Σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση – Πιο αποδοτική με κατεργασία με υπερήχους
Η σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση (SPPS) είναι η συνήθης μέθοδος σύνθεσης πεπτιδίων. Η κατεργασία με υπερήχους αποτελεί αξιόπιστο εργαλείο για την εντατικοποίηση της σύνθεσης πεπτιδίων σε στερεά φάση, επιτυγχάνοντας υψηλότερες αποδόσεις, βελτιωμένη καθαρότητα, απουσία ρακεμοποίησης και σημαντικά αυξημένη ταχύτητα αντίδρασης. Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει διάφορες λύσεις υπερήχων για τη σύνθεση, την αποκοπή και τη διάλυση πεπτιδίων.
Σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση με υπερήχους
Η κατεργασία με υπερήχους εφαρμόζεται ήδη ευρέως ως μέθοδος εντατικοποίησης στην οργανική σύνθεση και είναι γνωστή για τα πλεονεκτήματά της, όπως οι δραστικά μειωμένοι χρόνοι αντίδρασης, οι υψηλότερες αποδόσεις, τα λιγότερα παραπροϊόντα, η έναρξη οδών αντίδρασης που δεν θα μπορούσαν να επιτευχθούν με άλλους τρόπους ή/και η καλύτερη εκλεκτικότητα. Μεγάλα οφέλη μπορούν επίσης να προκύψουν όταν η κατεργασία με υπερήχους ενσωματώνεται σε αντιδράσεις σύνθεσης πεπτιδίων. Ερευνητικά αποτελέσματα έχουν καταδείξει ότι η υποβοηθούμενη από υπερήχους σύνθεση πεπτιδίων επιτυγχάνει βελτιστοποιημένη απόδοση πεπτιδίων υψηλής καθαρότητας, χωρίς ρακεμοποίηση, σε σύντομο χρόνο αντίδρασης.
- Υψηλές αποδόσεις πεπτιδίων
- Σημαντικά ταχύτερη σύνθεση
- Υψηλότερη καθαρότητα πεπτιδίων
- Χωρίς ρακεμοποίηση
- Παράλληλη σύνθεση διαφόρων πεπτιδίων
- Δυνατότητα κλιμάκωσης σε οποιονδήποτε όγκο
Κυπελλοειδές ηχοτρόδιο υπερήχων για την ομοιόμορφη κατεργασία πολλών δοχείων αντίδρασης με υπερήχους, για βελτιωμένη σύνθεση πεπτιδίων.
Γραφική απεικόνιση της σύνθεσης πεπτιδίων σε στερεά φάση κατά Merrifield. Η κατεργασία με υπερήχους χρησιμοποιείται για την προώθηση και την ενίσχυση της αντίδρασης σύνθεσης, καθώς και για την αποκοπή των συντεθειμένων πεπτιδίων από τη ρητίνη.
Γραφικό: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Μελέτη | Πεπτίδιο(-α) που μελετήθηκε(-αν) | Χρόνος αντίδρασης (κλασική μέθοδος έναντι US-SPPS) | Καθαρότητα ακατέργαστου προϊόντος (κλασική μέθοδος έναντι US-SPPS) | Ρακεμοποίηση και παράπλευρες αντιδράσεις | Κύρια συμπεράσματα |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-εγκεφαλίνη, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-ενδορφίνη | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Δεν παρατηρήθηκαν για Cys/His, ακόμη και στους 70°C | ~7–12 φορές ταχύτερη σύνθεση· μεγάλες βελτιώσεις στην καθαρότητα, ιδιαίτερα για αλληλουχίες με τάση συσσωμάτωσης, όπως η TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-μερές), Pep2 (9-μερές), Pep3 (25-μερές) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2)· Pep3: 347 min (μόνο με υπερήχους) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Δεν εξετάστηκαν· παρατηρήθηκε ελαφρά μείωση της καθαρότητας του Pep2 | Μείωση του χρόνου κατά 14 φορές για το Pep1· σημαντική αύξηση των αποδόσεων ακατέργαστου προϊόντος. |
