PMCA για ανίχνευση υψηλής απόδοσης πριόν χρησιμοποιώντας το UIP400MTP Sonicator
Ο υπερηχητικός πλάκας UIP400MTP πολλαπλών φρεατίων προσφέρει μια ισχυρή λύση για την προετοιμασία δείγματος υψηλής απόδοσης σε κυκλική ενίσχυση εσφαλμένης αναδίπλωσης πρωτεϊνών (PMCA). Παρέχοντας ομοιόμορφη κατανομή ενέργειας σε πολλαπλά φρεάτια και διατηρώντας ακριβείς παραμέτρους υπερήχων, αυτό το σύστημα επιτρέπει την ταυτόχρονη επεξεργασία πολυάριθμων δειγμάτων με εξαιρετική αναπαραγωγιμότητα. Αυτές οι δυνατότητες είναι κρίσιμες για τη βελτιστοποίηση του PMCA για την ανίχνευση πριόν σε χαμηλές συγκεντρώσεις σε δύσκολα βιολογικά δείγματα, όπως το σάλιο, όπου οι αναστολείς ανάλυσης μπορούν να αποκρύψουν τα αποτελέσματα.
Οι ασθένειες Prion, όπως η χρόνια εξασθενητική νόσος (CWD) στους ελαφίδες και η νόσος Creutzfeldt-Jakob (CJD) στους ανθρώπους, είναι νευροεκφυλιστικές διαταραχές που προκαλούνται από λανθασμένα αναδιπλωμένες πρωτεΐνες πριόν (PrPSc). Αυτές οι ασθένειες συχνά περιλαμβάνουν χαμηλά επίπεδα μολυσματικών πριόν στα σωματικά υγρά, όπως το σάλιο, το αίμα και τα ούρα, περιπλέκοντας τη διάγνωση και την έρευνα. Η οριζόντια μετάδοση της ΧΕΝ μέσω πριόν που αποβάλλεται σε περιβαλλοντικές μήτρες έχει ιδιαίτερα σημαντικές επιπτώσεις στη διαχείριση της άγριας πανίδας και χλωρίδας και στην οικολογική υγεία. Ομοίως, σε ασθένειες όπως η νόσος Creutzfeldt-Jakob, η αξιόπιστη ενίσχυση των λανθασμένα αναδιπλωμένων πρωτεϊνών πριόν από ανθρώπινα δείγματα είναι ζωτικής σημασίας για την προώθηση της διάγνωσης και την κατανόηση της εξέλιξης της νόσου.
Ενίσχυση λανθασμένης αναδίπλωσης πρωτεΐνης υψηλής απόδοσης με το UIP400MTP High-Throughput Sonicator
Η εφαρμογή ενός τροποποιημένου πρωτοκόλλου PMCA επιτρέπει την παράκαμψη κοινών αναστολέων ανάλυσης (π.χ. βλεννίνες στο σάλιο) και την επίτευξη υψηλής ευαισθησίας στην ανίχνευση πριόν που διαφορετικά θα ήταν μη ανιχνεύσιμα ή διφορούμενα χρησιμοποιώντας τεχνικές όπως η μετατροπή που προκαλείται από σεισμό σε πραγματικό χρόνο (RT-QuIC). Αυτές οι εξελίξεις ενισχύουν την ανίχνευση πριόν για διάφορες ασθένειες, καθιστώντας το PMCA απαραίτητο εργαλείο για την έρευνα και τη διάγνωση πρίον. Ο υπερηχητικός πλάκα πολλαπλών φρεατίων διευκολύνει UIP400MTP PMCA υψηλής απόδοσης υπερήχων πολυάριθμα δείγματα σε μικροπλάκες (π.χ. πλάκες 6, 24 ή 96 φρεατίων) ή φιαλίδια σε ράφι σωλήνων.
Πρωτόκολλο για κυκλική ενίσχυση εσφαλμένης αναδίπλωσης πρωτεϊνών υψηλής απόδοσης (PMCA)
Το ακόλουθο πρωτόκολλο επιτρέπει την αποτελεσματική επεξεργασία μεγάλου αριθμού δειγμάτων υπό τις ίδιες ακριβώς συνθήκες για αξιόπιστα ερευνητικά αποτελέσματα.
