PMCA para la detección de alto rendimiento de priones con el sonicador UIP400MTP

El sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP ofrece una potente solución para la preparación de muestras de alto rendimiento en la amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMCA). Al proporcionar una distribución uniforme de la energía en múltiples pocillos y mantener unos parámetros de sonicación precisos, este sistema permite el procesamiento simultáneo de numerosas muestras con una reproducibilidad excepcional. Estas capacidades son fundamentales para optimizar la PMCA para detectar priones a bajas concentraciones en muestras biológicas difíciles, como la saliva, donde los inhibidores del ensayo pueden oscurecer los resultados.

Las enfermedades priónicas, como la caquexia crónica en los cérvidos y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en los humanos, son trastornos neurodegenerativos causados por proteínas priónicas mal plegadas (PrP^Sc). Estas enfermedades suelen implicar bajos niveles de priones infecciosos en fluidos corporales como la saliva, la sangre y la orina, lo que complica el diagnóstico y la investigación. La transmisión horizontal de la caquexia crónica a través de priones diseminados en matrices ambientales tiene implicaciones especialmente importantes para la gestión de la fauna salvaje y la salud ecológica. Del mismo modo, en enfermedades como la de Creutzfeldt-Jakob, la amplificación fiable de proteínas priónicas mal plegadas a partir de muestras humanas es crucial para avanzar en el diagnóstico y comprender la progresión de la enfermedad.

La aplicación de un protocolo PMCA modificado permite eludir los inhibidores habituales del ensayo (por ejemplo, las mucinas de la saliva) y lograr una alta sensibilidad en la detección de priones que, de otro modo, serían indetectables o ambiguos mediante técnicas como la conversión inducida por temblor en tiempo real (RT-QuIC). Estos avances mejoran la detección de priones en diversas enfermedades, lo que convierte al PMCA en una herramienta indispensable para la investigación y el diagnóstico de priones. El sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP facilita la sonicación PMCA de alto rendimiento de numerosas muestras en microplacas (por ejemplo, placas de 6, 24 o 96 pocillos) o viales en una gradilla de tubos.

Protocolo de alto rendimiento para la amplificación cíclica del mal plegamiento de proteínas (PMCA)

El siguiente protocolo permite el procesamiento eficaz de un elevado número de muestras en las mismas condiciones exactas para obtener resultados de investigación sólidos.

preparación de muestras de laboratorio

Material de partida:
Prepara las muestras:

• Resuspender los pellets de extracción de sarkosilo en sustrato PMCA.
• Pinchar directamente homogeneizados cerebrales o muestras de sangre con semillas de priones.

Sustrato:

• Utilizar un homogeneizado cerebral al 10% (p/p) preparado a partir de ratones transgénicos que sobreexpresen PrP.^C (por ejemplo, ratones Tg).
• Homogeneizar el tejido cerebral en:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Almacenar el sustrato a -80ºC hasta su uso.

Preparación de muestras en microplacas o tubos:
Tubos:

• Añadir 90 μL de sustrato de homogeneizado cerebral y sembrar con 10 μL de muestra (por ejemplo, sangre, homogeneizado cerebral o pellet de sarkosil).
• Colocar 3 perlas de teflón (de 1,59 mm o 2,38 mm de diámetro) en cada tubo de 0,2 mL.
• Monte los tubos en un bastidor compatible con el sonicador UIP400MTP.

Microplaca de 6 pocillos:

• Añadir 5 mL de sustrato homogeneizado de cerebro y sembrar con 500 μL de muestra por pocillo.
• Añadir 3 perlas de teflón a cada pocillo.

Procedimiento PMCA

Colocación:
Colocar la gradilla de tubos o la microplaca de 6 pocillos en el sonicador UIP400MTP siguiendo las instrucciones del fabricante.

Programa de ciclismo:
Realice 144 ciclos PMCA de la siguiente manera:

• Incubación: 29 minutos y 30 segundos a 37°C.
• Sonicación: 30 segundos al 60% de amplitud.
• Monitorice la temperatura: Utilice el sensor de temperatura enchufable para monitorizar la temperatura de la muestra y programe el UIP400MTP a una temperatura máxima de 48-50°C.

Rondas posteriores:
Tras completar la primera ronda de 144 ciclos, transfiera una alícuota del material amplificado:

• Diluir 10 veces en sustrato fresco de homogeneizado de cerebro de ratón transgénico.
• Realizar 96 ciclos PMCA para las rondas siguientes, manteniendo los mismos parámetros de sonicación.
• Continúe durante el número deseado de rondas (normalmente hasta 5).

Detección de PrP^Sc

1. Digestión con proteinasa K:
   – Tratar las muestras con Proteinasa K (50 μg/mL) a 37°C durante 1 hora.
   – Finalizar la digestión añadiendo tampón SDS-muestra y hervir durante 10 minutos.
2. Análisis Western Blot:
   – Analizar las muestras digeridas utilizando:
   – 6H4 o anticuerpos anti-PrP PRC1.
   – Realizar SDS-PAGE y transferir a membranas de PVDF para su detección.

 

 

Procese más muestras para obtener resultados más sólidos

El sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP mejora significativamente la eficiencia y la escalabilidad de la amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMCA), abordando la naturaleza tradicionalmente lenta del procedimiento. Al permitir el procesamiento simultáneo de hasta 96 muestras en una placa de 96 pocillos, el sistema agiliza los flujos de trabajo de PMCA al tiempo que mantiene unas condiciones de sonicación precisas y uniformes en todos los pocillos. Esta capacidad de alto rendimiento minimiza la manipulación manual, reduce los pasos laboriosos y garantiza la reproducibilidad, lo que lo convierte en una herramienta indispensable para la investigación de priones. Tanto si se investiga la enfermedad de desgaste crónico como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, el UIP400MTP facilita los estudios a gran escala con una mayor eficiencia, permitiendo a los investigadores satisfacer las demandas de las aplicaciones diagnósticas y científicas modernas.

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Literatura / Referencias

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
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