Σχηματισμός αμυλοειδούς ινιδίου χρησιμοποιώντας το UIP400MTP Microplate Sonicator
Τα ινίδια αμυλοειδούς, όπως και οι κρύσταλλοι, σχηματίζονται μέσω μιας διαδικασίας πυρήνωσης και επακόλουθης ανάπτυξης. Ωστόσο, λόγω του υψηλού φραγμού ελεύθερης ενέργειας της πυρήνωσης, ο αυθόρμητος σχηματισμός ινιδίου αμυλοειδούς εμφανίζεται μόνο μετά από παρατεταμένη φάση υστέρησης. Υπερήχους έχει αναδειχθεί ως ένα ισχυρό εργαλείο για την πρόκληση πυρήνωσης αμυλοειδούς, επιταχύνοντας έτσι σημαντικά το σχηματισμό ινιδίων. Όταν συνδυάζεται με έναν αναγνώστη μικροπλακών χρησιμοποιώντας φθορισμό θειοφλαβίνης Τ (ThT), υπερήχους επιτρέπει την ανίχνευση υψηλής απόδοσης ινιδίων αμυλοειδούς σε πολλαπλά δείγματα ταυτόχρονα.
Υπερήχων επαγόμενος σχηματισμός ινιδίου αμυλοειδούς με το UIP400MTP Microplate Sonicator
Με τον UIP400MTP υπερήχων πλάκας πολλαπλών φρεατίων, ινίδια αμυλοειδούς ίδιας ποιότητας σε μεγάλες ποσότητες μπορούν να συντεθούν γρήγορα για ερευνητικούς σκοπούς. Αυτή η αποτελεσματική προσέγγιση επιτρέπει τη μελέτη της πρωτεϊνικής αμυλοειδογένεσης. Αυτή η τεχνική διευκολύνει την ταχεία και αναπαραγώγιμη αμυλοειδή μαρμαρυγή, όπως αποδεικνύεται με τη β2-μικροσφαιρίνη (β2-m), μια αμυλοειδογόνο πρωτεΐνη που σχετίζεται με αμυλοείδωση που σχετίζεται με αιμοκάθαρση.
Απλή πειραματική προσέγγιση: Υπερήχων επαγόμενη μαρμαρυγή αμυλοειδούς
Για να προκληθεί σχηματισμός ινιδίων, τοποθετήθηκε μια μικροπλάκα 96 φρεατίων στο κέντρο του υπερήχων πλάκας UIP400MTP πολλαπλών φρεατίων, η οποία εξασφαλίζει ομοιόμορφη έκθεση υπερήχων σε όλα τα πηγάδια. Οι πειραματικές συνθήκες ήταν οι εξής:
- Κάθε κοιλότητα περιείχε 0,2 ml διαλύματος β2-μικροσφαιρίνης (0,3 mg/ml, pH 2,5) συμπληρωμένο με 5 μM ThT.
- Η πλάκα υποβλήθηκε σε κύκλους υπερήχων, όπως 1-λεπτό υπερήχους ακολουθούμενη από 9 λεπτά παύσης.
- Μετά την υπερήχηση, ο φθορισμός ThT μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών.
(πρβλ. So et al., 2011)
Το UIP400MTP δεν είναι λουτρό υπερήχων. Είναι ένα κέρατο κυπέλλου υψηλής έντασης για εστιασμένη υπερήχηση. Αυτός ο ισχυρός υπερήχων χωρίς επαφή παρέχει ομοιόμορφη υπερήχηση σε όλα τα πηγάδια της τυπικής πλάκας φρεατίου. Έχετε ακριβή έλεγχο του πλάτους, της ισχύος και του παλμού. Ένας ενσωματωμένος χρονοδιακόπτης και αισθητήρας θερμοκρασίας εξασφαλίζει σταθερά αποτελέσματα. Ο υπερηχητής UIP400MTP πλάκας ψύχει δείγματα με υδατόλουτρο (προαιρετικός εξωτερικός ψύκτης).
Σύγκριση με συμβατική ανάδευση
Σε σύγκριση με τις παραδοσιακές μεθόδους ανάδευσης, υπερήχους μείωσε δραστικά τη φάση υστέρησης του σχηματισμού ινιδίου. Υπό συμβατικές συνθήκες ανάδευσης μικροπλακών, μόνο 1 στις 10 κοιλότητες παρουσίασε αυξημένο φθορισμό ThT μετά από 20 ώρες. Αντίθετα, χρησιμοποιώντας κυκλική υπερήχους (15 λεπτά υπερήχηση ακολουθούμενη από 5 λεπτά ηρεμία), ανιχνεύθηκε σημαντική αύξηση φθορισμού ThT αμέσως μετά την πρώτη θεραπεία με υπερήχους.
Ταχεία επιτάχυνση της κινητικής της μαρμαρυγής
Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από τους So et al. (2011) έδειξαν ότι ο αυθόρμητος σχηματισμός ινιδίου β2-μικροσφαιρίνης σε pH 2.5 μπορεί να επιταχυνθεί από αρκετές ώρες σε μόλις 10-15 λεπτά με υπερήχους.
