PMCA para la detección de priones de alto rendimiento con el sonicador UIP400MTP

El sonicador para placas multipocillo UIP400MTP ofrece una potente solución para la preparación de muestras de alto rendimiento en la amplificación cíclica del plegamiento incorrecto de proteínas (PMCA). Al distribuir la energía uniformemente entre múltiples pocillos y mantener parámetros de sonicación precisos, este sistema permite procesar numerosas muestras simultáneamente con una reproducibilidad excepcional. Estas capacidades son fundamentales para optimizar la PMCA y detectar priones a bajas concentraciones en muestras biológicas complejas, como la saliva, donde los inhibidores del ensayo pueden enmascarar los resultados.

Las enfermedades priónicas, como la enfermedad de desgaste crónico (CWD) en cérvidos y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) en humanos, son trastornos neurodegenerativos causados por proteínas priónicas mal plegadas (PrP^Sc). Estas enfermedades suelen presentar niveles bajos de priones infecciosos en fluidos corporales, como saliva, sangre y orina, lo que dificulta el diagnóstico y la investigación. La transmisión horizontal de la CWD mediante priones liberados en matrices ambientales tiene implicaciones especialmente importantes para la gestión de la fauna silvestre y la salud de los ecosistemas. Asimismo, en enfermedades como la de Creutzfeldt-Jakob, la amplificación fiable de proteínas priónicas mal plegadas a partir de muestras humanas es crucial para avanzar en el diagnóstico y comprender la progresión de la enfermedad.

La aplicación de un protocolo de PMCA modificado permite superar la acción de los inhibidores habituales del ensayo (p. ej., las mucinas de la saliva) y lograr una alta sensibilidad en la detección de priones que, de otro modo, serían indetectables o darían resultados ambiguos con técnicas como la conversión inducida por agitación en tiempo real (RT-QuIC). Estos avances mejoran la detección de priones en diversas enfermedades y convierten la PMCA en una herramienta indispensable para la investigación y el diagnóstico de enfermedades priónicas. El sonicador para placas multipocillo UIP400MTP facilita la PMCA de alto rendimiento al sonicar numerosas muestras en microplacas (p. ej., placas de 6, 24 o 96 pocillos) o viales en una gradilla para tubos.

Protocolo de amplificación cíclica del plegamiento incorrecto de proteínas (PMCA) de alto rendimiento

El siguiente protocolo permite procesar eficientemente un gran número de muestras en condiciones exactamente iguales para obtener resultados de investigación sólidos.

Preparación de muestras

Material de partida:
Prepare las muestras mediante:

• La resuspensión de los sedimentos de extracción con sarkosyl en sustrato de PMCA.
• La adición directa de semillas priónicas a homogeneizados cerebrales o muestras de sangre.

Sustrato:

• Utilice un homogeneizado cerebral al 10% (wt/vol) preparado a partir de ratones transgénicos que sobreexpresen PrP^C (p. ej., ratones Tg).
• Homogeneice el tejido cerebral en:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Conserve el sustrato a -80ºC hasta su uso.

Preparación de las muestras en microplaca o tubos:
Tubos:

• Añada 90 μL de sustrato de homogeneizado cerebral e inocule con 10 μL de muestra (p. ej., sangre, homogeneizado cerebral o sedimento de sarkosyl).
• Coloque 3 perlas de Teflon (de 1,59-mm o 2,38-mm de diámetro) en cada tubo de 0,2 mL.
• Coloque los tubos en una gradilla compatible con el sonicador UIP400MTP.

Microplaca de 6 pocillos:

• Añada 5 mL de sustrato de homogeneizado cerebral e inocule con 500 μL de muestra por pocillo.
• Añada 3 perlas de Teflon a cada pocillo.

Procedimiento de PMCA

Colocación:
Coloque la gradilla para tubos o la microplaca de 6 pocillos en el sonicador UIP400MTP siguiendo las instrucciones del fabricante.

Programa de ciclos:
Realice 144 ciclos de PMCA de la siguiente manera:

• Incubación: 29 minutos y 30 segundos a 37 °C.
• Sonicación: 30 segundos al 60% de amplitud.
• Controle la temperatura: utilice el sensor de temperatura conectable para controlar la temperatura de las muestras y programe el UIP400MTP con una temperatura máxima de 48–50 °C.

Rondas posteriores:
Tras completar la primera ronda de 144 ciclos, transfiera una alícuota del material amplificado:

• Diluya 10 veces en sustrato fresco de homogeneizado cerebral de ratón transgénico.
• Realice 96 ciclos de PMCA en las rondas posteriores, manteniendo los mismos parámetros de sonicación.
• Continúe hasta completar el número de rondas deseado (habitualmente hasta 5).

Detección de PrP^Sc

1. Digestión con proteinasa K:
   – Trate las muestras con proteinasa K (50 μg/mL) a 37 °C durante 1 hora.
   – Detenga la digestión añadiendo tampón de muestras con SDS y hirviendo durante 10 minutos.
2. Análisis mediante Western blot:
   – Analice las muestras digeridas utilizando:
   – Anticuerpos anti-PrP 6H4 o PRC1.
   – Realice SDS-PAGE y transfiera a membranas de PVDF para la detección.

 

El Hielscher UIP400MTP es el sonicador más versátil para sus placas multipocillo, placas de PCR o tubos de muestras. Con una potencia de sonicación continua de 400 vatios, está diseñado para aplicaciones como la lisis celular, la emulsificación, la extracción de proteínas, la fragmentación de ADN / ARN, la desaglomeración, la extracción de FFPE, el desprendimiento de células y biopelículas o la emulsificación. El UIP400MTP no es un baño ultrasónico. Es un sonotrodo de copa de alta intensidad para sonicación focalizada. Este potente sonicador sin contacto proporciona una sonicación uniforme en todos los pocillos de su placa multipocillo estándar. Permite controlar con precisión la amplitud, la potencia y el funcionamiento por pulsos. Un temporizador integrado y una sonda de temperatura garantizan resultados uniformes. El sonicador de placas UIP400MTP refrigera las muestras mediante un baño de agua (con enfriador externo opcional).

 

Procese más muestras para obtener resultados más sólidos

El sonicador para placas multipocillo UIP400MTP mejora significativamente la eficiencia y la escalabilidad de la amplificación cíclica del plegamiento incorrecto de proteínas (PMCA), al abordar el tiempo que tradicionalmente requiere este procedimiento. Al permitir el procesamiento simultáneo de hasta 96 muestras en una placa de 96 pocillos, el sistema agiliza los flujos de trabajo de PMCA y mantiene condiciones de sonicación precisas y uniformes en todos los pocillos. Esta capacidad de alto rendimiento minimiza la manipulación manual, reduce las etapas que requieren mucho trabajo y garantiza la reproducibilidad, lo que lo convierte en una herramienta indispensable para la investigación de priones. Tanto en la investigación de la enfermedad de desgaste crónico como de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, el UIP400MTP facilita estudios a gran escala con mayor eficiencia y permite a los investigadores satisfacer las exigencias de las aplicaciones diagnósticas y científicas modernas.

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Bibliografía / Referencias

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