| Merlino et al. (2019) | Πρότυπα πενταπεπτίδια, πεπτίδια έως και 44-μερή, «δύσκολες αλληλουχίες» (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (πρότυπο) | 84% → 93% (πρότυπο)· σημαντικά υψηλότερη από ό,τι με θερμική θέρμανση (~45°C) | Καμία σημαντική αύξηση για τα εναντιομερή Cys/His | Ιδιαίτερα αποτελεσματική για δύσκολες αλληλουχίες ή αλληλουχίες με τάση συσσωμάτωσης· επιτρέπει τη μείωση της περίσσειας αντιδραστηρίων διατηρώντας υψηλή καθαρότητα. |
Σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση βελτιωμένη με υπερήχους
Η πεπτιδική σύνθεση στερεάς φάσης (SPPS) είναι μια χημική αντίδραση που επιτρέπει τη συγκρότηση μιας πεπτιδικής αλυσίδας μέσω διαδοχικών αντιδράσεων παραγώγων αμινοξέων πάνω σε ένα αδιάλυτο πορώδες υπόστρωμα. Ωστόσο, η παραδοσιακή πεπτιδική σύνθεση στερεάς φάσης είναι μια σχετικά αναποτελεσματική και αργή διεργασία. Επομένως, η εντατικοποίηση της πεπτιδικής σύνθεσης με υπερήχους αποτελεί ένα ιδιαίτερα αναγνωρισμένο εργαλείο για αποτελεσματικότερη και ταχύτερη σύνθεση πεπτιδίων.
Οι Silva et al. (2021) συνέκριναν την «κλασική» πεπτιδική σύνθεση στερεάς φάσης (SPPS) με φθορενομεθοξυκαρβονύλιο (Fmoc) με την υποβοηθούμενη από υπερήχους (US) SPPS, με βάση την παρασκευή τριών πεπτιδίων: του πεπτιδίου Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2), που είναι ειδικό για τον υποδοχέα 3 του αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGFR3), και των νέων πεπτιδίων Pep2 (RQMATADEA-NH2) και Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
Η υποβοηθούμενη από US SPPS οδήγησε σε μείωση του χρόνου συγκρότησης των πεπτιδίων κατά συντελεστή 14 (Pep1) και 4 (Pep2) σε σύγκριση με την «κλασική» μέθοδο. Είναι ενδιαφέρον ότι η υποβοηθούμενη από υπερήχους SPPS απέδωσε το Pep1 σε υψηλότερη καθαρότητα (82%) από την «κλασική» SPPS (73%). Η σημαντική μείωση του χρόνου, σε συνδυασμό με την υψηλή καθαρότητα των ακατέργαστων πεπτιδίων που επιτεύχθηκε, ώθησε την ερευνητική ομάδα να εφαρμόσει την υποβοηθούμενη από US SPPS στο μεγάλο πεπτίδιο Pep3, το οποίο παρουσιάζει μεγάλο αριθμό υδρόφοβων αμινοξέων και ομοολιγομερών αλληλουχιών. Αξιοσημείωτο είναι ότι η σύνθεση αυτού του 25μερούς πεπτιδίου επιτεύχθηκε σε λιγότερο από 6 ώρες (347 min), με μέτρια καθαρότητα (περίπου 49%).
Ταχύτερη σύνθεση πεπτιδίων μέσω πεπτιδικής σύνθεσης στερεάς φάσης με ανάδευση με υπερήχους.
(Μελέτη και ανάλυση: Wołczański et al., 2019)
Οι Merlino et al. (2019) διεξήγαγαν επίσης μια εκτενή μελέτη των επιδράσεων των υπερήχων στην πεπτιδική σύνθεση στερεάς φάσης με βάση το Fmoc, η οποία επέτρεψε τη σύνθεση διαφόρων βιολογικά ενεργών πεπτιδίων (έως και 44μερών), με αξιοσημείωτη εξοικονόμηση υλικών και χρόνου αντίδρασης. Έδειξαν ότι η κατεργασία με υπερήχους δεν επιδείνωσε τις κύριες παράπλευρες αντιδράσεις και βελτίωσε τη σύνθεση πεπτιδίων με «δύσκολες αλληλουχίες», κατατάσσοντας την ενισχυόμενη με υπερήχους πεπτιδική σύνθεση στερεάς φάσης (US-SPPS) μεταξύ των σύγχρονων στρατηγικών σύνθεσης πεπτιδίων υψηλής αποτελεσματικότητας.
