PMCA για ανίχνευση πριόν με υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα με τη συσκευή υπερήχησης UIP400MTP

Η συσκευή υπερήχησης πλακών πολλαπλών βοθρίων UIP400MTP προσφέρει μια ισχυρή λύση για την προετοιμασία δειγμάτων με υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα στην κυκλική ενίσχυση της λανθασμένης αναδίπλωσης πρωτεϊνών (PMCA). Παρέχοντας ομοιόμορφη κατανομή ενέργειας σε πολλαπλά βοθρία και διατηρώντας ακριβείς παραμέτρους υπερήχησης, το σύστημα αυτό επιτρέπει την ταυτόχρονη επεξεργασία πολυάριθμων δειγμάτων με εξαιρετική αναπαραγωγιμότητα. Αυτές οι δυνατότητες είναι κρίσιμες για τη βελτιστοποίηση της PMCA με σκοπό την ανίχνευση πριόν σε χαμηλές συγκεντρώσεις σε απαιτητικά βιολογικά δείγματα, όπως το σάλιο, όπου αναστολείς της δοκιμασίας μπορούν να συγκαλύψουν τα αποτελέσματα.

Οι πριονικές νόσοι, όπως η χρόνια εξασθενητική νόσος (CWD) στα ελαφίδια και η νόσος Creutzfeldt-Jakob (CJD) στον άνθρωπο, είναι νευροεκφυλιστικές διαταραχές που προκαλούνται από λανθασμένα αναδιπλωμένες πριονικές πρωτεΐνες (PrP^Sc). Στις νόσους αυτές παρατηρούνται συχνά χαμηλά επίπεδα μολυσματικών πριόν σε σωματικά υγρά, όπως το σάλιο, το αίμα και τα ούρα, γεγονός που δυσχεραίνει τη διάγνωση και την έρευνα. Η οριζόντια μετάδοση της CWD μέσω πριόν που αποβάλλονται σε περιβαλλοντικά υποστρώματα έχει ιδιαίτερα σημαντικές επιπτώσεις στη διαχείριση της άγριας πανίδας και στην οικολογική υγεία. Ομοίως, σε νόσους όπως η νόσος Creutzfeldt-Jakob, η αξιόπιστη ενίσχυση λανθασμένα αναδιπλωμένων πριονικών πρωτεϊνών από ανθρώπινα δείγματα είναι κρίσιμη για την πρόοδο της διαγνωστικής και την κατανόηση της εξέλιξης της νόσου.

Η εφαρμογή ενός τροποποιημένου πρωτοκόλλου PMCA επιτρέπει την παράκαμψη κοινών αναστολέων της δοκιμασίας (π.χ. βλεννινών στο σάλιο) και την επίτευξη υψηλής ευαισθησίας στην ανίχνευση πριόν τα οποία διαφορετικά θα ήταν μη ανιχνεύσιμα ή θα έδιναν αμφίσημα αποτελέσματα με τεχνικές όπως η μετατροπή που επάγεται από ανακίνηση σε πραγματικό χρόνο (RT-QuIC). Αυτές οι εξελίξεις βελτιώνουν την ανίχνευση πριόν για διάφορες νόσους, καθιστώντας την PMCA απαραίτητο εργαλείο για την έρευνα και τη διαγνωστική των πριόν. Η συσκευή υπερήχησης πλακών πολλαπλών βοθρίων UIP400MTP διευκολύνει την PMCA υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας, υποβάλλοντας σε υπερήχηση πολυάριθμα δείγματα σε μικροπλάκες (π.χ. πλάκες 6, 24 ή 96 βοθρίων) ή σε φιαλίδια τοποθετημένα σε βάση σωληναρίων.

Πρωτόκολλο για κυκλική ενίσχυση της λανθασμένης αναδίπλωσης πρωτεϊνών (PMCA) με υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα

Το ακόλουθο πρωτόκολλο επιτρέπει την αποτελεσματική επεξεργασία μεγάλου αριθμού δειγμάτων υπό ακριβώς τις ίδιες συνθήκες, για αξιόπιστα ερευνητικά αποτελέσματα.

Προετοιμασία δειγμάτων

Αρχικό υλικό:
Προετοιμάστε τα δείγματα με:

• Επαναιώρηση ιζημάτων εκχύλισης με σαρκοσύλη σε υπόστρωμα PMCA.
• Απευθείας εμβολιασμός ομογενοποιημάτων εγκεφάλου ή δειγμάτων αίματος με σπόρους πρίον.

Υπόστρωμα:

• Χρησιμοποιήστε ομογενοποίημα εγκεφάλου 10% (wt/vol) που έχει παρασκευαστεί από διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν την PrP^C (π.χ. ποντίκια Tg).
• Ομογενοποιήστε τον εγκεφαλικό ιστό σε:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Αποθηκεύστε το υπόστρωμα στους -80ºC μέχρι τη χρήση.

Διάταξη δειγμάτων σε μικροπλάκα ή σωληνάρια:
Σωληνάρια:

• Προσθέστε 90 μL υποστρώματος ομογενοποιήματος εγκεφάλου και εμβολιάστε με 10 μL δείγματος (π.χ. αίμα, ομογενοποίημα εγκεφάλου ή ίζημα σαρκοσύλης).
• Τοποθετήστε 3 σφαιρίδια Teflon (διαμέτρου 1,59-mm ή 2,38-mm) σε κάθε σωληνάριο των 0,2 mL.
• Τοποθετήστε τα σωληνάρια σε στατό συμβατό με τη συσκευή υπερήχων UIP400MTP.

