Σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση – Μεγαλύτερη αποδοτικότητα με τη χρήση υπερήχων
Η σύνθεση πεπτιδίων στερεάς φάσης (SPPS) είναι η κοινή μέθοδος σύνθεσης πεπτιδίων. Υπερήχους είναι ένα αξιόπιστο εργαλείο για την εντατικοποίηση στερεά φάση πεπτιδική σύνθεση με αποτέλεσμα υψηλότερες αποδόσεις, βελτιωμένη καθαρότητα, καμία racemization και σημαντικά επιταχυνόμενη ταχύτητα αντίδρασης. Hielscher Υπέρηχοι προσφέρει διάφορες λύσεις υπερήχων για σύνθεση πεπτιδίων, διάσπαση, και διάλυση.
Σύνθεση πεπτιδίων με υπερήχους σε στερεά φάση
Υπερήχους εφαρμόζεται ήδη ευρέως ως μέθοδος εντατικοποίησης στην οργανική σύνθεση και είναι γνωστή για τα πλεονεκτήματά της, όπως δραστικά μειωμένοι χρόνοι αντίδρασης, υψηλότερες αποδόσεις, λιγότερα υποπροϊόντα, η έναρξη των οδών, η οποία δεν θα μπορούσε να επιτευχθεί με άλλους τρόπους, ή / και καλύτερη επιλεκτικότητα. Μεγάλα οφέλη μπορούν επίσης να ληφθούν, όταν κατεργασία με υπερήχους συνδυάζεται σε αντιδράσεις σύνθεσης πεπτιδίων. Τα αποτελέσματα της έρευνας έχουν δείξει ότι η υπερηχητικά υποβοηθούμενη σύνθεση πεπτιδίων επιτυγχάνει βελτιστοποιημένη απόδοση πεπτιδίων με υψηλή καθαρότητα, χωρίς ρακεμοποίηση μέσα σε σύντομο χρόνο αντίδρασης.
- Υψηλές αποδόσεις πεπτιδίων
- Σημαντικά ταχύτερη σύνθεση
- Υψηλότερη καθαρότητα πεπτιδίων
- Χωρίς ρακεμοποίηση
- Παράλληλη σύνθεση διαφόρων πεπτιδίων
- Μπορεί να προσαρμοστεί σε οποιονδήποτε όγκο
Υπερήχων cuphorn για την ομοιόμορφη υπερήχηση πολλών αγγείων αντιδραστήρα για βελτιωμένη σύνθεση πεπτιδίων.
Σχέδιο που απεικονίζει τη σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση κατά τη μέθοδο Merrifield. Η υπερηχητική επεξεργασία χρησιμοποιείται για την προώθηση και ενίσχυση της συνθετικής αντίδρασης, καθώς και για την αποκόλληση των συντεθειμένων πεπτιδίων από τη ρητίνη.
Γράφημα: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Μελέτη | Πεπτίδια που μελετήθηκαν | Χρόνος αντίδρασης (Κλασική μέθοδος έναντι US-SPPS) | Καθαρότητα αργού πετρελαίου (Κλασική μέθοδος έναντι US-SPPS) | Ρακεμοποίηση και παράπλευρες αντιδράσεις | Κύρια συμπεράσματα |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański κ.ά. (2019) | Μετενκεφαλίνη, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-ενδορφίνη | 600–1920 λεπτά → 48–284 λεπτά | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Δεν παρατηρήθηκε τίποτα για τα Cys/His, ακόμη και στους 70 °C | ~7–12 φορές ταχύτερη σύνθεση· σημαντικές βελτιώσεις στην καθαρότητα, ειδικά για αλληλουχίες που έχουν τάση συσσωμάτωσης, όπως η TAT. |
