Σχηματισμός αμυλοειδών ινιδίων με τη συσκευή υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP

Τα αμυλοειδή ινίδια, όπως και οι κρύσταλλοι, σχηματίζονται μέσω μιας διαδικασίας πυρήνωσης και επακόλουθης ανάπτυξης. Ωστόσο, λόγω του υψηλού φραγμού ελεύθερης ενέργειας της πυρήνωσης, ο αυθόρμητος σχηματισμός αμυλοειδών ινιδίων συμβαίνει μόνο μετά από παρατεταμένη λανθάνουσα φάση. Η κατεργασία με υπερήχους έχει αναδειχθεί σε ισχυρό εργαλείο για την πρόκληση πυρήνωσης του αμυλοειδούς, επιταχύνοντας έτσι σημαντικά τον σχηματισμό ινιδίων. Σε συνδυασμό με αναγνώστη μικροπλακών που χρησιμοποιεί τον φθορισμό της θειοφλαβίνης T (ThT), η κατεργασία με υπερήχους επιτρέπει την ανίχνευση αμυλοειδών ινιδίων υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας σε πολλαπλά δείγματα ταυτόχρονα.

Σχηματισμός αμυλοειδών ινιδίων επαγόμενος από υπερήχους με τη συσκευή υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP

Με τη συσκευή υπερήχων πλακών πολλαπλών βοθρίων UIP400MTP μπορούν να συντεθούν γρήγορα μεγάλες ποσότητες αμυλοειδών ινιδίων ίδιας ποιότητας για ερευνητικούς σκοπούς. Αυτή η αποδοτική προσέγγιση επιτρέπει τη μελέτη της αμυλοειδογόνου ικανότητας των πρωτεϊνών. Η τεχνική αυτή διευκολύνει τον γρήγορο και αναπαραγώγιμο σχηματισμό αμυλοειδών ινιδίων, όπως καταδείχθηκε με τη β2-μικροσφαιρίνη (β2-m), μια αμυλοειδογόνο πρωτεΐνη που σχετίζεται με την αμυλοείδωση που συνδέεται με την αιμοκάθαρση.

Απλή πειραματική προσέγγιση: Σχηματισμός αμυλοειδών ινιδίων επαγόμενος από υπερήχους

Για την πρόκληση σχηματισμού ινιδίων, μια μικροπλάκα 96 βοθρίων τοποθετήθηκε στο κέντρο της συσκευής υπερήχων πλακών πολλαπλών βοθρίων UIP400MTP, η οποία εξασφαλίζει ομοιόμορφη έκθεση όλων των βοθρίων στους υπερήχους. Οι πειραματικές συνθήκες ήταν οι εξής:

Κάθε βοθρίο περιείχε 0,2 ml διαλύματος β2-μικροσφαιρίνης (0,3 mg/ml, pH 2,5) με προσθήκη 5 μM ThT.
Η πλάκα υποβλήθηκε σε κύκλους κατεργασίας με υπερήχους, όπως κατεργασία με υπερήχους διάρκειας 1 λεπτού ακολουθούμενη από παύση 9 λεπτών.
Μετά την κατεργασία με υπερήχους, ο φθορισμός της ThT μετρήθηκε με αναγνώστη μικροπλακών.

(πρβλ. So et al., 2011)

Το Hielscher UIP400MTP είναι η πλέον ευέλικτη συσκευή υπερήχων για πλάκες πολλαπλών φρεατίων, πλάκες PCR ή σωληνάρια δειγμάτων. Με συνεχή ισχύ υπερήχων 400 βατ, έχει σχεδιαστεί για εφαρμογές όπως λύση κυττάρων, γαλακτωματοποίηση, εκχύλιση πρωτεϊνών, κατακερματισμός DNA / RNA, αποσυσσωμάτωση, εκχύλιση από δείγματα FFPE, αποκόλληση κυττάρων και βιοϋμενίων ή γαλακτωματοποίηση. Το UIP400MTP δεν είναι λουτρό υπερήχων. Είναι μια διάταξη υπερήχων υψηλής έντασης τύπου κυπέλλου για εστιασμένη υπερήχηση. Αυτή η ισχυρή συσκευή υπερήχων χωρίς επαφή εξασφαλίζει ομοιόμορφη υπερήχηση σε όλα τα φρεάτια της τυπικής σας πλάκας. Παρέχει ακριβή έλεγχο του πλάτους ταλάντωσης, της ισχύος και της παλμικής λειτουργίας. Ο ενσωματωμένος χρονοδιακόπτης και ο αισθητήρας θερμοκρασίας εξασφαλίζουν σταθερά αποτελέσματα. Η συσκευή υπερήχων πλακών UIP400MTP ψύχει τα δείγματα με υδατόλουτρο, με προαιρετική εξωτερική μονάδα ψύξης.

