Ultrazvuková výroba vysoce purifikovaných beta-glukanů Schizophyllan

Schizophyallan je houbový β-glukan s imunomodulačními vlastnostmi. Pro vysoce aktivní léčivé účinky musí mít schizophyllan nízkou molekulovou hmotnost, aby se zlepšila biologická dostupnost. Bylo prokázáno, že ultrazvuku snižuje molekulovou hmotnost schizophyllan. Jako spolehlivá a účinná metoda může být sonikace snadno použita pro výrobu schizophyllan s nízkou molekulovou hmotností.

Houby Schizophyllum a ultrazvuková extrakce beta-glukanu

Druhy houby Schizophyllum rostou v přírodě na rozkládajících se stromech po obdobích dešťů. Plodnice se sbírají v následujícím období sucha. Druhy klanoprašky (Schizophyllum) jsou bohaté na biochemické sloučeniny, jako jsou glukany, a proto se konzumují zejména v tropických zemích jako potrava a lék. Díky svým imunomodulačním, protiplísňovým, cytostatickým a antivirovým vlastnostem přilákala Schizophyllum commune, známá také jako houba Splitgill, biotechnologické a farmaceutické společnosti.
Polysacharid schizophyllan, také známý jako sizofiran, sonifilan nebo sizofilan, je hlavní β-glukan nalezený v houbách Schizophyllum, které nabízejí vysoce účinný bioaktivní β-glukan schizophyllan.
Houby Schizophyllum commune rostou v přírodě na stromech, mycellium lze kultivovat i ve fermentačním vývaru. Pro farmaceutické a kosmetické aplikace je schizofylan s nízkou molekulovou hmotností mnohem účinnější než schizofyllan s vysokou molekulovou hmotností. To je způsobeno skutečností, že schizofylan s nízkou molekulovou hmotností vykazuje výrazně lepší biologickou dostupnost a míru absorpce. Navíc je schizofylan s vysokou molekulovou hmotností často problematický v aplikacích, protože má za následek vysokou viskozitu jeho vodných roztoků.
Ultrazvukové zmenšení velikosti je vysoce účinná a spolehlivá technika ke snížení molekulové hmotnosti schizophyllan, čímž se zvyšuje kvalita molekuly β-glukanu.

Protokol pro produkci nízkomolekulárního schizofylanu

Vzhledem k tomu, že molekulová hmotnost schizophyllan vykazuje drasticky lepší biologickou dostupnost a aplikační vlastnosti, výzkumný tým Smirnou zkoumal ultrazvuku pro štěpení a zmenšení velikosti molekuly β-glukanu schizophyllan.

Ultrazvuku Schizophyllan

β-1.3(1.6)-Glucan schizophyllan (SPG) byl vyroben submerzní kultivací houby S. commune v bioreaktoru za použití sacharózy jako substrátu.
Po ukončení kultivace byl kultivační vývar zředěn demineralizovanou vodou na koncentraci schizofylanu 2 g/l a ultrazvukově zředěn ultrazvukový procesor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Německo) v recyklačním režimu při následujících parametrech a podmínkách: průtok média 50 ml/s, frekvence 20 kHz, výkon 2000 W, sonotroda typ BS2d22, booster typ B2-1,4 a amplituda 100%. Teplota kultivačního vývaru na začátku sonikace byla 25 °C. Ultrazvukový kultivační bujón (měrný energetický vstup 100 Ws/ml) byl filtrován přes hloubkový filtr Seitz HS800 pod tlakem 1,5 baru při 40 °C. Ultrazvukový schizofyllan (uSPG) pro chemickou charakterizaci byl z filtrátu vysrážen trojnásobným množstvím isopropylalkoholu při laboratorní teplotě a sušen při 60 °C po dobu 12 hodin roztoky uSPG pro imunologické studie byly připraveny následovně: (1) filtrát bujónu s ultrazvukem byl diafiltrován přes 0,1 m2 PES kazety Pall Centramate T-series (mezní hodnota 100 kDa) při 0,8 baru a diafiltrace pokračovala, dokud vodivost retentátu nebyla 20 μS/cm; (2) roztok byl koncentrován diafiltrací na koncentraci uSPG 1 g/l a sterilizován autoklávováním při teplotě 120 °C/20 min. Denaturovaný uSPG byl připraven podobným způsobem, s tím rozdílem, že NaOH byl přidán do filtrátu kultivačního bujónu v koncentraci 0,2 M a alkalizovaný roztok byl před diafiltrací inkubován po dobu 30 minut při laboratorní teplotě.