Η διαθεσιμότητα συστημάτων υψηλής απόδοσης για την υπερηχητική (ηχητική) σύνθεση πεπτιδίων επιτρέπει σημαντικά βελτιωμένους ρυθμούς σύνθεσης και αύξηση της καθαρότητας των ακατέργαστων προϊόντων. (πρβλ. Wołczański et al., 2019)
Η διερεύνηση της ρακεμοποίησης. Σύγκριση χαρακτηριστικών φασμάτων 1H NMR πρότυπων πεπτιδίων που συντέθηκαν χειροκίνητα με την κλασική προσέγγιση σε θερμοκρασία δωματίου έναντι της μεθόδου υπερήχων σε αυξημένη θερμοκρασία. Οι χημικές μετατοπίσεις των α-πρωτονίων των His και Cys και της μεθυλενομάδας της Acm (αριστερά διαγράμματα), καθώς και των πρωτονίων της ɣ-μεθυλομάδας της Val (δεξιά διαγράμματα), δείχνουν ότι η κατεργασία με υπερήχους στους 70°C δεν προκαλεί ρακεμοποίηση.
(Μελέτη και ανάλυση: Wołczański et al., 2019)
Αποκοπή πεπτιδίων με υπερήχους
Μετά την πεπτιδική σύνθεση στερεάς φάσης (SPPS), τα συντεθειμένα πεπτίδια πρέπει να αποκοπούν από τις πολυμερικές ρητίνες. Αυτό το στάδιο είναι επίσης γνωστό ως αποπροστασία. Όταν συγκρίνονται η συνήθης ανακίνηση και η κατεργασία με υπερήχους για την αποκοπή πεπτιδίων από τη ρητίνη, η μέθοδος ανακίνησης απαιτεί περίπου 1 ώρα, ενώ η αποκοπή με υπερήχους μπορεί να ολοκληρωθεί σε 15 έως 20 min. Η αποκοπή πεπτιδίων με υπερήχους μπορεί να εφαρμοστεί για την αποκοπή προστατευμένων αμινοξέων και πεπτιδίων που συνδέονται με ρητίνες πολυστυρενίου μέσω βενζυλικών εστερικών δεσμών.
Η αποκοπή πεπτιδίων από ρητίνη πολυστυρενίου με υπερήχους παρέχει υψηλές αποδόσεις πεπτιδίων υψηλής καθαρότητας, χωρίς ρακεμοποίηση, μέσω μιας ταχείας διαδικασίας.
(μελέτη και γραφικό: ©Anuradha and Ravindranath, 1995)
Αντιδραστήρας με ανάδευση με υπερήχους για βελτιωμένη και ταχύτερη σύνθεση πεπτιδίων. Η εικόνα δείχνει τη συσκευή υπερήχων UP200St σε έναν γυάλινο αντιδραστήρα με ανάδευση.
Συσκευές υπερήχων υψηλής απόδοσης για τη σύνθεση πεπτιδίων
Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει διάφορες λύσεις υπερήχων για άμεση και έμμεση κατεργασία με υπερήχους. Ισχυροί επεξεργαστές υπερήχων με δυνατότητα ακριβούς ελέγχου παρέχουν στο δοχείο αντίδρασης ακριβώς την κατάλληλη ποσότητα ενέργειας υπερήχων. Είτε χρησιμοποιείτε σύριγγες, σωλήνες, πλάκες πολλαπλών βοθρίων είτε γυάλινους αντιδραστήρες ως δοχεία σύνθεσης, η Hielscher Ultrasonics προσφέρει την πλέον κατάλληλη συσκευή υπερήχων για την εφαρμογή σας με πεπτίδια.