Σύγκριση με τη συμβατική ανάδευση

Σε σύγκριση με τις παραδοσιακές μεθόδους ανάδευσης, η κατεργασία με υπερήχους μείωσε δραστικά τη λανθάνουσα φάση του σχηματισμού ινιδίων. Υπό συμβατικές συνθήκες ανακίνησης μικροπλακών, μόνο 1 στα 10 βοθρία εμφάνισε αυξημένο φθορισμό ThT μετά από 20 ώρες. Αντίθετα, με τη χρήση κυκλικής κατεργασίας με υπερήχους (15 λεπτά κατεργασίας με υπερήχους ακολουθούμενα από 5 λεπτά ηρεμίας), ανιχνεύθηκε σημαντική αύξηση του φθορισμού ThT αμέσως μετά την πρώτη κατεργασία με υπερήχους.

Ταχεία επιτάχυνση της κινητικής σχηματισμού ινιδίων

Τα αποτελέσματα των So et al. (2011) κατέδειξαν ότι ο αυθόρμητος σχηματισμός ινιδίων β2-μικροσφαιρίνης σε pH 2,5 μπορεί να επιταχυνθεί από αρκετές ώρες σε μόλις 10–15 λεπτά με κατεργασία με υπερήχους.
Οι εικόνες μικροσκοπίας ατομικής δύναμης (AFM) επιβεβαίωσαν ότι τα ινίδια που δημιουργήθηκαν με κατεργασία με υπερήχους διάρκειας 10 λεπτών κάθε 15 λεπτά δεν διακρίνονταν μορφολογικά από εκείνα που σχηματίστηκαν με κατεργασία με υπερήχους διάρκειας 1 λεπτού κάθε 10 λεπτά. Αυτό αναδεικνύει την αναπαραγωγιμότητα και την ανθεκτικότητα της μεθόδου σχηματισμού αμυλοειδών ινιδίων με επαγωγή από υπερήχους.

Η συσκευή υπερήχων πλακών πολλαπλών βοθρίων UIP400MTP επιταχύνει τον σχηματισμό αμυλοειδών ινιδίων μέσω πυρήνωσης με υπερήχους

Εικόνες AFM αμυλοειδών ινιδίων που παρήχθησαν με κατεργασία με υπερήχους διάρκειας 1 λεπτού κάθε 10 λεπτά (i), με κατεργασία με υπερήχους διάρκειας 10 λεπτών κάθε 15 λεπτά (ii) και με αντίδραση ενοφθαλμισμού χωρίς κατεργασία με υπερήχους (iii). Η λευκή ράβδος κλίμακας αντιστοιχεί σε 1 μm.
Μελέτη και εικόνες: ©So et al., 2011

Σχηματισμός ινιδίων σε συνθήκες ουδέτερου pH

Ακόμη και σε συνθήκες ουδέτερου pH, ο σχηματισμός ινιδίων επιτεύχθηκε μετά από λανθάνοντα χρόνο 1,5 ωρών, καταδεικνύοντας ότι η κατεργασία με υπερήχους μειώνει σημαντικά τον ενεργειακό φραγμό της πυρήνωσης και της ανάπτυξης. Αυτό υποστηρίζει περαιτέρω την υπόθεση ότι ο σχηματισμός αμυλοειδών ινιδίων είναι πρωτίστως μια φυσική αντίδραση, η οποία περιορίζεται σε μεγάλο βαθμό από τον ενεργειακό φραγμό της πυρήνωσης, τον οποίο η κατεργασία με υπερήχους μειώνει αποτελεσματικά.