Οι εικόνες μικροσκοπίας ατομικής δύναμης (AFM) επιβεβαίωσαν ότι τα ινίδια που παράγονται μέσω υπερήχων 10 λεπτών κάθε 15 λεπτά ήταν μορφολογικά δυσδιάκριτα από εκείνα που σχηματίστηκαν χρησιμοποιώντας υπερήχους 1 λεπτού κάθε 10 λεπτά. Αυτό υπογραμμίζει την αναπαραγωγιμότητα και την ευρωστία της υπερηχητικά επαγόμενης αμυλοειδούς μαρμαρυγής.
AFM εικόνες ινιδίων αμυλοειδούς που παράγονται από 1-min υπερήχους κάθε 10 min (i), από 10-min υπερήχηση κάθε 15 min (ii), και από την αντίδραση σποράς χωρίς υπερήχους (iii). Η λευκή ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει 1 μm.
Μελέτη και εικόνες: ©So et al., 2011
Μαρμαρυγή σε συνθήκες ουδέτερου pH
Ακόμη και υπό ουδέτερες συνθήκες pH, ο σχηματισμός ινιδίου επιτεύχθηκε μετά από χρόνο υστέρησης 1,5 ωρών, αποδεικνύοντας ότι η υπερήχους μειώνει σημαντικά το ενεργειακό φράγμα στην πυρήνωση και την ανάπτυξη. Αυτό υποστηρίζει περαιτέρω την υπόθεση ότι η μαρμαρυγή αμυλοειδούς είναι κυρίως μια φυσική αντίδραση, που περιορίζεται σε μεγάλο βαθμό από το ενεργειακό φράγμα πυρήνωσης, το οποίο η υπερήχους μειώνει αποτελεσματικά.
Επιπτώσεις στην έρευνα για τις ασθένειες που σχετίζονται με το αμυλοειδές
Ο εύκολος και αξιόπιστος σχηματισμός ινιδίων αμυλοειδούς χρησιμοποιώντας τον υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP έχει σημαντικές επιπτώσεις στην έρευνα της νόσου του Alzheimer (AD) και σε άλλες διαταραχές που σχετίζονται με το αμυλοειδές, όπως η νόσος του Parkinson, ο διαβήτης τύπου II και οι συστηματικές αμυλοδόσεις. Στην AD, η συσσωμάτωση αμυλοειδούς-β (Aβ) αποτελεί βασικό παθολογικό χαρακτηριστικό, ωστόσο η μελέτη της κινητικής της μαρμαρυγής παραμένει δύσκολη λόγω των φάσεων μεγάλης καθυστέρησης και της μεταβλητότητας στις συμβατικές μεθόδους. Υπερήχους-οδηγείται ινίδιο σχηματισμό επιταχύνει πυρήνωση, εξασφαλίζοντας υψηλή αναπαραγωγιμότητα και μειωμένη μεταβλητότητα, η οποία είναι ζωτικής σημασίας για τον έλεγχο των δυνητικών αναστολέων και την κατανόηση των αμυλοειδογόνων μηχανισμών. Επιπλέον, η ικανότητα υψηλής απόδοσης του UIP400MTP επιτρέπει μεγάλης κλίμακας έρευνες σχετικά με την εσφαλμένη αναδίπλωση και συσσωμάτωση πρωτεϊνών, διευκολύνοντας την ανακάλυψη θεραπευτικών παραγόντων που μπορούν να ρυθμίσουν τον σχηματισμό ινιδίων και ενδεχομένως να μετριάσουν τη νευροεκφυλιστική εξέλιξη.
Το UIP400MTP εξασφαλίζει αξιόπιστη προετοιμασία δειγμάτων και εύκολη ενσωμάτωση με τις υπάρχουσες ροές εργασίας εργαστηρίου
Αυτή η μελέτη καθιερώνει υπερήχους χρησιμοποιώντας το UIP400MTP υπερήχων πλάκα πολλαπλών φρεατίων ως μια εξαιρετικά αποτελεσματική μέθοδος για την επιτάχυνση του σχηματισμού ινιδίου αμυλοειδούς. Τα βασικά πλεονεκτήματα αυτής της προσέγγισης περιλαμβάνουν:
- Δραματική μείωση του χρόνου υστέρησης για μαρμαρυγή.
- Ομοιόμορφη έκθεση υπερήχων σε όλα τα φρεάτια, επιτρέποντας τον αναπαραγώγιμο σχηματισμό ινιδίων.
- Ικανότητα ελέγχου υψηλής απόδοσης, καθιστώντας το κατάλληλο για αναζητήσεις πρωτεϊνικής αμυλοειδογένεσης σε όλο το γονιδίωμα.