Analytické metody

Výtěžek mycelia byl odhadnut gravimetricky: kultivační vývar byl zředěn vodou 1:4, odstředěn 10000 × g při 25 °C po dobu 20 minut, sraženina byla promyta trojnásobným množstvím vody, sušila při 60 °C a zvážena. Schizophyllan byl vysrážen ze supernatantu trojnásobným množstvím isopropylalkoholu, sušen při 60 °C po dobu 24 hodin a jeho výtěžek byl stanoven gravimetricky. pO2 v kultivačním bujónu byl měřen optickou sondou Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Švýcarsko).
Dynamická viskozita kultivačního bujónu byla měřena na HAAKE Visco Testeru 6L s vřeteny 1L a 2L při 4°C a rychlosti otáčení 30 ot./min. Rychlost filtrace byla vypočtena z doby filtrace 500 ml kultivačního bujónu přes hloubkový filtr 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, USA) při tlaku 1,5 baru a teplotě 40 °C.
Molekulová hmotnost uSPG byla měřena pomocí SEC-MALLS na HPLC systému Alliance (Waters) se sériově zapojenými kolonami PL aquagel OH60 a PL aquagel OH40 a detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) byl koncentrován diafiltrací na koncentraci uSPG 1 g/l a sterilizován autoklávováním při 120°C/20 min. Denaturovaný uSPG byl připraven podobným způsobem, s tím rozdílem, že NaOH byl přidán do filtrátu kultivačního bujónu v koncentraci 0,2 M a alkalizovaný roztok byl před diafiltrací inkubován po dobu 30 minut při laboratorní teplotě.

Výsledky:
Ultrazvuková léčba byla aplikována přímo na S. commune 144-h kultivační vývar s myceliem, aby se usnadnilo následné zpracování SPG.
 
Charakteristika sonikovaného Schizophyllan: Ultrazvukový schizofyllan (uSPG) byl vysrážen z filtrátu kultivačního vývaru alkoholem a charakterizován. SEC-MALLS odhadl Mw uSPG na přibližně 1 MDa. Průměrná molekulová hmotnost schizofylanu z tekuté fermentace je přibližně 5 MDa, zatímco při pěstování v pevné fázi může dosáhnout až 10 MDa. Porovnáním molekulové hmotnosti ultrazvuku schizophyllan s molekulovou hmotností nativního neléčeného schizophyllanu lze v důsledku ultrazvuku pozorovat 5 až 10násobné snížení molekulové hmotnosti.
Sonikovaný polysacharid uSPG obsahoval 0,7% hm/w protein a 1,0% hm/w zbytek po zapálení. Hydrolyzát uSPG se skládal z glukózy s více než 99 %. Analytické výsledky naznačují, že sonikace štěpí páteř β-glukanu náhodně a boční větve zůstávají neporušené, čímž se snižuje velikost a molekulová hmotnost schizophyllan. Imunologické studie v podstatě bez proteinů a endotoxinů uSPG ukázaly, že ultrazvukový schizofylan s nízkým Mw má výraznou imunomodulační aktivitu.

 
Snížená viskozita: Ultrazvuku vedl k významnému snížení viskozity kultivačního bujónu. Během ultrazvuku se viskozita kultivačního bujónu měnila nelineárně: pokles viskozity byl rychlý na začátku ultrazvukové niky, ale později se zpomalil. Měrný energetický příkon 100 Ws/ml byl dostatečný ke snížení viskozity kultivačního bujónu téměř 7krát.