Επίδραση στην έρευνα για νοσήματα που σχετίζονται με το αμυλοειδές

Ο εύκολος και αξιόπιστος σχηματισμός αμυλοειδών ινιδίων με τη συσκευή υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP έχει σημαντικές προεκτάσεις για την έρευνα της νόσου Alzheimer (AD) και άλλων διαταραχών που σχετίζονται με το αμυλοειδές, όπως η νόσος Parkinson, ο διαβήτης τύπου II και οι συστηματικές αμυλοειδώσεις. Στην AD, η συσσωμάτωση του β-αμυλοειδούς (Aβ) αποτελεί βασικό παθολογικό χαρακτηριστικό, ωστόσο η μελέτη της κινητικής σχηματισμού των ινιδίων του παραμένει δύσκολη λόγω των παρατεταμένων λανθανουσών φάσεων και της μεταβλητότητας των συμβατικών μεθόδων. Ο σχηματισμός ινιδίων που προκαλείται από την κατεργασία με υπερήχους επιταχύνει την πυρήνωση, εξασφαλίζοντας υψηλή αναπαραγωγιμότητα και μειωμένη μεταβλητότητα, κάτι που είναι κρίσιμο για τον έλεγχο πιθανών αναστολέων και την κατανόηση των αμυλοειδογόνων μηχανισμών. Επιπλέον, η υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα του UIP400MTP επιτρέπει μεγάλης κλίμακας διερευνήσεις της εσφαλμένης αναδίπλωσης και της συσσωμάτωσης των πρωτεϊνών, διευκολύνοντας την ανακάλυψη θεραπευτικών παραγόντων που μπορούν να ρυθμίσουν τον σχηματισμό ινιδίων και ενδεχομένως να μετριάσουν την εξέλιξη της νευροεκφύλισης.

Η μελέτη αυτή καθιερώνει την κατεργασία με υπερήχους μέσω της συσκευής υπερήχων πλακών πολλαπλών βοθρίων UIP400MTP ως μια εξαιρετικά αποδοτική μέθοδο για την επιτάχυνση του σχηματισμού αμυλοειδών ινιδίων. Τα βασικά πλεονεκτήματα αυτής της προσέγγισης περιλαμβάνουν:

Θεαματική μείωση του λανθάνοντος χρόνου για τον σχηματισμό ινιδίων.
Ομοιόμορφη έκθεση όλων των βοθρίων στους υπερήχους, που επιτρέπει αναπαραγώγιμο σχηματισμό ινιδίων.
Δυνατότητα ελέγχου υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας, που την καθιστά κατάλληλη για αναζητήσεις της αμυλοειδογόνου ικανότητας των πρωτεϊνών σε ολόκληρο το γονιδίωμα.

Συνδυάζοντας την κατεργασία με υπερήχους με την ανίχνευση φθορισμού ThT, η μέθοδος αυτή παρέχει μια γρήγορη, κλιμακώσιμη και αξιόπιστη πλατφόρμα για τη μελέτη του σχηματισμού αμυλοειδών ινιδίων. Δεδομένης της αποδοτικότητάς της και της δυνατότητας υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας, η προσέγγιση αυτή ενδέχεται να διευκολύνει την εύκολη σύνθεση αμυλοειδών ινιδίων για βιοφυσική και φαρμακευτική έρευνα, προσφέροντας ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο για μελέτες σχετικές με το αμυλοειδές και για τον έλεγχο φαρμάκων.

Ζητήστε περισσότερες πληροφορίες

Παρακαλούμε χρησιμοποιήστε την παρακάτω φόρμα για να ζητήσετε πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με τη συσκευή εστιασμένων υπερήχων UIP400MTP, τη χρήση της για τον σχηματισμό αμυλοειδών ινιδίων και τις τιμές. Θα χαρούμε να συζητήσουμε μαζί σας την προετοιμασία των δειγμάτων σας και να σας προσφέρουμε την καλύτερη συσκευή υπερήχων που ικανοποιεί τις ερευνητικές σας ανάγκες!

Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου (υποχρεωτική)

Αριθμός τηλεφώνου

Όνομα

Ενδιαφέρον

Σχετικά θέματα

Βιβλιογραφία / Αναφορές

FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
Masatomo So, Hisashi Yagi, Kazumasa Sakurai, Hirotsugu Ogi, Hironobu Naiki, Yuji Goto (2011): Ultrasonication-Dependent Acceleration of Amyloid Fibril Formation. Journal of Molecular Biology, Volume 412, Issue 4, 2011. 568-577.
Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.