- εξατομικευμένα πεπτίδια
- παραγωγή πεπτιδίων σε μεγάλη κλίμακα
- βιβλιοθήκες πεπτιδίων
Πολλές συνθέσεις πεπτιδίων πραγματοποιούνται σε σύριγγες (π.χ. αντιδραστήρες σύριγγας με πορώδες φίλτρο). Ο αναδευτήρας συρίγγων με υπερήχους της Hielscher υποβάλλει το πεπτιδικό διάλυμα σε κατεργασία με υπερήχους, μεταδίδοντας τα κύματα υπερήχων μέσω του τοιχώματος της σύριγγας στο υγρό. Ο αναδευτήρας συρίγγων με υπερήχους είναι μία από τις δημοφιλέστερες λύσεις υπερήχων για την υποβοηθούμενη από υπερήχους σύνθεση πεπτιδίων.
Το cuphorn υπερήχων είναι κατάλληλο εργαλείο για την κατεργασία έως και 5 δοχείων αντιδραστήρα με υπερήχους, ενώ το VialTweeter μπορεί να συγκρατεί έως και δέκα σωλήνες αντίδρασης και επιπλέον πέντε μεγαλύτερα δοχεία μέσω ενός προσαρτήματος στερέωσης με σφιγκτήρα.
Για άλλους τύπους αντιδραστήρων, όπως οι αντιδραστήρες στερεάς φάσης Merrifield ή Kamysz, καθώς και για άλλα δοχεία και αντιδραστήρες από πολυπροπυλένιο ή βοριοπυριτικό γυαλί, η Hielscher προσφέρει συσκευές για έμμεση και άμεση κατεργασία με υπερήχους, με προσαρμοσμένη στερέωση με σφιγκτήρα ή φλάντζα.
Φυσικά, οι μεγαλύτεροι αναδευόμενοι γυάλινοι αντιδραστήρες, π.χ. για σύνθεση σε υγρή φάση, μπορούν εύκολα να εξοπλιστούν με ανιχνευτές υπερήχων (γνωστούς επίσης ως ηχοτρόδια ή κέρατα υπερήχων) οποιουδήποτε μεγέθους.
- διάφοροι τύποι συσκευών υπερήχων
- άμεση και έμμεση κατεργασία με υπερήχους
- ακριβής έλεγχος της έντασης
- ακριβής έλεγχος της θερμοκρασίας
- συνεχείς ή παλμικοί υπέρηχοι
- έξυπνες λειτουργίες, προγραμματιζόμενες συσκευές
- διαθέσιμες για οποιονδήποτε όγκο
- γραμμική κλιμάκωση
Για τη σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση σε πλάκες πολλαπλών βοθρίων/μικροτιτλοδότησης, το UIP400MTP είναι η ιδανική συσκευή. Η σπηλαίωση υπερήχων μεταδίδεται έμμεσα και ομοιόμορφα στα πολυάριθμα βοθρία δειγμάτων, για ανώτερη μεταφορά μάζας και αντίδραση σύνθεσης. Παρακολουθήστε το παρακάτω βίντεο για να δείτε τη συσκευή υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP σε δράση!
Επικοινωνήστε μαζί μας! / Ρωτήστε μας!
Η Hielscher Ultrasonics κατασκευάζει ομογενοποιητές υπερήχων υψηλής απόδοσης για εφαρμογές ανάμειξης, διασποράς, γαλακτωματοποίησης και εκχύλισης σε εργαστηριακή, πιλοτική και βιομηχανική κλίμακα.
Χρήσιμες πληροφορίες για τη σύνθεση πεπτιδίων με υπερήχους
Τι είναι τα πεπτίδια;
Τα πεπτίδια είναι ενώσεις στις οποίες πολλά αμινοξέα συνδέονται μέσω αμιδικών δεσμών, των λεγόμενων πεπτιδικών δεσμών. Όταν συνδέονται σε σύνθετες δομές – που συνήθως αποτελούνται από 50 ή περισσότερα αμινοξέα –, αυτές οι μεγάλες πεπτιδικές δομές ονομάζονται πρωτεΐνες. Τα πεπτίδια αποτελούν βασικό δομικό στοιχείο της ζωής και επιτελούν πολυάριθμες λειτουργίες στον οργανισμό.
