Ultrazvuková výroba vysoce purifikovaných beta-glukanů schizofylanu

Schizofylan je houbový β-glukan s imunomodulačními vlastnostmi. Pro vysoce účinné léčebné působení musí mít schizofylan nízkou molekulovou hmotnost, aby vykazoval zlepšenou biologickou dostupnost. Bylo prokázáno, že ultrasonikace snižuje molekulovou hmotnost schizofylanu. Jako spolehlivou a účinnou metodu lze sonikaci snadno použít k výrobě schizofylanu s nízkou molekulovou hmotností.

Houby rodu Schizophyllum a ultrazvuková extrakce beta-glukanů

Druhy houby rodu Schizophyllum rostou v přírodě na odumírajících stromech po obdobích dešťů. Plodnice se sbírají v následujícím období sucha. Druhy rodu Schizophyllum jsou bohaté na biochemické sloučeniny, jako jsou glukany, a proto se konzumují zejména v tropických zemích jako potravina a lék. Díky svým imunomodulačním, antifungálním, antineoplastickým a antivirovým vlastnostem přitahuje Schizophyllum commune, známá také jako klanolístka obecná, pozornost biotechnologických a farmaceutických společností.
Polysacharid schizofylan, známý také jako sizofiran, sonifilan nebo sizofilan, je hlavním β-glukanem obsaženým v houbách rodu Schizophyllum, které poskytují vysoce účinný bioaktivní β-glukan schizofylan.
Houby Schizophyllum commune rostou v přírodě na stromech, mycelium lze také kultivovat ve fermentačním médiu. Pro farmaceutické a kosmetické aplikace je schizofylan s nízkou molekulovou hmotností mnohem účinnější než schizofylan s vysokou molekulovou hmotností. Je to dáno tím, že schizofylan s nízkou molekulovou hmotností vykazuje výrazně lepší biologickou dostupnost a míru absorpce. Navíc je schizofylan s vysokou molekulovou hmotností v aplikacích často problematický, protože způsobuje vysokou viskozitu svých vodných roztoků.
Ultrazvuková redukce velikosti je vysoce účinná a spolehlivá technika ke snížení molekulové hmotnosti schizofylanu, čímž se zvyšuje kvalita molekuly β-glukanu.

Protokol pro výrobu schizofylanu s nízkou molekulovou hmotností

Jelikož schizofylan s molekulovou hmotností vykazuje drasticky lepší biologickou dostupnost a aplikační vlastnosti, zkoumal výzkumný tým Smirnoua ultrasonikaci pro štěpení a redukci velikosti molekuly β-glukanu schizofylanu.

Ultrasonikace schizofylanu

β-1.3(1.6)-glukan schizofylan (SPG) byl vyroben submerzní kultivací houby S. commune v bioreaktoru se sacharózou jako substrátem.
Po skončení kultivace bylo kultivační médium zředěno demineralizovanou vodou na koncentraci schizofylanu 2 g/L a sonikováno pomocí ultrazvukového procesoru UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Německo) v recirkulačním režimu při následujících parametrech a podmínkách: průtok média 50 mL/s, frekvence 20 kHz, výkon 2000 W, typ sonotrody BS2d22, typ boosteru B2-1.4 a amplituda 100%. Teplota kultivačního média na začátku sonikace byla 25°C. Sonikované kultivační médium (měrný přívod energie 100 Ws/mL) bylo filtrováno přes hloubkový filtr Seitz HS800 pod tlakem 1,5 bar při 40°C. Sonikovaný schizofylan (uSPG) pro chemickou charakterizaci byl vysrážen z filtrátu trojnásobným množstvím isopropylalkoholu při laboratorní teplotě a sušen při 60°C po dobu 12h. Roztoky uSPG pro imunologické studie byly připraveny následovně: (1) filtrát sonikovaného kultivačního média byl diafiltrován přes kazetu Pall Centramate T-series PES 0,1m2 (cut-off 100 kDa) při 0,8 bar a diafiltrace pokračovala, dokud vodivost retentátu nedosáhla 20 μS/cm; (2) roztok byl zakoncentrován diafiltrací na koncentraci uSPG 1 g/L a sterilizován autoklávováním při 120°C/20 min. Denaturovaný uSPG byl připraven podobným způsobem s tím rozdílem, že k filtrátu kultivačního média byl přidán NaOH v koncentraci 0,2 M a alkalizovaný roztok byl před diafiltrací inkubován 30 min při laboratorní teplotě.