Συχνές ερωτήσεις

Τι είναι η πρωτογενής πυρήνωση του αμυλοειδούς;

Η πρωτογενής πυρήνωση του αμυλοειδούς είναι το αρχικό στάδιο που καθορίζει την ταχύτητα σχηματισμού των αμυλοειδών ινιδίων, κατά το οποίο μονομερείς πρωτεΐνες υφίστανται διαμορφωτικές αλλαγές και αυτοσυναρμολογούνται σε έναν κρίσιμο πυρήνα. Ο πυρήνας αυτός χρησιμεύει ως πρότυπο για περαιτέρω συσσωμάτωση.

Πώς σχηματίζεται ένα ινίδιο στην αμυλοείδωση;

Στην αμυλοείδωση, οι εσφαλμένα αναδιπλωμένες πρωτεΐνες συσσωματώνονται μέσω πολυμερισμού εξαρτώμενου από την πυρήνωση. Μόλις σχηματιστεί ένας πυρήνας, τα μονομερή επιμηκύνονται γρήγορα σχηματίζοντας ινίδια πλούσια σε β-πτυχωτές επιφάνειες μέσω δευτερογενούς πυρήνωσης και ανάπτυξης καθοδηγούμενης από πρότυπο, οδηγώντας σε εναποθέσεις αμυλοειδούς.

Τι είναι ο πολυμορφισμός των αμυλοειδών ινιδίων;

Ο πολυμορφισμός των αμυλοειδών ινιδίων αναφέρεται σε δομικές παραλλαγές των ινιδίων που σχηματίζονται από την ίδια πρωτεΐνη. Διαφορές στη μορφολογία των ινιδίων, στη διάταξη των πρωτοϊνιδίων και στη μοριακή συσκευασία προκύπτουν λόγω περιβαλλοντικών συνθηκών, μεταλλάξεων ή διαφορετικών οδών συσσωμάτωσης.

Ποια είναι η διαφορά μεταξύ αμυλοειδών ινιδίων και πλακών;

Τα αμυλοειδή ινίδια είναι γραμμικά πρωτεϊνικά συσσωματώματα πλούσια σε β-πτυχωτές επιφάνειες, ενώ οι αμυλοειδείς πλάκες είναι εξωκυττάριες εναποθέσεις συσσωματωμένων ινιδίων, συχνά αναμεμειγμένων με λιπίδια, μέταλλα και κυτταρικά υπολείμματα, όπως παρατηρείται σε νευροεκφυλιστικές νόσους όπως η νόσος Alzheimer.

Ποια είναι η διαφορά μεταξύ α-συνουκλεΐνης και αμυλοειδούς;

Η α-συνουκλεΐνη είναι μια νευρωνική πρωτεΐνη που συμμετέχει στη συναπτική λειτουργία, αλλά σε παθολογικές συνθήκες αναδιπλώνεται εσφαλμένα και σχηματίζει ινίδια που μοιάζουν με αμυλοειδή. Ο όρος «αμυλοειδές» είναι ένας γενικός όρος για ινιδιακά συσσωματώματα εσφαλμένα αναδιπλωμένων πρωτεϊνών, ενώ τα ινίδια α-συνουκλεΐνης είναι ειδικά για νόσους όπως η νόσος Parkinson.

Τι είναι ένα πρωτεϊνικό ινίδιο;

Ένα πρωτεϊνικό ινίδιο είναι ένα εξαιρετικά οργανωμένο, νηματοειδές συσσωμάτωμα πλούσιο σε β-πτυχωτές επιφάνειες, το οποίο σχηματίζεται από εσφαλμένα αναδιπλωμένες ή μερικώς αποδιπλωμένες πρωτεΐνες. Αυτά τα ινίδια είναι συνήθως αδιάλυτα και προκύπτουν μέσω πολυμερισμού εξαρτώμενου από την πυρήνωση. Συνδέονται με διάφορες παθολογικές καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένων των αμυλοειδώσεων και των νευροεκφυλιστικών νόσων (π.χ. Alzheimer, Parkinson). Ωστόσο, υπάρχουν και ορισμένα λειτουργικά πρωτεϊνικά ινίδια σε βιολογικά συστήματα, όπως οι ίνες curli στα βακτήρια και τα ινίδια μεταξιού στις αράχνες.