Vylepšená filtrace: Kultivační bujón ošetřený ultrazvukem protékal filtrem rychleji než neupravený kultivační bujón (měrný energetický vstup 0 Ws/ml) s vysokomolekulárním SPG. Kromě toho ultrazvuku významně snížil ztrátu produktu během filtrace. Filtrát neupraveného kultivačního bujónu s vysokomolekulárním SPG (měrný energetický vstup 0 Ws/ml) obsahoval 0,3 ± 0,07 g/l SPG, zatímco koncentrace SPG před hloubkovou filtrací byla 2 g/l. Naproti tomu filtrát 100 Ws/ml ultrazvukové kultury obsahoval SPG v koncentraci 2,2 ± 0,2 g? l, což odpovídá téměř nulové ztrátě produktu.

Závěr: Ve svém závěru výzkumný tým shrnuje, že ultrazvukové zpracování je efektivní technologií pro výrobu schizophyllanu s nízkou molekulovou hmotností, který lze následně použít v kosmetice a medicíně. Ultrazvuku při aplikaci na kompletní kultivační vývar s myceliem přináší určité výhody produkci schizofyllanu. Snižuje ztráty produktu během následného zpracování a umožňuje výrobu vysoce čištěného polysacharidu díky efektivnímu využití ultrafiltrace.
Vědci navíc zjistili, že ultrazvukové zpracování schizofylanu je snadno škálovatelné. Jedna jednotka pilotního ultrazvukového dezintegrátoru UIP2000hdT zpracovala 1 litr kultivačního vývaru za 110 s v průtokovém režimu. Produktivitu systému lze snadno zvýšit postupným připojováním dalších ultrazvukových jednotek.

 
Přečtěte si více o jednoduchém škálování extrakce hub!
 

Vysoce výkonné ultrazvukové zařízení pro zpracování houbového glukanu

Fragmentace polysacharidů, jako jsou glukany, stejně jako další bioaktivní sloučeniny, jako je chitin a chitosan, lze spolehlivě zpracovávat s vysoce výkonným ultrazvukovým zařízením Hielscher. Naše ultrasonicators mohou dodávat vysoké amplitudy, nabízejí přesnou ovladatelnost nad parametry procesu a mohou být provozovány 24 hodin denně, 7 dní v týdnu při velkém zatížení a v náročných prostředích. Řada zařízení Hielscher Ultrasonics splňuje tyto požadavky spolehlivě. Kromě vynikajícího ultrazvukového výkonu se Hielscher ultrasonicators mohou pochlubit vysokou energetickou účinností, což je významná ekonomická výhoda – zejména při použití v komerční velkosériové výrobě.
Hielscher ultrasonicators jsou vysoce výkonné systémy, které mohou být vybaveny příslušenstvím, jako jsou sonotrody, boostery, reaktory nebo průtokové buňky, aby optimálně odpovídaly vašim procesním potřebám. S digitálním barevným displejem je zajištěna možnost přednastavení ultrazvuku, automatické zaznamenávání dat na integrovanou SD kartu, dálkové ovládání prohlížeče a mnoho dalších funkcí, nejvyšší kontrola procesu a uživatelská přívětivost. Ve spojení s robustností a vysokou nosností jsou ultrazvukové systémy Hielscher vaším spolehlivým pracovním koněm ve výrobě. Snížení molekulové hmotnosti β-glukanů, jako je schizofyllan, vyžaduje silný ultrazvuk k dosažení cíleného štěpení a konečného schizofyllanového produktu vysoké kvality, který lze použít pro farmaceutické aplikace.
 
Více informací o ultrazvukové extrakci beta-glukanu z hub včetně pokynů krok za krokem najdete zde!
 
Níže uvedená tabulka vám poskytuje přibližný přehled o zpracovatelské kapacitě našich ultrasonicators: