Σύνθεση πεπτιδίων με υπερήχους με την τεχνική TAGGING

Η σύνθεση πεπτιδίων αποτελεί ακρογωνιαίο λίθο της φαρμακευτικής έρευνας και ανάπτυξης, ωστόσο οι συμβατικές μέθοδοι – η πεπτιδική σύνθεση στερεάς φάσης (SPPS) και η κλασική σύζευξη σε διάλυμα – εξακολουθούν να απαιτούν πολλή εργασία, να σπαταλούν αντιδραστήρια και να είναι δύσκολο να εφαρμοστούν σε μεγαλύτερη κλίμακα. Μια αποδοτικότερη εναλλακτική έχει προκύψει από τον συνδυασμό δύο ορθογώνιων στρατηγικών: της τεχνικής TAGGING (προσωρινή ομάδα αγκύρωσης) για τη συναρμολόγηση πεπτιδίων σε διάλυμα και της κατεργασίας με υπερήχους (ηχοχημικής κατεργασίας) για την επιτάχυνση των σταδίων σύζευξης, αποπροστασίας και κατεργασίας του μίγματος αντίδρασης. Μαζί, επιτρέπουν την παραγωγή θεραπευτικών πεπτιδίων – όπως το αντιβιοτικό/αντικαρκινικό λιποπεπτίδιο lipobactin – από την κλίμακα γραμμαρίων έως τη μαζική παραγωγή, με υψηλή καθαρότητα, μειωμένες απαιτήσεις καθαρισμού και δραστικά λιγότερες χειρωνακτικές εργασίες.

Ποια πλεονεκτήματα προσφέρει η σύνθεση πεπτιδίων με υπερήχους;

• Οικονομία της σύνθεσης σε διάλυμα: Οι αντιδράσεις πραγματοποιούνται σε διάλυμα με σημαντικά χαμηλότερη κατανάλωση αμινοξέων από ό,τι στην πεπτιδική σύνθεση στερεάς φάσης
• Καθαρισμός με διήθηση: Το πεπτίδιο που είναι συνδεδεμένο με την TAG καταβυθίζεται σε πολικούς διαλύτες, οπότε τα ενδιάμεσα απομονώνονται με απλή διήθηση – δεν απαιτείται χρωματογραφία στήλης ούτε χαρακτηρισμός σε κάθε στάδιο.
• Τεράστια εξοικονόμηση εργασίας: Η εξάλειψη του ενδιάμεσου καθαρισμού και των φασματοσκοπικών ελέγχων εξοικονομεί σημαντικό αριθμό ανθρωποωρών σε μια πλήρη εκστρατεία σύνθεσης.
• Ηχοχημική επιτάχυνση: Η κατεργασία με υπερήχους συντομεύει κάθε κρίσιμο στάδιο – την αποπροστασία Fmoc, τη σύζευξη πλευρικών αλυσίδων, την κυκλοποίηση και την ολική αποπροστασία – χωρίς να υποβαθμίζει την εκλεκτικότητα.
• Υψηλές αποδόσεις, υψηλή καθαρότητα: Κάθε σύζευξη τμημάτων και η τελική συναρμολόγηση του lipobactin πραγματοποιούνται με υψηλή απόδοση· η ολική αποπροστασία δίνει το επιθυμητό προϊόν με απόδοση ~83 %.
• Ετοιμότητα για μαζική παραγωγή: Η τεχνική TAGGING περιγράφεται ρητά ως τεχνική που επιτρέπει την παρασκευή πεπτιδίων σε μαζική κλίμακα με τη μέγιστη δυνατή καθαρότητα, αποτελώντας έτσι μια πρακτική οδό για την παραγωγή θεραπευτικά σημαντικών λιποπεπτιδίων σε ποσότητες γραμμαρίων και χιλιογράμμων.
• Πλήρης συμβατότητα με τις μεθόδους: Η προσέγγιση είναι πλήρως συμβατή με τη συμβατική SPPS και τη χημεία σε διάλυμα, επομένως οι υπάρχουσες στρατηγικές προστατευτικών ομάδων (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) και τα αντιδραστήρια σύζευξης (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) εφαρμόζονται χωρίς αλλαγές.

