Formación de fibrillas amiloides con el sonicador de microplacas UIP400MTP

Las fibrillas amiloides, al igual que los cristales, se forman mediante un proceso de nucleación y posterior crecimiento. Sin embargo, debido a la elevada barrera de energía libre de la nucleación, la formación espontánea de fibrillas amiloides sólo se produce tras una prolongada fase de retardo. La ultrasonicación ha surgido como una poderosa herramienta para inducir la nucleación amiloide, acelerando así significativamente la formación de fibrillas. Cuando se combina con un lector de microplacas que utiliza fluorescencia de tioflavina T (ThT), la ultrasonicación permite la detección de alto rendimiento de fibrillas amiloides en múltiples muestras simultáneamente.

Formación de fibrillas amiloides inducida por ultrasonidos con el sonicador de microplacas UIP400MTP

Con el sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP, se pueden sintetizar rápidamente fibrillas amiloides de la misma calidad en grandes cantidades para fines de investigación. Este eficaz enfoque permite estudiar la amiloidogenicidad de las proteínas. Esta técnica facilita una fibrilación amiloide rápida y reproducible, como se ha demostrado con la β2-microglobulina (β2-m), una proteína amiloidogénica asociada a la amiloidosis relacionada con la diálisis.

Enfoque experimental sencillo: Fibrilación amiloide inducida por ultrasonidos

Para inducir la formación de fibrillas, se colocó una microplaca de 96 pocillos en el centro del sonicador de placas multipocillos UIP400MTP, lo que garantiza una exposición ultrasónica uniforme en todos los pocillos. Las condiciones experimentales fueron las siguientes:

1. Cada pocillo contenía 0,2 ml de solución de β2-microglobulina (0,3 mg/ml, pH 2,5) suplementada con 5 μM ThT.
2. La placa se sometió a ciclos de ultrasonidos, como ultrasonidos de 1 minuto seguidos de 9 minutos de pausa.
3. La fluorescencia de ThT se midió después de la ionización con un lector de microplacas.

(cf. So et al., 2011)

Comparación con la agitación convencional

En comparación con los métodos de agitación tradicionales, la ultrasonicación redujo drásticamente la fase de retardo de la formación de fibrillas. En condiciones convencionales de agitación de microplacas, sólo 1 de cada 10 pocillos mostró un aumento de la fluorescencia de ThT al cabo de 20 horas. En cambio, utilizando ultrasonidos cíclicos (15 minutos de sonicación seguidos de 5 minutos de reposo), se detectó un aumento significativo de la fluorescencia de ThT inmediatamente después del primer tratamiento de sonicación.

Rápida aceleración de la cinética de fibrilación

Los resultados obtenidos de So et al. (2011) demostraron que la formación espontánea de fibrillas de β2-microglobulina a pH 2,5 puede acelerarse de varias horas a solo 10-15 minutos con ultrasonidos.
Las imágenes de microscopía de fuerza atómica (AFM) confirmaron que las fibrillas generadas mediante ultrasonidos de 10 minutos cada 15 minutos eran morfológicamente indistinguibles de las formadas mediante ultrasonidos de 1 minuto cada 10 minutos. Esto pone de manifiesto la reproducibilidad y robustez de la fibrilación amiloide inducida por ultrasonidos.

Imágenes AFM de fibrillas amiloides producidas por ultrasonicación de 1 min cada 10 min (i), por sonicación de 10 min cada 15 min (ii) y por la reacción de siembra sin ultrasonicación (iii). La barra de escala blanca representa 1 μm.
Estudio e imágenes: ©So et al., 2011

Fibrilación en condiciones de pH neutro

Incluso en condiciones de pH neutro, la formación de fibrillas se logró después de un tiempo de retardo de 1,5 horas, lo que demuestra que la ultrasonicación reduce significativamente la barrera energética para la nucleación y el crecimiento. Esto apoya aún más la hipótesis de que la fibrilación amiloide es principalmente una reacción física, limitada en gran medida por la barrera energética de nucleación, que la ultrasonicación reduce eficazmente.

Impacto en la investigación de las enfermedades relacionadas con el amiloide

La formación fácil y fiable de fibrillas amiloides mediante el sonicador de microplacas UIP400MTP tiene importantes implicaciones para la investigación de la enfermedad de Alzheimer (EA) y otros trastornos relacionados con el amiloide, como la enfermedad de Parkinson, la diabetes tipo II y las amiloidosis sistémicas. En la EA, la agregación de amiloide-β (Aβ) es un sello patológico clave, pero el estudio de su cinética de fibrilación sigue siendo un reto debido a las largas fases de retardo y a la variabilidad de los métodos convencionales. La formación de fibrillas por ultrasonidos acelera la nucleación, garantizando una alta reproducibilidad y una variabilidad reducida, lo que es crucial para el cribado de posibles inhibidores y la comprensión de los mecanismos amiloidogénicos. Además, la capacidad de alto rendimiento del UIP400MTP permite realizar investigaciones a gran escala sobre el mal plegamiento y la agregación de proteínas, facilitando el descubrimiento de agentes terapéuticos que puedan modular la formación de fibrillas y mitigar potencialmente la progresión neurodegenerativa.

Este estudio establece que la ultrasonicación mediante el sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP es un método muy eficaz para acelerar la formación de fibrillas amiloides. Las ventajas clave de este enfoque incluyen:

• Reducción drástica del tiempo de retardo de la fibrilación.
• Exposición uniforme al ultrasonido en todos los pocillos, lo que permite la formación reproducible de fibrillas.
• Capacidad de cribado de alto rendimiento, lo que lo hace adecuado para búsquedas de amiloidogenicidad de proteínas en todo el genoma.

Al integrar la ultrasonicación con la detección de fluorescencia ThT, este método proporciona una plataforma rápida, escalable y fiable para estudiar la fibrilación amiloide. Dada su eficiencia y potencial de alto rendimiento, este enfoque puede facilitar la síntesis fácil de fibrillas amiloides para la investigación biofísica y farmacéutica, ofreciendo una herramienta prometedora para los estudios relacionados con el amiloide y la detección de fármacos.