Με την ενσωμάτωση υπερήχων με ανίχνευση φθορισμού ThT, αυτή η μέθοδος παρέχει μια ταχεία, επεκτάσιμη, και αξιόπιστη πλατφόρμα για τη μελέτη της μαρμαρυγής αμυλοειδούς. Δεδομένης της αποτελεσματικότητας και του δυναμικού υψηλής απόδοσης, αυτή η προσέγγιση μπορεί να διευκολύνει την εύκολη σύνθεση ινιδίων αμυλοειδούς για βιοφυσική και φαρμακευτική έρευνα, προσφέροντας ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο για μελέτες που σχετίζονται με το αμυλοειδές και έλεγχο φαρμάκων.
Εξαγωγή EM υψηλής απόδοσης με την πλάκα 96 φρεατίων με υπερήχους UIP400MTP
Βιβλιογραφία / Αναφορές
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Masatomo So, Hisashi Yagi, Kazumasa Sakurai, Hirotsugu Ogi, Hironobu Naiki, Yuji Goto (2011): Ultrasonication-Dependent Acceleration of Amyloid Fibril Formation. Journal of Molecular Biology, Volume 412, Issue 4, 2011. 568-577.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Συχνές Ερωτήσεις
Τι είναι η πρωτογενής πυρήνωση αμυλοειδούς;
Η πρωτογενής πυρήνωση αμυλοειδούς είναι το αρχικό, περιοριστικό βήμα στο σχηματισμό ινιδίου αμυλοειδούς, όπου οι μονομερείς πρωτεΐνες υφίστανται αλλαγές διαμόρφωσης και αυτοσυναρμολογούνται σε έναν κρίσιμο πυρήνα. Αυτός ο πυρήνας χρησιμεύει ως πρότυπο για περαιτέρω συνάθροιση.
Πώς σχηματίζεται ένα ινίδιο στην αμυλοείδωση;
Στην αμυλοείδωση, οι λανθασμένα αναδιπλωμένες πρωτεΐνες συσσωρεύονται μέσω πολυμερισμού εξαρτώμενου από πυρήνωση. Μόλις σχηματιστεί ένας πυρήνας, τα μονομερή επιμηκύνονται γρήγορα σε ινίδια πλούσια σε φύλλα β μέσω δευτερογενούς πυρήνωσης και τυποποιημένης ανάπτυξης, οδηγώντας σε εναποθέσεις αμυλοειδούς.
Τι είναι ο πολυμορφισμός αμυλοειδούς ινιδίου;
Ο πολυμορφισμός ινιδίου αμυλοειδούς αναφέρεται σε δομικές παραλλαγές σε ινίδια που σχηματίζονται από την ίδια πρωτεΐνη. Διαφορές στη μορφολογία του ινιδίου, τη διάταξη πρωτονημάτων και τη μοριακή συσκευασία προκύπτουν λόγω περιβαλλοντικών συνθηκών, μεταλλάξεων ή διαφορετικών οδών συσσωμάτωσης.
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ ινιδίων αμυλοειδούς και πλακών;
Τα ινίδια αμυλοειδούς είναι γραμμικά, πλούσια σε β φύλλα πρωτεϊνικά συσσωματώματα, ενώ οι αμυλοειδείς πλάκες είναι εξωκυτταρικές εναποθέσεις συσσωματωμένων ινιδίων, συχνά αναμεμειγμένα με λιπίδια, μέταλλα και κυτταρικά υπολείμματα, όπως παρατηρείται σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες όπως το Αλτσχάιμερ.
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ άλφα-συνουκλεΐνης και αμυλοειδούς;
Η άλφα-συνουκλεΐνη είναι μια νευρωνική πρωτεΐνη που εμπλέκεται στη συναπτική λειτουργία, αλλά σε παθολογικές καταστάσεις, αναδιπλώνεται λανθασμένα και σχηματίζει ινίδια που μοιάζουν με αμυλοειδές. “Αμυλοειδούς” είναι ένας γενικός όρος για λανθασμένα αναδιπλωμένα, ινίδια πρωτεΐνης, ενώ τα ινίδια άλφα-συνουκλεΐνης είναι ειδικά για ασθένειες όπως η νόσος του Πάρκινσον.
Τι είναι το ινίδιο πρωτεΐνης;
Ένα ινίδιο πρωτεΐνης είναι ένα εξαιρετικά διατεταγμένο, πλούσιο σε β φύλλα, νηματοειδές συσσωμάτωμα που σχηματίζεται από λανθασμένα αναδιπλωμένες ή μερικώς ξεδιπλωμένες πρωτεΐνες. Αυτά τα ινίδια είναι συνήθως αδιάλυτα και προκύπτουν μέσω πολυμερισμού εξαρτώμενου από πυρήνωση. Συνδέονται με διάφορες παθολογικές καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένων των αμυλοειδιδώσεων και των νευροεκφυλιστικών νοσημάτων (π.χ. Αλτσχάιμερ, Πάρκινσον). Ωστόσο, ορισμένα λειτουργικά ινίδια πρωτεΐνης υπάρχουν σε βιολογικά συστήματα, όπως οι ίνες curli στα βακτήρια και τα ινίδια μεταξιού στις αράχνες.
Hielscher Υπέρηχοι κατασκευάζει υψηλής απόδοσης υπερήχων ομογενοποιητές από εργαστήριο προς βιομηχανικό μέγεθος.