Πώς λειτουργεί η σύνθεση πεπτιδίων;
Στην οργανική χημεία, τη μοριακή βιολογία και τις βιοεπιστήμες, η σύνθεση πεπτιδίων είναι η διαδικασία παραγωγής πεπτιδίων. Τα πεπτίδια συντίθενται χημικά μέσω αντίδρασης συμπύκνωσης της καρβοξυλομάδας ενός αμινοξέος με την αμινομάδα ενός άλλου αμινοξέος. Συνήθως χρησιμοποιούνται στρατηγικές με ομάδες προστασίας (επίσης γνωστές ως προστατευτικές ομάδες), ώστε να αποφεύγονται ανεπιθύμητες παράπλευρες αντιδράσεις με τις διάφορες πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων.
Η χημική (in-vitro) σύνθεση πεπτιδίων ξεκινά συχνότερα με τη σύζευξη της καρβοξυλομάδας του εισερχόμενου αμινοξέος (C-τελικό άκρο) με το N-τελικό άκρο της αναπτυσσόμενης πεπτιδικής αλυσίδας. Σε αντίθεση με αυτή τη σύνθεση από το C-τελικό προς το N-τελικό άκρο, η φυσική βιοσύνθεση πρωτεϊνών από μακριά πεπτίδια στους ζωντανούς οργανισμούς πραγματοποιείται προς την αντίθετη κατεύθυνση. Αυτό σημαίνει ότι, κατά τη βιοσύνθεση, το N-τελικό άκρο του εισερχόμενου αμινοξέος συνδέεται με το C-τελικό άκρο της πρωτεϊνικής αλυσίδας (από το N-τελικό προς το C-τελικό άκρο).
Τα περισσότερα πρωτόκολλα έρευνας και ανάπτυξης για τη σύνθεση πεπτιδίων βασίζονται σε μεθόδους στερεάς φάσης, ενώ μέθοδοι σύνθεσης σε υγρή φάση χρησιμοποιούνται στη βιομηχανική παραγωγή πεπτιδίων σε μεγάλη κλίμακα.
Ποια είναι η σημερινή τεχνολογική αιχμή στη σύνθεση πεπτιδίων;
Η SUS-SPPS (Βιώσιμη SPPS υποβοηθούμενη από υπερήχους) έχει αποδειχθεί ότι μειώνει τη διαδικασία σε μόλις δύο βήματα ανά κύκλο (συνδυασμένη σύζευξη/τερματισμός μη αντιδρώντων άκρων/αποπροστασία + μία πλύση), μειώνοντας σημαντικά την κατανάλωση διαλυτών και τον χρόνο. (βλ. Mottola et al., 2025)
Η TAPS με υποβοήθηση υπερήχων είναι ένας αναδυόμενος συνδυασμός με αποδεδειγμένη επιτυχία σε ολικές συνθέσεις (π.χ. lipobactin) και διερευνάται από οργανισμούς ανάπτυξης και παραγωγής επί συμβάσει (CDMOs) για την παραγωγή δραστικών φαρμακευτικών ουσιών (API).
Ανακαλύψτε τα πλεονεκτήματα της σύνθεσης πεπτιδίων TAGGING με υποβοήθηση υπερήχων!
Η συνεχής επεξεργασία διερευνάται ως περαιτέρω βελτίωση – έχουν περιγραφεί πλατφόρμες συνεχούς σύνθεσης σε ένα δοχείο με τη βοήθεια σιλυλιωμένων ετικετών.
Ο τομέας στρέφεται προς τις αρχές της πράσινης χημείας, με τους υπερήχους και την TAPS να συμβάλλουν στη μειωμένη χρήση διαλυτών, στις μικρότερες ποσότητες αντιδραστηρίων και στη βελτιωμένη βιωσιμότητα.
Βιβλιογραφία / Αναφορές
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Η Hielscher Ultrasonics κατασκευάζει ομογενοποιητές υπερήχων υψηλής απόδοσης από εργαστηριακή έως βιομηχανική κλίμακα.