Μικροπλάκα 6 βοθρίων:

• Προσθέστε 5 mL υποστρώματος ομογενοποιήματος εγκεφάλου και εμβολιάστε με 500 μL δείγματος ανά κοιλότητα.
• Προσθέστε 3 σφαιρίδια Teflon σε κάθε κοιλότητα.

Διαδικασία PMCA

Τοποθέτηση:
Τοποθετήστε το στατό σωληναρίων ή την πλάκα μικροτιτλοδότησης 6 κοιλοτήτων στη συσκευή υπερήχων UIP400MTP σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Πρόγραμμα κύκλων:
Εκτελέστε 144 κύκλους PMCA ως εξής:

• Επώαση: 29 λεπτά και 30 δευτερόλεπτα στους 37°C.
• Υπερήχηση: 30 δευτερόλεπτα σε πλάτος 60%.
• Παρακολουθήστε τη θερμοκρασία: Χρησιμοποιήστε τον συνδεόμενο αισθητήρα θερμοκρασίας για να παρακολουθείτε τη θερμοκρασία του δείγματος και προγραμματίστε το UIP400MTP σε μέγιστη θερμοκρασία 48–50°C.

Επόμενοι γύροι:
Μετά την ολοκλήρωση του πρώτου γύρου των 144 κύκλων, μεταφέρετε ένα κλάσμα του ενισχυμένου υλικού:

• Αραιώστε 10 φορές σε φρέσκο υπόστρωμα ομογενοποιήματος εγκεφάλου διαγονιδιακών ποντικιών.
• Εκτελέστε 96 κύκλους PMCA για τους επόμενους γύρους, διατηρώντας τις ίδιες παραμέτρους υπερήχησης.
• Συνεχίστε για τον επιθυμητό αριθμό γύρων (συνήθως έως 5).

Ανίχνευση της PrP^Sc

1. Πέψη με πρωτεϊνάση K:
   – Επεξεργαστείτε τα δείγματα με Πρωτεϊνάση K (50 μg/mL) στους 37°C για 1 ώρα.
   – Τερματίστε την πέψη προσθέτοντας ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS και βράζοντας για 10 λεπτά.
2. Ανάλυση Western blot:
   – Αναλύστε τα πεφθέντα δείγματα χρησιμοποιώντας:
   – Αντισώματα αντι-PrP 6H4 ή PRC1.
   – Εκτελέστε SDS-PAGE και μεταφορά σε μεμβράνες PVDF για ανίχνευση.

 

Το Hielscher UIP400MTP είναι η πλέον ευέλικτη συσκευή υπερήχων για πλάκες πολλαπλών φρεατίων, πλάκες PCR ή σωληνάρια δειγμάτων. Με συνεχή ισχύ υπερήχων 400 βατ, έχει σχεδιαστεί για εφαρμογές όπως λύση κυττάρων, γαλακτωματοποίηση, εκχύλιση πρωτεϊνών, κατακερματισμός DNA / RNA, αποσυσσωμάτωση, εκχύλιση από δείγματα FFPE, αποκόλληση κυττάρων και βιοϋμενίων ή γαλακτωματοποίηση. Το UIP400MTP δεν είναι λουτρό υπερήχων. Είναι μια διάταξη υπερήχων υψηλής έντασης τύπου κυπέλλου για εστιασμένη υπερήχηση. Αυτή η ισχυρή συσκευή υπερήχων χωρίς επαφή εξασφαλίζει ομοιόμορφη υπερήχηση σε όλα τα φρεάτια της τυπικής σας πλάκας. Παρέχει ακριβή έλεγχο του πλάτους ταλάντωσης, της ισχύος και της παλμικής λειτουργίας. Ο ενσωματωμένος χρονοδιακόπτης και ο αισθητήρας θερμοκρασίας εξασφαλίζουν σταθερά αποτελέσματα. Η συσκευή υπερήχων πλακών UIP400MTP ψύχει τα δείγματα με υδατόλουτρο, με προαιρετική εξωτερική μονάδα ψύξης.

 

Επεξεργαστείτε περισσότερα δείγματα για πιο αξιόπιστα αποτελέσματα

Η συσκευή υπερήχησης πλακών πολλαπλών βοθρίων UIP400MTP βελτιώνει σημαντικά την αποτελεσματικότητα και τη δυνατότητα κλιμάκωσης της κυκλικής ενίσχυσης της λανθασμένης αναδίπλωσης πρωτεϊνών (PMCA), αντιμετωπίζοντας τον παραδοσιακά χρονοβόρο χαρακτήρα της διαδικασίας. Επιτρέποντας την ταυτόχρονη επεξεργασία έως και 96 δειγμάτων σε πλάκα 96 βοθρίων, το σύστημα απλοποιεί τις ροές εργασίας PMCA, διατηρώντας παράλληλα ακριβείς και ομοιόμορφες συνθήκες υπερήχησης σε όλα τα βοθρία. Αυτή η υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα ελαχιστοποιεί τους χειροκίνητους χειρισμούς, μειώνει τα στάδια που απαιτούν πολλή εργασία και εξασφαλίζει αναπαραγωγιμότητα, καθιστώντας το απαραίτητο εργαλείο για την έρευνα των πριόν. Είτε διερευνάται η χρόνια εξασθενητική νόσος είτε η νόσος Creutzfeldt-Jakob, το UIP400MTP διευκολύνει μελέτες μεγάλης κλίμακας με μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα, επιτρέποντας στους ερευνητές να ανταποκρίνονται στις απαιτήσεις των σύγχρονων διαγνωστικών και επιστημονικών εφαρμογών.

---

---

Βιβλιογραφία / Παραπομπές

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.