Fermentace s podporou ultrazvuku pro výrobu bioethanolu

Fermentace s podporou ultrazvuku může zlepšit výrobu bioethanolu tím, že podporuje rozklad složitých sacharidů na jednodušší cukry, které jsou pak pro kvasinky snáze dostupné k přeměně na ethanol. Sonikace současně zlepšuje efektivitu propustnosti buněčné stěny kvasinek, což umožňuje rychlejší uvolňování ethanolu a zvýšení celkové produkce. Fermentace bioethanolu s podporou ultrazvuku tak vede k vyšší míře konverze a vyšším výtěžkům.

Fermentace

Fermentace může být aerobní (= oxidativní fermentace) nebo anaerobní proces, který se v biotechnologických aplikacích využívá k přeměně organického materiálu pomocí bakteriálních, houbových nebo jiných biologických buněčných kultur nebo pomocí enzymů. Při fermentaci se získává energie z oxidace organických sloučenin, např. sacharidů.
Cukr je nejběžnějším substrátem fermentace, z něhož po fermentaci vznikají produkty jako kyselina mléčná, laktóza, ethanol a vodík. Při alkoholové fermentaci se fermentací vyrábí ethanol – zejména pro použití jako palivo, ale také pro alkoholické nápoje. Když cukr metabolizují určité kmeny kvasinek – jako je Saccharomyces cerevisiae – přeměňují kvasinkové buňky výchozí materiál na ethanol a oxid uhličitý.

Níže uvedené chemické rovnice shrnují tuto přeměnu:

Je-li výchozím materiálem škrob, např. z kukuřice, musí být škrob nejprve přeměněn na cukr. U bioethanolu používaného jako palivo je pro přeměnu škrobu nutná hydrolýza. Hydrolýza se obvykle urychluje kyselým nebo enzymatickým ošetřením nebo kombinací obou. Fermentace obvykle probíhá při teplotě kolem 35–40 °C.
Přehled různých fermentačních procesů:

Potraviny:

• výroba & konzervace
• mléčné výrobky (mléčná fermentace), např. jogurt, podmáslí, kefír
• mléčně kvašená zelenina, např. kimči, miso, natto, cukemono, kysané zelí
• vývoj aromatických látek, např. sójová omáčka
• rozklad tříslovin, např. čaj, kakao, káva, tabák
• alkoholické nápoje, např. pivo, víno, whisky

Léčiva:

• výroba léčivých látek, např. inzulin, kyselina hyaluronová

Bioplyn / ethanol:

• zlepšení výroby bioplynu / bioethanolu

Různé výzkumné práce a testy v laboratorním a pilotním měřítku ukázaly, že ultrazvuk zlepšuje fermentační proces tím, že zpřístupňuje více biomasy pro enzymatickou fermentaci. V následující části budou podrobněji popsány účinky ultrazvuku v kapalině.

Účinky ultrazvukového zpracování kapalin

Pomocí vysoce výkonného / nízkofrekvenčního ultrazvuku lze generovat vysoké amplitudy. Vysoce výkonný / nízkofrekvenční ultrazvuk lze proto využít ke zpracování kapalin, jako je míchání, emulgace, dispergace a deaglomerace nebo mletí.
Při sonikaci kapalin s vysokou intenzitou vedou zvukové vlny šířící se do kapalného média ke střídání cyklů vysokého tlaku (komprese) a nízkého tlaku (zředění), jejichž rychlost závisí na frekvenci. Během cyklu nízkého tlaku vytvářejí vysoce intenzivní ultrazvukové vlny v kapalině malé vakuové bubliny neboli dutiny. Když bubliny dosáhnou objemu, při kterém již nemohou absorbovat energii, během cyklu vysokého tlaku prudce zkolabují. Tento jev se nazývá kavitace. Kavitace, tedy „vznik, růst a implozivní kolaps bublin v kapalině. Kavitační kolaps vyvolává intenzivní lokální ohřev (~5000 K), vysoké tlaky (~1000 atm) a obrovské rychlosti ohřevu a ochlazování (>109 K/sec)“ a proudy kapaliny (~400 km/h)“. (Suslick 1998)

Kavitaci lze vytvářet různými způsoby, například pomocí vysokotlakých trysek, mísičů typu rotor-stator nebo ultrazvukových procesorů. Ve všech těchto systémech se vstupní energie přeměňuje na tření, turbulence, vlny a kavitaci. Podíl vstupní energie, který se přemění na kavitaci, závisí na několika faktorech popisujících pohyb zařízení generujícího kavitaci v kapalině. Intenzita zrychlení je jedním z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících účinnou přeměnu energie na kavitaci. Vyšší zrychlení vytváří vyšší tlakové rozdíly. To zase zvyšuje pravděpodobnost vzniku vakuových bublin namísto vzniku vln šířících se kapalinou. Čím vyšší je tedy zrychlení, tím vyšší je podíl energie, který se přemění na kavitaci.
U ultrazvukového měniče popisuje intenzitu zrychlení amplituda kmitání. Vyšší amplitudy vedou k účinnějšímu vytváření kavitace. Kromě intenzity by kapalina měla být urychlována tak, aby vznikaly minimální ztráty v podobě turbulencí, tření a tvorby vln. Optimálním způsobem je k tomu jednosměrný pohyb. Změnou intenzity a parametrů sonikačního procesu může být ultrazvuk velmi intenzivní nebo velmi šetrný. Díky tomu je ultrazvuk velmi všestranným nástrojem pro různé aplikace.

Mezi šetrné aplikace, při nichž se používá mírná sonikace za mírných podmínek, patří odplyňování, emulgace a aktivace enzymů. K intenzivním aplikacím s ultrazvukem vysoké intenzity / vysokého výkonu (většinou za zvýšeného tlaku) patří mokré mletí, deaglomerace a zmenšování velikosti částic a také dispergace. U mnoha aplikací, jako je extrakce, dezintegrace nebo sonochemie, závisí požadovaná intenzita ultrazvuku na konkrétním sonikovaném materiálu. Díky rozmanitosti parametrů, které lze přizpůsobit konkrétnímu procesu, umožňuje ultrazvuk najít optimum pro každý jednotlivý proces.
Kromě vynikající přeměny výkonu nabízí sonikace velkou výhodu plné kontroly nad nejdůležitějšími parametry: amplitudou, tlakem, teplotou, viskozitou a koncentrací. To nabízí možnost upravit všechny tyto parametry s cílem nalézt ideální procesní parametry pro každý konkrétní materiál. Výsledkem je vyšší účinnost i optimalizovaná efektivita.

Ultrazvuk pro zlepšení fermentačních procesů, vysvětleno na příkladu výroby bioethanolu

Bioethanol je produktem rozkladu biomasy nebo biologicky rozložitelných složek odpadu anaerobními nebo aerobními bakteriemi. Vyrobený ethanol se používá převážně jako biopalivo. Díky tomu je bioethanol obnovitelnou a ekologickou alternativou k fosilním palivům, jako je zemní plyn.
K výrobě ethanolu z biomasy lze jako surovinu použít cukr, škrob a lignocelulózový materiál. V průmyslovém měřítku výroby v současnosti převažují cukr a škrob, protože jsou ekonomicky výhodné.
Jak ultrazvuk zlepší individuální proces zákazníka se specifickou surovinou za daných podmínek, lze velmi jednoduše vyzkoušet pomocí testů proveditelnosti. V prvním kroku sonikace malého množství suspenze suroviny pomocí ultrazvukového laboratorního zařízení ukáže, zda ultrazvuk na surovinu působí.

Testování proveditelnosti

V první fázi testování je vhodné vnést do malého objemu kapaliny relativně vysoké množství ultrazvukové energie, protože se tím zvyšuje šance zjistit, zda lze dosáhnout nějakých výsledků. Malý objem vzorku také zkracuje dobu použití laboratorního zařízení a snižuje náklady na první testy.
Ultrazvukové vlny jsou do kapaliny přenášeny povrchem sonotrody. Pod povrchem sonotrody je intenzita ultrazvuku nejvyšší. Proto se upřednostňují krátké vzdálenosti mezi sonotrodou a sonikovaným materiálem. Při ozvučování malého objemu kapaliny lze vzdálenost od sonotrody udržet krátkou.
Tabulka níže uvádí typické úrovně energie/objemu pro sonikační procesy po optimalizaci. Protože první pokusy nebudou probíhat v optimální konfiguraci, ukáže intenzita a doba sonikace 10 až 50krát vyšší než typická hodnota, zda má sonikace na sonikovaný materiál nějaký účinek, či nikoli.

Proces	Energie/ objem	Objem vzorku	Výkon	Čas
Jednoduchý	< 100Ws/mL	10mL	50W	< 20 sec
Střední	100Ws/mL až 500Ws/mL	10mL	50W	20 až 100 sec
Náročný	> 500Ws/mL	10mL	50W	>100 sec

Tabulka 1 – Typické hodnoty sonikace po optimalizaci procesu

Skutečný příkon zkušebních běhů lze zaznamenat pomocí integrovaného záznamu dat (UP200Ht a UP200St), přes rozhraní PC nebo wattmetrem. V kombinaci se zaznamenanými údaji o nastavení amplitudy a teplotě lze vyhodnotit výsledky každého pokusu a stanovit základní hodnotu energie/objemu.
Pokud byla během testů zvolena optimální konfigurace, mohl by být výkon této konfigurace ověřen v kroku optimalizace a nakonec převeden do komerčního měřítka. Pro usnadnění optimalizace se důrazně doporučuje zkoumat také meze sonikace, např. teplotu, amplitudu nebo energii/objem pro konkrétní formulace. Protože ultrazvuk může mít negativní účinky na buňky, chemikálie nebo částice, je nutné prověřit kritické úrovně každého parametru, aby se následná optimalizace omezila na rozsah parametrů, v němž se negativní účinky nepozorují. Pro studii proveditelnosti se doporučují malá laboratorní nebo stolní zařízení, aby se omezily náklady na vybavení a vzorky při takových pokusech. Obecně zařízení o výkonu 100 až 1 000 wattů slouží účelům studie proveditelnosti velmi dobře. (srov. Hielscher 2005)

Optimalizace

Výsledky dosažené během studií proveditelnosti mohou vzhledem k malému zpracovanému objemu vykazovat poměrně vysokou spotřebu energie. Účelem testu proveditelnosti je však především ukázat účinky ultrazvuku na materiál. Pokud se při testování proveditelnosti projevily pozitivní účinky, je třeba vynaložit další úsilí na optimalizaci poměru energie/objem. To znamená prozkoumat ideální konfiguraci parametrů ultrazvuku tak, aby se dosáhlo nejvyššího výtěžku s co nejmenší spotřebou energie a proces byl ekonomicky co nejrozumnější a nejefektivnější. Aby bylo možné najít optimální konfiguraci parametrů – tj. dosáhnout zamýšlených přínosů s minimálním energetickým vstupem –, je nutné prozkoumat korelaci mezi nejdůležitějšími parametry amplitudou, tlakem, teplotou a složením kapaliny. V tomto druhém kroku se doporučuje přejít od dávkové sonikace k uspořádání pro kontinuální sonikaci s reaktorem s průtokovou celou, protože důležitý parametr tlaku nelze při dávkové sonikaci ovlivnit. Při sonikaci v dávce je tlak omezen na tlak okolí. Pokud sonikační proces prochází natlakovatelnou komorou průtokové cely, lze tlak zvýšit (nebo snížit), což obecně ovlivňuje ultrazvukovou kavitaci zásadním způsobem. Pomocí průtokové cely lze určit korelaci mezi tlakem a účinností procesu. Ultrazvukové procesory o výkonu mezi 500 watty a 2000 watty jsou pro optimalizaci procesu nejvhodnější.