Προετοιμασία δείγματος
Πρώτη ύλη:
Προετοιμασία δειγμάτων με:
- Επαναιώρηση σφαιριδίων εκχύλισης σαρκοσυλίου σε υπόστρωμα PMCA.
- Άμεσα ομογενοποιημένα εγκεφαλικά ή δείγματα αίματος με σπόρους πρίον.
Υπόστρωμα:
- Χρησιμοποιήστε ομογενοποιημένο εγκέφαλο 10% (wt/vol) παρασκευασμένο από διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν την PrPC (π.χ. ποντίκια Tg).
- Ομογενοποίηση του εγκεφαλικού ιστού σε:
– 1× PBS.
– 150 mM NaCl.
– 1% Triton X-100. - Αποθηκεύστε το υπόστρωμα στους -80ºC μέχρι τη χρήση.
Ρύθμιση δείγματος σε μικροπλάκα ή σωλήνες:
Σωλήνες:
- Προστίθενται 90 μL ομογενοποιημένου υποστρώματος εγκεφάλου και σπόρων με 10 μL δείγματος (π.χ. αίμα, ομογενοποιημένο εγκέφαλο ή σφαιρίδιο σαρκοσυλίου).
- Τοποθετήστε 3 χάντρες από τεφλόν (διαμέτρου 1,59 mm ή 2,38 mm) σε κάθε σωλήνα των 0,2 mL.
- Τοποθετήστε τους σωλήνες σε ένα ράφι συμβατό με το UIP400MTP υπερήχων.
Μικροπλάκα 6 φρεατίων:
- Προστίθενται 5 mL ομογενοποιημένου υποστρώματος εγκεφάλου και σπόρων με 500 μL δείγματος ανά κοιλότητα.
- Προσθέστε 3 χάντρες τεφλόν σε κάθε φρεάτιο.
Διαδικασία PMCA
Τοποθέτηση:
Τοποθετήστε τη σχάρα σωλήνα ή τη μικροπλάκα 6 φρεατίων στον υπερηχητικό UIP400MTP σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
Ποδηλατικό Πρόγραμμα:
Εκτελέστε 144 κύκλους PMCA ως εξής:
- Επώαση: 29 λεπτά και 30 δευτερόλεπτα στους 37°C.
- Κατεργασία με υπερήχους: 30 δευτερόλεπτα σε πλάτος 60%.
- Παρακολουθήστε τη θερμοκρασία: Χρησιμοποιήστε τον αισθητήρα θερμοκρασίας με δυνατότητα σύνδεσης για να παρακολουθήσετε τη θερμοκρασία του δείγματος και να προγραμματίσετε το UIP400MTP σε μέγιστη θερμοκρασία 48–50 ° C.
Επόμενοι γύροι:
Μετά την ολοκλήρωση του πρώτου γύρου των 144 κύκλων, μεταφέρεται ένα κλάσμα του ενισχυμένου υλικού:
- Αραιώστε 10 φορές σε φρέσκο διαγονιδιακό ομογενοποιημένο υπόστρωμα εγκεφάλου ποντικού.
- Εκτελέστε 96 κύκλους PMCA για τους επόμενους γύρους, διατηρώντας τις ίδιες παραμέτρους υπερήχων.
- Συνεχίστε για τον επιθυμητό αριθμό γύρων (συνήθως έως 5).
Ανίχνευση PrPSc
- Πέψη πρωτεϊνάσης Κ:
– Τα δείγματα υποβάλλονται σε επεξεργασία με πρωτεϊνάση Κ (50 μg/ml) στους 37°C επί 1 ώρα.
– Τερματίστε την πέψη προσθέτοντας ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS και βράζοντας για 10 λεπτά. - Ανάλυση Western Blot:
– Αναλύστε τα χωνευμένα δείγματα χρησιμοποιώντας:
– 6H4 ή PRC1 αντι-PrP αντισώματα.
