stem cell neuronal model for identification of modulators of A53T α-synuclein levels and aggregation. PLOS ONE 16, 2021.
- Dieriks B.V.; Highet B.; Alik A.; Bellande T.; Stevenson T.J.; Low V.; Park T.I.; Correia J.; Schweder P.; Faull R.L.M.; Melki R.; Curtis M.A.; Dragunow M. (2022): Human pericytes degrade diverse α-synuclein aggregates. PLoS One, Nov 18;17(11), 2022.
- Amulya Nidhi Shrivastava, Luc Bousset, Marianne Renner, Virginie Redeker, Jimmy Savistchenko, Antoine Triller, Ronald Melki (2020): Differential Membrane Binding and Seeding of Distinct α-Synuclein Fibrillar Polymorphs. Biophysical Journal, Volume 118, Issue 6, 2020. 1301-1320.
- Negrini M, Tomasello G, Davidsson M, Fenyi A, Adant C, Hauser S, Espa E, Gubinelli F, Manfredsson FP, Melki R, Heuer A. (2022): Sequential or Simultaneous Injection of Preformed Fibrils and AAV Overexpression of Alpha-Synuclein Are Equipotent in Producing Relevant Pathology and Behavioral Deficits. Journal of Parkinsons Disease 12(4), 2022. 1133-1153.
- Limorenko G, Tatli M, Kolla R, Nazarov S, Weil MT, Schöndorf DC, Geist D, Reinhardt P, Ehrnhoefer DE, Stahlberg H, Gasparini L, Lashuel HA (2023): Fully co-factor-free ClearTau platform produces seeding-competent Tau fibrils for reconstructing pathological Tau aggregates. Nature Communications 4;14(1), July 2023.

Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento de laboratorio a tamaño industrial.