Převedení do komerční výroby

Je-li nalezena optimální konfigurace, je další převedení do většího měřítka jednoduché, protože ultrazvukové procesy jsou plně reprodukovatelné v lineárním měřítku. To znamená, že při aplikaci ultrazvuku na identickou formulaci kapaliny při identické konfiguraci procesních parametrů je k dosažení identického výsledku zapotřebí stejné energie na objem nezávisle na měřítku zpracování. (Hielscher 2005). To umožňuje přenést optimální konfiguraci parametrů ultrazvuku do plného výrobního měřítka. Objem, který lze zpracovat ultrazvukem, je prakticky neomezený. Komerční ultrazvukové systémy s výkonem až 16 000 wattů na jednotku jsou k dispozici a lze je instalovat v klastrech. Takové klastry ultrazvukových procesorů lze instalovat paralelně nebo sériově. Díky instalaci výkonných ultrazvukových procesorů v klastrech je celkový výkon téměř neomezený, takže lze bez problémů zpracovávat velkoobjemové proudy. Pokud je nutné ultrazvukový systém přizpůsobit, např. upravit parametry pro změněnou formulaci kapaliny, lze to většinou provést výměnou sonotrody, boosteru nebo průtokové cely. Lineární škálovatelnost, reprodukovatelnost a přizpůsobivost ultrazvuku činí tuto inovativní technologii efektivní a nákladově výhodnou.

Parametry ultrazvukového zpracování

Ultrazvukové zpracování kapalin je popsáno řadou parametrů. Nejdůležitější jsou amplituda, tlak, teplota, viskozita a koncentrace. Výsledek procesu, například velikost částic, je pro danou konfiguraci parametrů funkcí energie na zpracovaný objem. Tato funkce se mění se změnami jednotlivých parametrů. Kromě toho na parametrech závisí skutečný výstupní výkon na jednotku plochy povrchu sonotrody ultrazvukového zařízení. Výstupní výkon na jednotku plochy povrchu sonotrody je povrchová intenzita (I). Povrchová intenzita závisí na amplitudě (A), tlaku (p), objemu reaktoru (VR), teplotě (T), viskozitě (η) a dalších faktorech.

Účinek vznikající kavitace závisí na povrchové intenzitě. Stejným způsobem s ní koreluje i výsledek procesu. Celkový výstupní výkon ultrazvukového zařízení je součinem povrchové intenzity (I) a plochy povrchu (S):

P [W] I [W / mm²]* S[mm²]

Amplituda

Amplituda kmitání popisuje dráhu (např. 50 µm), kterou povrch sonotrody urazí za daný čas (např. 1/20 000s při 20kHz). Čím větší je amplituda, tím vyšší je rychlost, s jakou tlak při každém zdvihu klesá a stoupá. Navíc se zvětšuje objemový posun při každém zdvihu, což vede k většímu kavitačnímu objemu (velikosti a/nebo počtu bublin). Při aplikaci na disperze vykazují vyšší amplitudy vyšší destruktivní účinek na pevné částice. Tabulka 1 uvádí obecné hodnoty pro některé ultrazvukové procesy.

Tlak

Bod varu kapaliny závisí na tlaku. Čím vyšší je tlak, tím vyšší je bod varu, a naopak. Zvýšený tlak umožňuje kavitaci při teplotách blízkých bodu varu nebo nad ním. Zvyšuje také intenzitu imploze, která souvisí s rozdílem mezi statickým tlakem a tlakem par uvnitř bubliny (srov. Vercet et al. 1999). Protože se ultrazvukový výkon a intenzita se změnami tlaku rychle mění, je vhodnější čerpadlo s konstantním tlakem. Při přivádění kapaliny do průtokové cely by čerpadlo mělo být schopné zvládnout konkrétní průtok kapaliny při vhodných tlacích. Diafragmová nebo membránová čerpadla; čerpadla s ohebnou trubicí, hadicová nebo mačkací čerpadla; peristaltická čerpadla; nebo pístová či plunžrová čerpadla vytvářejí střídavé kolísání tlaku. Upřednostňují se odstředivá čerpadla, zubová čerpadla, spirálová čerpadla a vřetenová čerpadla, která přivádějí sonikovanou kapalinu při trvale stabilním tlaku. (Hielscher 2005)

Teplota

Při sonikaci kapaliny se do média přenáší výkon. Protože ultrazvukem generované kmitání způsobuje turbulence a tření, sonikovaná kapalina se – v souladu se zákonem termodynamiky – zahřívá. Zvýšené teploty zpracovávaného média mohou materiál poškozovat a snižovat účinnost ultrazvukové kavitace. Inovativní ultrazvukové průtokové cely jsou vybaveny chladicím pláštěm (viz obrázek). Tím je zajištěna přesná kontrola teploty materiálu během ultrazvukového zpracování. Pro sonikaci menších objemů v kádince se doporučuje ledová lázeň k odvodu tepla.

Viskozita a koncentrace

Ultrazvukové mletí a dispergace jsou procesy probíhající v kapalině. Částice musí být v suspenzi, např. ve vodě, oleji, rozpouštědlech nebo pryskyřicích. Použitím ultrazvukových průtokových systémů je možné sonikovat i velmi viskózní, pastovité materiály.
Výkonný ultrazvukový procesor může pracovat při poměrně vysokých koncentracích pevných látek. Vysoká koncentrace zajišťuje účinnost ultrazvukového zpracování, protože efekt ultrazvukového mletí je způsoben srážkami mezi částicemi. Výzkumy ukázaly, že rychlost rozpadu oxidu křemičitého nezávisí na koncentraci pevných látek až do 50% hmotnostních. Zpracování předsměsí (master batches) s vysokým podílem koncentrovaného materiálu je běžným výrobním postupem využívajícím sonikaci.

Výkon a intenzita vs. energie

Povrchová intenzita a celkový výkon popisují pouze intenzitu zpracování. Pro popis sonikačního procesu tak, aby byl škálovatelný a reprodukovatelný, je nutné zohlednit sonikovaný objem vzorku a dobu působení při určité intenzitě. Pro danou konfiguraci parametrů bude výsledek procesu, např. velikost částic nebo chemická konverze, záviset na energii na objem (E/V).

Výsledek = f (E /V )

Přičemž energie (E) je součinem výstupního výkonu (P) a doby působení (t).

E[Ws] = P[W]*t[s]

Změny v konfiguraci parametrů změní funkci výsledku. To následně změní množství energie (E) potřebné pro danou hodnotu vzorku (V) k dosažení konkrétní hodnoty výsledku. Z tohoto důvodu nestačí k dosažení výsledku pouze nasadit do procesu určitý výkon ultrazvuku. Je zapotřebí propracovanější přístup k určení potřebného výkonu a konfigurace parametrů, při které má být výkon do zpracovávaného materiálu vnesen. (Hielscher 2005)

Výroba bioethanolu s podporou ultrazvuku

Je již známo, že ultrazvuk zlepšuje výrobu bioethanolu. Doporučuje se zahustit kapalinu biomasou na vysoce viskózní suspenzi, která je stále čerpatelná. Ultrazvukové reaktory zvládnou poměrně vysoké koncentrace pevných látek, takže sonikační proces může probíhat co nejefektivněji. Čím více materiálu suspenze obsahuje, tím méně nosné kapaliny, která ze sonikace nemá žádný užitek, se zpracovává. Protože vnesení energie do kapaliny podle zákona termodynamiky způsobuje její zahřívání, znamená to, že ultrazvuková energie je v co největší míře aplikována na cílový materiál. Takovým efektivním návrhem procesu se zabrání zbytečnému zahřívání přebytečné nosné kapaliny.
Ultrazvuk napomáhá extrakci intracelulárního materiálu a zpřístupňuje jej tak pro enzymatickou fermentaci. Mírné ultrazvukové ošetření může zvýšit enzymatickou aktivitu, ale pro extrakci biomasy bude zapotřebí intenzivnější ultrazvuk. Enzymy by proto měly být do suspenze biomasy přidány až po sonikaci, protože intenzivní ultrazvuk enzymy inaktivuje, což je nežádoucí účinek.

Aktuální výsledky vědeckého výzkumu:

Studie autorů Yoswathana et al. (2010) zabývající se výrobou bioethanolu z rýžové slámy ukázaly, že kombinace kyselé předúpravy a ultrazvuku před enzymatickým ošetřením vedla ke zvýšenému výtěžku cukru ve výši až 44% (vztaženo na rýžovou slámu). To ukazuje účinnost kombinace fyzikální a chemické předúpravy před enzymatickou hydrolýzou lignocelulózového materiálu na cukr. 

Graf 2 graficky znázorňuje pozitivní účinky ultrazvukového ozařování při výrobě bioethanolu z rýžové slámy. (K detoxikaci vzorků po kyselé/enzymatické předúpravě a ultrazvukové předúpravě bylo použito dřevěné uhlí.)

V jiné nedávné studii byl zkoumán vliv sonikace na extracelulární a intracelulární hladiny enzymu β-galaktosidázy. Sulaiman et al. (2011) dokázali podstatně zlepšit produktivitu výroby bioethanolu použitím ultrazvuku při řízené teplotě, který stimuloval růst kvasinek Kluyveromyces marxianus (ATCC 46537). Autoři článku shrnují, že přerušovaná sonikace výkonovým ultrazvukem (20 kHz) při pracovních cyklech ≤20% stimulovala produkci biomasy, metabolismus laktózy a produkci ethanolu u K. marxianus při relativně vysoké intenzitě sonikace 11,8Wcm². Za nejlepších podmínek zvýšila sonikace konečnou koncentraci ethanolu téměř 3,5krát oproti kontrole. To odpovídalo 3,5násobnému zvýšení produktivity ethanolu, vyžadovalo však 952W dodatečného příkonu na metr krychlový fermentačního média prostřednictvím sonikace. Tento dodatečný požadavek na energii byl jistě v rámci přijatelných provozních norem pro bioreaktory a u produktů s vysokou hodnotou by mohl být snadno kompenzován zvýšenou produktivitou.

Závěr: Přínosy fermentace s podporou ultrazvuku

Ultrazvukové ošetření se ukázalo jako účinná a inovativní technika ke zvýšení výtěžku bioethanolu. Ultrazvuk se používá především k extrakci intracelulárního materiálu z biomasy, jako je kukuřice, sójové boby, sláma, lignocelulózový materiál nebo rostlinné odpadní materiály.

• Zvýšení výtěžku bioethanolu
• Dezintegrace / destrukce buněk a uvolnění intracelulárního materiálu
• Zlepšený anaerobní rozklad
• Aktivace enzymů mírnou sonikací
• Zlepšení účinnosti procesu díky suspenzím s vysokou koncentrací

Jednoduché testování, reprodukovatelné převedení do většího měřítka a snadná instalace (i do již existujících výrobních proudů) činí z ultrazvuku ziskovou a efektivní technologii. Spolehlivé průmyslové ultrazvukové procesory pro komerční zpracování jsou k dispozici a umožňují sonikovat prakticky neomezené objemy kapalin.