– Εκτελέστε SDS-PAGE και μεταφέρετε σε μεμβράνες PVDF για ανίχνευση.
Το UIP400MTP εξασφαλίζει αξιόπιστη προετοιμασία δειγμάτων και εύκολη ενσωμάτωση με τις υπάρχουσες ροές εργασίας εργαστηρίου
Το UIP400MTP δεν είναι λουτρό υπερήχων. Είναι ένα κέρατο κυπέλλου υψηλής έντασης για εστιασμένη υπερήχηση. Αυτός ο ισχυρός υπερήχων χωρίς επαφή παρέχει ομοιόμορφη υπερήχηση σε όλα τα πηγάδια της τυπικής πλάκας φρεατίου. Έχετε ακριβή έλεγχο του πλάτους, της ισχύος και του παλμού. Ένας ενσωματωμένος χρονοδιακόπτης και αισθητήρας θερμοκρασίας εξασφαλίζει σταθερά αποτελέσματα. Ο υπερηχητής UIP400MTP πλάκας ψύχει δείγματα με υδατόλουτρο (προαιρετικός εξωτερικός ψύκτης).
Επεξεργαστείτε περισσότερα δείγματα για πιο αξιόπιστα αποτελέσματα
Ο UIP400MTP υπερήχων πλάκας πολλαπλών φρεατίων ενισχύει σημαντικά την αποτελεσματικότητα και την επεκτασιμότητα της κυκλικής ενίσχυσης εσφαλμένης αναδίπλωσης πρωτεϊνών (PMCA), αντιμετωπίζοντας την παραδοσιακά χρονοβόρα φύση της διαδικασίας. Επιτρέποντας την ταυτόχρονη επεξεργασία έως και 96 δειγμάτων σε μια πλάκα 96 φρεατίων, το σύστημα βελτιστοποιεί τις ροές εργασίας PMCA διατηρώντας παράλληλα ακριβείς και ομοιόμορφες συνθήκες υπερήχων σε όλα τα πηγάδια. Αυτή η ικανότητα υψηλής απόδοσης ελαχιστοποιεί τον χειρωνακτικό χειρισμό, μειώνει τα βήματα έντασης εργασίας και εξασφαλίζει αναπαραγωγιμότητα, καθιστώντας το απαραίτητο εργαλείο για την έρευνα πρίον. Είτε πρόκειται για τη διερεύνηση της χρόνιας εξασθενητικής νόσου είτε για τη νόσο Creutzfeldt-Jakob, η UIP400MTP διευκολύνει μελέτες μεγάλης κλίμακας με μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα, επιτρέποντας στους ερευνητές να ανταποκριθούν στις απαιτήσεις των σύγχρονων διαγνωστικών και επιστημονικών εφαρμογών.
Βιβλιογραφία / Αναφορές
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP για PMCA υψηλής απόδοσης
Συχνές Ερωτήσεις
Τι είναι τα Prions;
Τα πριόνια είναι λανθασμένα αναδιπλωμένες πρωτεΐνες ικανές να προκαλέσουν ανώμαλη αναδίπλωση φυσιολογικών, κυτταρικών πρωτεϊνών, ιδιαίτερα στον εγκέφαλο. Σε αντίθεση με τα βακτήρια ή τους ιούς, τα πράιονς στερούνται νουκλεϊνικών οξέων και πολλαπλασιάζονται μέσω ενός μηχανισμού αυτο-templating, οδηγώντας σε προοδευτικές νευροεκφυλιστικές ασθένειες όπως η νόσος Creutzfeldt-Jakob, η σπογγώδης εγκεφαλοπάθεια των βοοειδών (ασθένεια των τρελών αγελάδων) και η τρομώδης νόσος στα πρόβατα. Η αντοχή τους στις τυποποιημένες διαδικασίες αποστείρωσης υπογραμμίζει τη μοναδική παθογένειά τους και θέτει σημαντικές προκλήσεις σε ιατρικά και ερευνητικά περιβάλλοντα.