| Silva κ.ά. (2021) | Pep1 (12-μερές), Pep2 (9-μερές), Pep3 (25-μερές) | >3515/365 λεπτά → ~250/85 λεπτά (Pep1/Pep2) · Pep3: 347 λεπτά (μόνο στις ΗΠΑ) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Δεν έχει δοκιμαστεί· παρατηρήθηκε ελαφρά μείωση της καθαρότητας στο Pep2 | Μείωση του χρόνου κατά 14 φορές για την Pep1· σημαντική αύξηση των ακατέργαστων αποδόσεων. |
| Merlino κ.ά. (2019) | Πενταπεπτίδια-πρότυπα, πεπτίδια έως και 44-μερή, “δύσκολες ακολουθίες” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 λεπτά → 30 λεπτά (πρότυπο) | 84% → 93% (μοντέλο)· σημαντικά υψηλότερο από τη θερμική θέρμανση (~45 °C) | Δεν παρατηρείται σημαντική αύξηση στα εναντιομερή Cys/His | Ιδιαίτερα αποτελεσματική για δύσκολες αλληλουχίες ή αλληλουχίες που έχουν τάση συσσωμάτωσης· επιτρέπει τη χρήση μειωμένης περίσσειας αντιδραστηρίου, διατηρώντας παράλληλα υψηλή καθαρότητα. |
Η σύνθεση πεπτιδίων στερεάς φάσης βελτιώθηκε με υπερήχους
Η σύνθεση πεπτιδίων στερεάς φάσης (SPPS) είναι μια χημική αντίδραση που επιτρέπει τη συναρμολόγηση μιας πεπτιδικής αλυσίδας μέσω διαδοχικών αντιδράσεων παραγώγων αμινοξέων σε ένα αδιάλυτο πορώδες στήριγμα. Ωστόσο, η παραδοσιακή σύνθεση πεπτιδίων στερεάς φάσης είναι μια σχετικά αναποτελεσματική και αργή διαδικασία. Ως εκ τούτου, υπερήχων εντατικοποίηση της πεπτιδικής σύνθεσης είναι ένα ιδιαίτερα θεωρείται εργαλείο για μια πιο αποτελεσματική και ταχεία σύνθεση των πεπτιδίων.
Οι Silva κ.ά. (2021) συνέκριναν “κλασική” σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση (SPPS) με φλουορενοϋλομεθοξυκαρβονύλιο (Fmoc) και (US) με βάση την παρασκευή τριών πεπτιδίων, συγκεκριμένα του πεπτιδίου Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) που είναι ειδικό για τον υποδοχέα 3 του αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGFR3) και των νέων πεπτιδίων Pep2 (RQMATADEA-NH2) και Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
Η SPPS με τη βοήθεια των ΗΠΑ οδήγησε σε 14-πλάσια (Pep1) και 4-πλάσια (Pep2) μείωση του χρόνου συναρμολόγησης των πεπτιδίων σε σύγκριση με την “κλασική” μέθοδος. Είναι ενδιαφέρον ότι η SPPS με τη βοήθεια υπερήχων απέδωσε Pep1 με υψηλότερη καθαρότητα (82%) από ό,τι η “κλασική” SPPS (73%). Η σημαντική μείωση του χρόνου, σε συνδυασμό με την υψηλή καθαρότητα του ακατέργαστου πεπτιδίου που επιτεύχθηκε, ώθησε την ερευνητική ομάδα να εφαρμόσει τη μέθοδο SPPS με τη βοήθεια υπερήχων στο μεγάλο πεπτίδιο Pep3, το οποίο παρουσιάζει μεγάλο αριθμό υδρόφοβων αμινοξέων και ομοολιγο-ακολουθιών. Αξίζει να σημειωθεί ότι η σύνθεση αυτού του πεπτιδίου 25-μερούς επιτεύχθηκε σε λιγότερο από 6 ώρες (347 λεπτά) με μέτρια καθαρότητα (περίπου 49%).
Ταχύτερη σύνθεση πεπτιδίων μέσω σύνθεσης πεπτιδίων στερεάς φάσης χρησιμοποιώντας υπερηχητική ανάδευση.
