Fragmentación de alfa-sinucleína con el sonicador VialTweeter

En la investigación científica, las fibrillas y cintas de α-sinucleína se fragmentan para generar fragmentos de fibrillas más pequeños o incluso moléculas de proteína individuales, que pueden analizarse más fácilmente mediante diversas técnicas experimentales. El sonicador VialTweeter es uno de los equipos de ultrasonidos más utilizados para la fragmentación eficiente y fiable de alfa-sinucleína.

La α-sinucleína en la investigación

Las fibrillas de alfa-sinucleína son agregados proteicos estrechamente asociados con trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Parkinson y ciertas formas de demencia, incluida la demencia con cuerpos de Lewy. La investigación centrada en las fibrillas de alfa-sinucleína busca comprender su papel en la progresión de la enfermedad y desarrollar posibles intervenciones terapéuticas. Al descomponer las fibrillas de alfa-sinucleína en fragmentos más pequeños, los investigadores pueden estudiar sus características estructurales específicas. Por ejemplo, la fragmentación de las fibrillas de alfa-sinucleína permite investigar sus interacciones con otras moléculas, como proteínas, lípidos o moléculas pequeñas. Al producir fragmentos más pequeños, se pueden estudiar con mayor eficacia los sitios de unión y la afinidad por estas moléculas con las que interactúan. Las fibrillas y cintas de α-Syn más pequeñas también pueden presentar cambios en su toxicidad y sus efectos bioquímicos. Por tanto, es fundamental disponer de una técnica de fragmentación fiable y eficiente que produzca resultados reproducibles mediante un tratamiento rápido y sencillo de las muestras.
Fragmentación ultrasónica de Alpha-Syn: El sonicador VialTweeter es un sistema consolidado de preparación de muestras por ultrasonidos que permite sonicar hasta 10 viales simultáneamente en condiciones exactamente iguales. Los ajustes programables permiten repetir los mismos experimentos de forma sencilla y rápida, lo que proporciona resultados muy fiables y reproducibles en la fragmentación de fibrillas de alfa-sinucleína.

Preparación de muestras de α-sinucleína con un sonicador

Una de las estrategias para estudiar las fibrillas de alfa-sinucleína consiste en extraerlas y fragmentarlas mediante técnicas como la sonicación. La sonicación es un proceso que utiliza ondas ultrasónicas de alta intensidad y baja frecuencia para romper y descomponer agregados proteicos, lo que libera fibrillas más pequeñas o moléculas de proteína individuales. El sonicador VialTweeter es un equipo utilizado habitualmente para este fin en estudios de investigación sobre la α-sinucleína.

Numerosos estudios de investigación describen protocolos precisos de preparación de muestras mediante sonicación de fibrillas de alfa-sinucleína que utilizan el VialTweeter de Hielscher para fragmentar las fibrillas de α-sinucleína de forma eficiente y fiable. Al fragmentar las fibrillas mediante ultrasonidos, los investigadores pueden analizar los productos resultantes y examinar su estructura, toxicidad e interacciones con otras moléculas. Esta investigación aporta información importante sobre los mecanismos subyacentes a la neurodegeneración y puede permitir identificar nuevas dianas terapéuticas. Los protocolos consolidados de sonicación de α-sinucleína con el sonicador VialTweeter permiten obtener resultados fiables y reproducibles.

Imágenes superiores: fibrillas de alfa-sinucleína sin fragmentar
Imágenes inferiores: fibrillas de alfa-sinucleína fragmentadas mediante ultrasonidos con el sonicador VialTweeter
(estudio e imágenes: ©Dieriks et al., 2022)

Fragmentación ultrasónica de fibrillas de α-sinucleína – Protocolos

Dado que numerosos investigadores utilizan el sonicador VialTweeter como técnica de fragmentación preferida para producir fragmentos uniformes de fibrillas de α-sinucleína, existen protocolos consolidados fácilmente accesibles. A continuación se presentan algunos ejemplos de protocolos de fragmentación.
 

 
Preparación de semillas de ClearTau: Las fibrillas de ClearTau se diluyeron hasta 10 μM en dH2O y se sonicaron dentro del tubo a una amplitud del 70 % durante 50 s, con un ciclo de 1 s de activación y 1 s de desactivación, utilizando el sonicador UP200St con VialTweeter. Las semillas se caracterizaron mediante microscopía electrónica.
Medición de la fluorescencia de ThS: Las fibrillas de ClearTau se diluyeron hasta 2,5 μM en dH2O y se sonicaron dentro del tubo a una amplitud del 70 % durante 50 s, con un ciclo de 1 s de activación y 1 s de desactivación, utilizando UP200St con VialTweeter. Se utilizó monómero de Tau 4R2N de longitud completa a 2,5 μM como control. A la reacción de 100 μl se añadieron 100 μl de ThS (10 μM), lo que dio lugar a concentraciones finales de proteína de 1,25 μM. La fluorescencia de ThS se midió en un único punto temporal utilizando placas de 96 pocillos con fondo transparente colocadas en un lector de microplacas FLUOstar Omega, con excitación a 445 nm, y se registró la emisión a 485 nm.
(cf. Limorenko et al., 2023)
 
Longitud uniforme de α-sinucleína mediante sonicación: La heterogeneidad de longitud de las fibrillas y cintas de α-syn se redujo mediante sonicación durante 20 min sobre hielo en tubos Eppendorf de 2-ml, utilizando un VialTweeter ajustado a una amplitud del 75%, con pulsos de 0,5 s.
(cf. Bousset et al., 2013)
 
Se realizó el control de calidad de a-Syn humana recombinante monomérica WT o S129A y de los polimorfos fibrilares que generan, así como de a-Syn 1–110. Posteriormente, los polimorfos fibrilares se fragmentaron mediante sonicación durante 20 min en tubos Eppendorf de 2-mL con el equipo de ultrasonidos VialTweeter para generar partículas fibrilares con un tamaño medio de 42–52 nm, adecuadas para la endocitosis.
(cf. Shrivastava et al., 2020)
 

Caracterización de cinco polimorfos fibrilares de α-Syn. (A) Se muestran micrografías de microscopía electrónica de transmisión de los polimorfos fibrilares de α-Syn fibrils, ribbons, fibrils-91, fibrils-65 y fibrils-110, con tinción negativa, antes (fila superior) y después de la fragmentación con el VialTweeter (fila inferior). (B) Se muestra la distribución de longitudes de los polimorfos fibrilares fragmentados. Se indica el número (n) de ensamblajes fibrilares a partir de los cuales se obtuvieron los histogramas.
(estudio e imágenes: Shrivastava et al., 2020)

 
Las fibrillas de α-Syn se fragmentaron mediante sonicación durante 20 min en tubos Eppendorf de 2 ml con un VialTweeter para generar partículas fibrilares con un tamaño medio de 42–52 nm, según el análisis mediante TEM.
(cf. Negrini et al., 2022)
 
Las fibrils91 resuspendidas (en PBS) se fragmentaron antes de añadirlas a los cultivos celulares mediante sonicación durante 20 min en tubos Eppendorf de 2 mL con el sonicador Vial Tweeter, se distribuyeron en alícuotas, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ̊C hasta su uso.
(cf. Vajhøj et al., 2021)
 

VialTweeter y sonicadores de laboratorio para la fragmentación de α-Syn

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