Τι είναι η τεχνική PMCA;
Η Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA) είναι μια εργαστηριακή τεχνική που χρησιμοποιείται για την ενίσχυση των λανθασμένα αναδιπλωμένων πρωτεϊνών πριόν (PrP^Sc) in vitro. Μιμείται τη μετατροπή της φυσιολογικής κυτταρικής πρωτεΐνης πριόν (PrP^C) στην αναδιπλωμένη μολυσματική μορφή της (PrP^Sc), χαρακτηριστικό γνώρισμα των ασθενειών πρίον. Η διαδικασία περιλαμβάνει κύκλους επώασης και υπερήχων για την επιτάχυνση της συνάθροισης του PrP ^ Sc, καθιστώντας το ένα ισχυρό εργαλείο για την ανίχνευση χαμηλών επιπέδων πριόνων.
Ποια πρωτεΐνη Misfolding προκαλεί τη νόσο Creutzfeldt Jakob?
Η νόσος Creutzfeldt-Jakob (CJD) προκαλείται από την εσφαλμένη αναδίπλωση της πρωτεΐνης πριόν (PrP). Η κανονική ισομορφή (PrPC) υιοθετεί μια μη φυσιολογική, πλούσια σε β φύλλα διαμόρφωση (PrPSc) που γίνεται μολυσματική, σχηματίζοντας συσσωματώματα αμυλοειδούς στον εγκέφαλο, οδηγώντας σε νευροεκφυλισμό.
Τι είναι η εσφαλμένη αναδίπλωση πρωτεϊνών κυκλικής ενίσχυσης μολυσματικών πριόνων;
Η κυκλική ενίσχυση εσφαλμένης αναδίπλωσης πρωτεϊνών (PMCA) είναι μια μέθοδος ενίσχυσης της μολυσματικής μορφής των πριόν (PrPSc) με επανειλημμένη επώαση φυσιολογικής PrPC με μικρές ποσότητες PrPSc. Κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου, η PrPSc καταλύει την εσφαλμένη αναδίπλωση της PrPC, και συσσωματώματα θραυσμάτων υπερήχων, δημιουργώντας περισσότερες θέσεις σποράς. Αυτό μιμείται την αντιγραφή πριόν in vivo και επιτρέπει την ανίχνευση ευαίσθητων πριόν σε βιολογικά δείγματα.
Τι προκαλεί την εσφαλμένη αναδίπλωση του PrP;
Η PrP αναδιπλώνεται λανθασμένα στην παθογόνο PrPSc Η φόρμα μπορεί να ενεργοποιηθεί από:
- Αυθόρμητη λανθασμένη αναδίπλωση σε σποραδικές ασθένειες πρίον.
- Γενετικές μεταλλάξεις στο γονίδιο PRNP (π.χ. οικογενείς ασθένειες πρίον).
- Έκθεση σε λοιμώδη PrPSc μέσω μολυσμένων τροφίμων, ιατρικών διαδικασιών ή άλλων μέσων.
- Περιβαλλοντικοί ή δομικοί παράγοντες όπως pH, ιόντα μετάλλων ή συν-παράγοντες που αποσταθεροποιούν την PrPC.
Τι είναι το RT-QuIC Test;
Το Real-Time Quaking-Induced Conversion (RT-QuIC) είναι μια εξαιρετικά ευαίσθητη διαγνωστική δοκιμασία για ασθένειες πρίον. Ανιχνεύει PrPSc ενισχύοντας την ικανότητά του να μετατρέπει ανασυνδυασμένη PrPC σε αναδιπλωμένα αδρανή. Η δοκιμή χρησιμοποιεί φθορισμό με βάση την ανίχνευση του σχηματισμού ινιδίου αμυλοειδούς, καθιστώντας την χρήσιμη για τη διάγνωση ασθενειών όπως η CJD στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (CSF) ή σε άλλους ιστούς.
Hielscher Υπέρηχοι κατασκευάζει υψηλής απόδοσης υπερήχων ομογενοποιητές από εργαστήριο προς βιομηχανικό μέγεθος.