(Μελέτη και ανάλυση: Wołczański et al., 2019)
Οι Merlino κ.ά. (2019) διεξήγαγαν επίσης μια ολοκληρωμένη μελέτη σχετικά με τις επιδράσεις των υπερήχων στη σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση με τη μέθοδο Fmoc, η οποία επέτρεψε τη σύνθεση διαφόρων βιολογικά δραστικών πεπτιδίων (μέχρι 44-μερών), με αξιοσημείωτη εξοικονόμηση υλικών και χρόνου αντίδρασης. Απέδειξαν ότι η υπερηχητική επεξεργασία δεν επιδείνωσε τις κύριες παρενέργειες και βελτίωσε τη σύνθεση πεπτιδίων που διαθέτουν “δύσκολες ακολουθίες”, τοποθετώντας την υπερηχητικά προωθούμενη σύνθεση πεπτιδίων στερεάς φάσης (US-SPPS) μεταξύ των τρεχουσών υψηλής απόδοσης πεπτιδικών συνθετικών στρατηγικών.
Η διαθεσιμότητα συστημάτων υψηλής απόδοσης για την υπερηχητική (ηχητική) σύνθεση πεπτιδίων επιτρέπει σημαντικά βελτιωμένα ποσοστά σύνθεσης και αύξηση της καθαρότητας των πρώτων υλών. (πρβλ. Wołczański et al., 2019)
Η διερεύνηση της ρακεμοποίησης. Σύγκριση σημαντικών φασμάτων 1H NMR πεπτιδίων που συντίθενται χειροκίνητα χρησιμοποιώντας την κλασική προσέγγιση σε θερμοκρασία δωματίου έναντι της μεθόδου υπερήχων σε αυξημένη θερμοκρασία. Χημικές μετατοπίσεις των His και Cys α-πρωτονίων και μεθυλενίου της ομάδας Acm (αριστερά πάνελ), ɣ-μεθυλοπρωτόνια του Val (δεξιά πάνελ) δείχνουν ότι η υπερήχηση στους 70 ° C δεν προκαλεί ρακεμοποίηση.
(Μελέτη και ανάλυση: Wołczański et al., 2019)
Υπερήχων διάσπαση των πεπτιδίων
Μετά τη σύνθεση πεπτιδίων στερεάς φάσης (SPPS), τα συνθετικά πεπτίδια πρέπει να διασπώνται από τις πολυμερείς ρητίνες. Αυτό το βήμα είναι επίσης γνωστό ως αποπροστασία. Όταν συγκρίνεται η κοινή ανακίνηση και υπερήχους για διάσπαση πεπτιδίων από ρητίνη, η μέθοδος ανακίνησης απαιτεί περίπου 1 ώρα, ενώ η διάσπαση υπερήχων μπορεί να επιτευχθεί σε 15 έως 20 λεπτά. Η διάσπαση πεπτιδίων υπερήχων μπορεί να εφαρμοστεί στη διάσπαση προστατευμένων αμινοξέων και πεπτιδίων που συνδέονται με ρητίνες πολυστυρολίου μέσω δεσμών βενζυλεστέρα.
Υπερήχων διάσπαση των πεπτιδίων από ρητίνη πολυστυρενίου δίνει υψηλές αποδόσεις πεπτιδίων σε υψηλή καθαρότητα, χωρίς racemization, μέσα σε μια ταχεία διαδικασία.
(μελέτη και γραφικό: ©Anuradha και Ravindranath, 1995)
Υπερηχητικά αναστατωμένος αντιδραστήρας για βελτιωμένη και επιταχυνόμενη σύνθεση πεπτιδίων. Η εικόνα δείχνει το υπερήχων UP200St σε αναδευόμενο γυάλινο αντιδραστήρα.
Υπερήχων υψηλής απόδοσης για σύνθεση πεπτιδίων
Hielscher Υπέρηχοι προσφέρει διάφορες υπερήχων λύση για άμεση και έμμεση υπερήχηση. Ισχυροί και με ακρίβεια ελεγχόμενοι επεξεργαστές υπερήχων παρέχουν ακριβώς τη σωστή ποσότητα ενέργειας υπερήχων στο δοχείο αντίδρασης. Είτε χρησιμοποιείτε σύριγγες, σωλήνες, πλάκες πολλαπλών φρεατίων, ή γυάλινους αντιδραστήρες ως δοχείο σύνθεσης, Hielscher Υπέρηχοι προσφέρει το πιο κατάλληλο υπερήχων για την εφαρμογή πεπτιδίων σας.
- προσαρμοσμένα πεπτίδια
- μεγάλης κλίμακας παραγωγή πεπτιδίων
- βιβλιοθήκες πεπτιδίων
Πολλές συνθέσεις πεπτιδίων πραγματοποιούνται σε σύριγγες (π.χ. αντιδραστήρες σύριγγας). Ο υπερηχητικός αναδευτήρας σύριγγας Hielscher υπερήχων υπερήχων το πεπτιδικό διάλυμα που συνδέει τα κύματα υπερήχων μέσω του τοιχώματος της σύριγγας στο υγρό. Ο υπερηχητικός αναδευτήρας σύριγγας είναι μία από τις πιο δημοφιλείς λύσεις υπερήχων για την υπερηχητικά υποβοηθούμενη σύνθεση πεπτιδίων.
Το υπερηχητικό cuphorn είναι ένα κατάλληλο εργαλείο για την υπερήχηση έως και 5 αγγείων αντιδραστήρα, ενώ το VialTweeter μπορεί να χωρέσει έως και δέκα σωλήνες αντίδρασης συν επιπλέον πέντε μεγαλύτερα αγγεία μέσω εξαρτήματος σύσφιξης.
Για άλλους τύπους αντιδραστήρων, όπως οι αντιδραστήρες στερεάς φάσης Merrifield ή Kamysz, καθώς και άλλα δοχεία και αντιδραστήρες από πολυπροπυλένιο ή βοριοπυριτικό γυαλί, η Hielscher προσφέρει συσκευές υπερήχων για έμμεση και άμεση υπερηχοθεραπεία με εξατομικευμένη βάση στήριξης τύπου «clamp-on» ή φλάντζα.
Φυσικά, οι μεγαλύτεροι αντιδραστήρες από γυαλί με ανάδευση, π.χ. για σύνθεση σε φάση διαλύματος, μπορούν εύκολα να εξοπλιστούν με υπερηχητικούς αισθητήρες (γνωστούς και ως σονοτρόδια ή υπερηχητικά κέρατα) οποιουδήποτε μεγέθους.
- Διάφοροι τύποι υπερήχων
- άμεση και έμμεση υπερήχηση
- Ακριβής έλεγχος έντασης
- ακριβής έλεγχος θερμοκρασίας
- Συνεχές ή παλμικό υπερηχογράφημα
- Έξυπνες λειτουργίες, προγραμματιζόμενες συσκευές
- διαθέσιμο για κάθε τόμο
- γραμμική επεκτασιμότητα
Για τη σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση σε πλάκες πολλαπλών φρεατίων/μικροτιτλοδότησης, η συσκευή UIP400MTP αποτελεί την ιδανική επιλογή. Η υπερηχητική σπηλαίωση μεταφέρεται έμμεσα και ομοιόμορφα στα πολυάριθμα φρεάτια δειγμάτων, εξασφαλίζοντας εξαιρετική μεταφορά μάζας και αντίδραση σύνθεσης. Παρακολουθήστε το παρακάτω βίντεο για να δείτε το Το υπερηχητικό σύστημα για μικροπλάκες UIP400MTP σε δράση!
Επικοινωνήστε μαζί μας! / Ρωτήστε μας!
Hielscher Υπέρηχοι κατασκευάζει υψηλής απόδοσης υπερήχων ομογενοποιητές για την ανάμειξη εφαρμογών, διασπορά, γαλακτωματοποίηση και εκχύλιση σε εργαστήριο, πιλοτική και βιομηχανική κλίμακα.
Αξιόλογα στοιχεία σχετικά με τη σύνθεση πεπτιδίων με υπερήχους
Τι είναι τα πεπτίδια;
Τα πεπτίδια είναι ενώσεις όπου πολλαπλά αμινοξέα συνδέονται μέσω δεσμών αμιδίου, των λεγόμενων πεπτιδικών δεσμών. Όταν δεσμεύεται σε πολύπλοκες δομές – Συνήθως αποτελούνται από 50 ή περισσότερα αμινοξέα -, αυτές οι μεγάλες πεπτιδικές δομές ονομάζονται πρωτεΐνες. Τα πεπτίδια είναι ένα βασικό δομικό στοιχείο της ζωής και εκπληρώνουν πολλές λειτουργίες στο σώμα.
Πώς λειτουργεί η σύνθεση πεπτιδίων;
Στην οργανική χημεία, τη μοριακή βιολογία και την επιστήμη της ζωής, η σύνθεση πεπτιδίων είναι η διαδικασία παραγωγής πεπτιδίων. Τα πεπτίδια συντίθενται χημικά μέσω αντίδρασης συμπύκνωσης της καρβοξυλικής ομάδας ενός αμινοξέος στην αμινομάδα ενός άλλου αμινοξέος . Οι στρατηγικές προστασίας ομάδων (επίσης προστατευτικών ομάδων) χρησιμοποιούνται συνήθως προκειμένου να αποφευχθούν ανεπιθύμητες παρενέργειες με τις διάφορες πλευρικές αλυσίδες αμινοξέων.
Η χημική (in vitro) σύνθεση πεπτιδίων ξεκινά συχνότερα με σύζευξη της καρβοξυλομάδας του εισερχόμενου αμινοξέος (C-terminus) στο Ν-άκρο της αναπτυσσόμενης πεπτιδικής αλυσίδας. Σε αντίθεση με αυτή τη σύνθεση C-to-N, η φυσική πρωτεϊνική βιοσύνθεση μακρών πεπτιδίων σε ζωντανούς οργανισμούς συμβαίνει προς την αντίθετη κατεύθυνση. Αυτό σημαίνει ότι στη βιοσύνθεση, το Ν-άκρο του εισερχόμενου αμινοξέος συνδέεται με το C-άκρο της πρωτεϊνικής αλυσίδας (N-to-C).
Τα περισσότερα πρωτόκολλα έρευνας και ανάπτυξης για τη σύνθεση πεπτιδίων βασίζονται σε μεθόδους στερεάς φάσης, ενώ μέθοδοι σύνθεσης φάσης διαλύματος μπορούν να βρεθούν σε μεγάλης κλίμακας βιομηχανική παραγωγή πεπτιδίων.
Ποια είναι η τρέχουσα κατάσταση της τεχνολογίας στον τομέα της σύνθεσης πεπτιδίων;
SUS-SPPS (Βιώσιμη SPPS με τη βοήθεια υπερήχων) Έχει αποδειχθεί ότι η μέθοδος αυτή περιορίζει τη διαδικασία σε μόλις δύο στάδια ανά κύκλο (συνδυασμός σύζευξης/κλεισίματος/αποπροστασίας + μία πλύση), μειώνοντας σημαντικά την κατανάλωση διαλύτη και τον χρόνο. (βλ. Mottola et al., 2025)
TAPS με τη βοήθεια υπερήχων πρόκειται για έναν αναδυόμενο συνδυασμό με αποδεδειγμένη επιτυχία σε ολικές συνθέσεις (π.χ. λιποβακτίνη) και εξετάζεται από εταιρείες CDMO για την παραγωγή δραστικών φαρμακευτικών ουσιών (API).
Ανακαλύψτε τα πλεονεκτήματα της σύνθεσης πεπτιδίων με τη μέθοδο TAGGING, με τη βοήθεια υπερήχων!
συνεχής επεξεργασία εξετάζεται ως περαιτέρω βελτίωση – Έχουν περιγραφεί πλατφόρμες συνεχούς σύνθεσης «one-pot» με τη βοήθεια σιλυλιωμένων δεικτών.
Ο τομέας εξελίσσεται προς τις αρχές της πράσινης χημείας, με τα υπερηχητικά κύματα και την τεχνολογία TAPS να συμβάλλουν και τα δύο στη μείωση της χρήσης διαλυτών, στη μείωση της ποσότητας των αντιδραστηρίων και στη βελτίωση της βιωσιμότητας.
Βιβλιογραφία / Αναφορές
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Υπέρηχοι κατασκευάζει υψηλής απόδοσης υπερήχων ομογενοποιητές από εργαστήριο προς βιομηχανικό μέγεθος.