Τι είναι η τεχνική TAGGING;

Στην προσέγγιση TAG, ένα πεπτιδικό τμήμα αγκυρώνεται ομοιοπολικά σε μια αφαιρούμενη ομάδα αγκύρωσης (TAG), παρόμοια με ρητίνη, η οποία παραμένει σε διάλυμα. Αυτό επιτρέπει τον χειρισμό της αναπτυσσόμενης αλυσίδας όπως ενός πεπτιδίου στερεάς φάσης, αλλά στην υγρή φάση:

• Μετά από κάθε σύζευξη ή αποπροστασία, το πεπτίδιο που είναι συνδεδεμένο με την TAG ανακτάται ως στερεό με απλή διήθηση ή καταβύθιση σε πολικά μέσα ή μέσα αντιδιαλύτη, ενώ οι διαλυτές προσμείξεις και τα παραπροϊόντα απομακρύνονται με έκπλυση.
• Επειδή το πεπτίδιο παραμένει συνδεδεμένο με τον συνδέτη, η χρωματογραφία στήλης και ο πλήρης χαρακτηρισμός κάθε ενδιάμεσου εξαλείφονται σε μεγάλο βαθμό, εξοικονομώντας σημαντικό χρόνο και ανθρώπινη προσπάθεια.
• Οι αντιδράσεις μπορούν να πραγματοποιηθούν σε διάλυμα, χρησιμοποιώντας πολύ λιγότερα αμινοξέα από ό,τι η SPPS, και το τελικό προϊόν απελευθερώνεται με αποκοπή της ομάδας TAG προς το τέλος της σύνθεσης.

 
Για το lipobactin, η ρετροσύνθεση χρησιμοποίησε τρία τμήματα – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH και το λιπιδικό τμήμα C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH – τα οποία συζεύχθηκαν με μια στρατηγική συμπύκνωσης τμημάτων για να ληφθεί το πεπτίδιο μεγάλης αλυσίδας με πολύ υψηλές αποδόσεις. (πρβλ. Ramya et al., 2025)

Η πλήρης σύνθεση του πεπτιδίου lipobactin με τη βοήθεια TAG επιταχύνεται με κατεργασία με υπερήχους.
(Μελέτη: Ramya et al., 2025)

Πώς η κατεργασία με υπερήχους βελτιώνει τη σύνθεση πεπτιδίων σε διάλυμα

Η κατεργασία με υπερήχους χρησιμοποιείται για την εντατικοποίηση και τη συντόμευση των βασικών σταδίων σε διάλυμα. Στη σύνθεση της lipobactin, όπως περιγράφεται από τους Ramya et al. (2025), η κατεργασία με υπερήχους εφαρμόζεται στα εξής:

Επειδή η χημεία TAG παρέχει ήδη τα ενδιάμεσα προϊόντα ως διηθήσιμα στερεά, η κατεργασία με υπερήχους και η τεχνική TAGGING είναι συμπληρωματικές: οι υπέρηχοι επιταχύνουν τη μεταφορά μάζας, την ανάμειξη και την κινητική των αντιδράσεων, ενώ η ομάδα αγκύρωσης διατηρεί το πεπτίδιο ως ανακτήσιμο στερεό, για μια καθαρή ροή εργασίας με περιορισμένη χρήση χρωματογραφίας.

Εύκολη κλιμάκωση της παραγωγής πεπτιδίων υψηλής καθαρότητας με κατεργασία με υπερήχους

Μια συχνή πρόκληση κατά τη μεταφορά διεργασιών παραγωγής πεπτιδίων και πεπτιδικών φαρμάκων από τον εργαστηριακό πάγκο στην παραγωγή είναι η διατήρηση της ηχοχημικής επίδρασης σε μεγαλύτερους όγκους και σε συνεχή ροή. Η Hielscher αντιμετωπίζει αυτή την πρόκληση με μια συνεχή σειρά συσκευών επεξεργασίας με υπερήχους, από την εργαστηριακή έως την πλήρη βιομηχανική κλίμακα, παρέχοντας επικυρωμένη, αναπαραγώγιμη ισχύ και τεκμηριωμένο έλεγχο της διεργασίας.
 

Βιομηχανική συσκευή υπερήχων UIP4000hdT (4000W, 20kHz) για σύνθεση πεπτιδίων ενισχυμένη με υπερήχους

Βιβλιογραφία / Αναφορές

• M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
• Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
• Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
• M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.