Formación de fibrillas amiloides mediante el sonicador de microplacas UIP400MTP

Las fibrillas amiloides, al igual que los cristales, se forman mediante un proceso de nucleación y posterior crecimiento. Sin embargo, debido a la elevada barrera de energía libre de la nucleación, la formación espontánea de fibrillas amiloides solo se produce tras una fase de latencia prolongada. La ultrasonicación se ha consolidado como una herramienta potente para inducir la nucleación amiloide, lo que acelera significativamente la formación de fibrillas. Combinada con un lector de microplacas que utiliza la fluorescencia de tioflavina T (ThT), la ultrasonicación permite detectar fibrillas amiloides con alto rendimiento en múltiples muestras simultáneamente.

Formación de fibrillas amiloides inducida por ultrasonidos con el sonicador de microplacas UIP400MTP

Con el sonicador de placas multipocillo UIP400MTP, se pueden sintetizar rápidamente grandes cantidades de fibrillas amiloides de calidad uniforme para fines de investigación. Este método eficiente permite estudiar la amiloidogenicidad de las proteínas. La técnica facilita una fibrilación amiloide rápida y reproducible, como se ha demostrado con la β2-microglobulina (β2-m), una proteína amiloidogénica asociada a la amiloidosis relacionada con la diálisis.

Procedimiento experimental sencillo: fibrilación amiloide inducida por ultrasonidos

Para inducir la formación de fibrillas, se colocó una microplaca de 96 pocillos en el centro del sonicador de placas multipocillo UIP400MTP, que garantiza una exposición uniforme a los ultrasonidos en todos los pocillos. Las condiciones experimentales fueron las siguientes:

1. Cada pocillo contenía 0,2 ml de solución de β2-microglobulina (0,3 mg/ml, pH 2,5) suplementada con 5 μM de ThT.
2. La placa se sometió a ciclos de ultrasonicación, como 1 minuto de ultrasonicación seguido de 9 minutos de pausa.
3. Tras la sonicación, se midió la fluorescencia de ThT con un lector de microplacas.

(véase So et al., 2011)

Comparación con la agitación convencional

En comparación con los métodos tradicionales de agitación, la ultrasonicación redujo drásticamente la fase de latencia de la formación de fibrillas. En condiciones convencionales de agitación de microplacas, solo 1 de cada 10 pocillos mostró un aumento de la fluorescencia de ThT después de 20 horas. En cambio, al utilizar ultrasonicación cíclica (15 minutos de sonicación seguidos de 5 minutos de reposo), se detectó un aumento significativo de la fluorescencia de ThT inmediatamente después del primer tratamiento de sonicación.

Rápida aceleración de la cinética de fibrilación

Los resultados obtenidos por So et al. (2011) demostraron que la formación espontánea de fibrillas de β2-microglobulina a pH 2,5 puede acelerarse mediante ultrasonicación, pasando de varias horas a tan solo 10–15 minutos.
Las imágenes de microscopía de fuerza atómica (AFM) confirmaron que las fibrillas generadas mediante 10 minutos de ultrasonicación cada 15 minutos eran morfológicamente indistinguibles de las formadas mediante 1 minuto de ultrasonicación cada 10 minutos. Esto pone de manifiesto la reproducibilidad y la robustez de la fibrilación amiloide inducida por ultrasonidos.

Imágenes de AFM de fibrillas amiloides producidas mediante ultrasonicación durante 1 min cada 10 min (i), sonicación durante 10 min cada 15 min (ii) y la reacción de siembra sin ultrasonicación (iii). La barra de escala blanca representa 1 μm.
Estudio e imágenes: ©So et al., 2011

Fibrilación en condiciones de pH neutro

Incluso en condiciones de pH neutro, se logró la formación de fibrillas tras un tiempo de latencia de 1,5 horas, lo que demuestra que la ultrasonicación reduce significativamente la barrera energética de la nucleación y el crecimiento. Esto respalda aún más la hipótesis de que la fibrilación amiloide es principalmente una reacción física, limitada en gran medida por la barrera energética de la nucleación, que la ultrasonicación reduce eficazmente.

Impacto en la investigación de enfermedades relacionadas con el amiloide

La formación sencilla y fiable de fibrillas amiloides mediante el sonicador de microplacas UIP400MTP tiene importantes implicaciones para la investigación de la enfermedad de Alzheimer (AD) y de otros trastornos relacionados con el amiloide, como la enfermedad de Parkinson, la diabetes de tipo II y las amiloidosis sistémicas. En la AD, la agregación de amiloide-β (Aβ) es una característica patológica clave; sin embargo, estudiar su cinética de fibrilación sigue siendo un reto debido a las largas fases de latencia y a la variabilidad de los métodos convencionales. La formación de fibrillas inducida por ultrasonicación acelera la nucleación, lo que garantiza una alta reproducibilidad y una menor variabilidad, aspectos cruciales para el cribado de posibles inhibidores y la comprensión de los mecanismos amiloidogénicos. Además, la capacidad de alto rendimiento del UIP400MTP permite realizar investigaciones a gran escala sobre el mal plegamiento y la agregación de proteínas, facilitando el descubrimiento de agentes terapéuticos que puedan modular la formación de fibrillas y, potencialmente, mitigar la progresión neurodegenerativa.

Este estudio establece la ultrasonicación con el sonicador de placas multipocillo UIP400MTP como un método muy eficiente para acelerar la formación de fibrillas amiloides. Las principales ventajas de este método incluyen:

• Reducción drástica del tiempo de latencia de la fibrilación.
• Exposición uniforme a los ultrasonidos en todos los pocillos, lo que permite una formación reproducible de fibrillas.
• Capacidad de cribado de alto rendimiento, que lo hace adecuado para búsquedas de amiloidogenicidad de proteínas a escala de todo el genoma.

Al integrar la ultrasonicación con la detección de fluorescencia de ThT, este método proporciona una plataforma rápida, escalable y fiable para estudiar la fibrilación amiloide. Dada su eficiencia y su potencial de alto rendimiento, este enfoque puede facilitar la síntesis sencilla de fibrillas amiloides para la investigación biofísica y farmacéutica, ofreciendo una herramienta prometedora para los estudios relacionados con el amiloide y el cribado de fármacos.