Analytické metody

Výtěžek mycelia byl stanoven gravimetricky: kultivační médium bylo zředěno vodou 1:4, centrifugováno při 10 000 × g a 25°C po dobu 20 min, sediment byl promyt trojnásobným množstvím vody, vysušen při 60°C a zvážen. Schizofylan byl vysrážen ze supernatantu trojnásobným množstvím isopropylalkoholu, vysušen při 60°C po dobu 24h a jeho výtěžek byl stanoven gravimetricky. pO2 v kultivačním médiu byl měřen optickou sondou Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Švýcarsko).
Dynamická viskozita kultivačního média byla měřena na přístroji HAAKE Visco Tester 6L s vřeteny 1L a 2L při 4°C a rychlosti otáčení 30 rpm. Rychlost filtrace byla vypočtena z doby filtrace 500 mL kultivačního média přes hloubkový filtr Seitz HS800 (Pall, USA) o rozměrech 200 × 200 mm při tlaku 1,5 bar a 40°C.
Molekulová hmotnost uSPG byla měřena metodou SEC-MALLS na systému HPLC Alliance (Waters) se sériově zapojenými kolonami PL aquagel OH60 a PL aquagel OH40 a detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) byl zakoncentrován diafiltrací na koncentraci uSPG 1 g/L a sterilizován autoklávováním při 120°C/20 min. Denaturovaný uSPG byl připraven podobným způsobem s tím rozdílem, že k filtrátu kultivačního média byl přidán NaOH v koncentraci 0,2 M a alkalizovaný roztok byl před diafiltrací inkubován 30 min při laboratorní teplotě.

Výsledky:
Ultrazvukové ošetření bylo aplikováno přímo na 144hodinové kultivační médium S. commune s myceliem, aby se usnadnilo následné zpracování SPG.

Charakteristika sonikovaného schizofylanu: Sonikovaný schizofylan (uSPG) byl vysrážen z filtrátu kultivačního média alkoholem a charakterizován. Metodou SEC-MALLS byla Mw uSPG odhadnuta na přibližně 1 MDa. Průměrná molekulová hmotnost schizofylanu z kapalné fermentace je přibližně 5 MDa, zatímco při kultivaci v pevném stavu může dosáhnout až 10 MDa. Při porovnání molekulové hmotnosti sonikovaného schizofylanu s molekulovými hmotnostmi nativního neošetřeného schizofylanu lze pozorovat 5- až 10násobné snížení molekulové hmotnosti v důsledku ultrasonikace.
Sonikovaný polysacharid uSPG obsahoval 0,7%w/w bílkovin a 1,0%w/w zbytku po žíhání. Hydrolyzát uSPG sestával z více než 99% z glukózy. Výsledky analýz naznačují, že sonikace štěpí páteř β-glukanu náhodně, přičemž postranní větve zůstávají intaktní, čímž se snižuje velikost a molekulová hmotnost schizofylanu. Imunologické studie na uSPG v podstatě prostém bílkovin a endotoxinů ukázaly, že sonikovaný schizofylan s nízkou Mw má výraznou imunomodulační aktivitu.

 
Snížená viskozita: Ultrasonikace vedla k výraznému snížení viskozity kultivačního média. Během ultrasonikace se viskozita kultivačního média měnila nelineárně: na začátku ultrasonikace byl pokles viskozity rychlý, později se však zpomalil. Měrný přívod energie 100 Ws/mL postačoval ke snížení viskozity kultivačního média téměř 7krát.

Zlepšená filtrace: Kultivační médium ošetřené ultrazvukem protékalo filtrem rychleji než neošetřené kultivační médium (měrný přívod energie 0 Ws/mL) s vysokomolekulárním SPG. Ultrasonikace navíc výrazně snížila ztráty produktu během filtrace. Filtrát neošetřeného kultivačního média s vysokomolekulárním SPG (měrný přívod energie 0 Ws/mL) obsahoval 0,3 ± 0,07 g/L SPG, zatímco koncentrace SPG před hloubkovou filtrací byla 2 g/L. Naproti tomu filtrát kultivačního média sonikovaného při 100 Ws/mL obsahoval SPG v koncentraci 2,2 ± 0,2 g/L, což odpovídá téměř nulové ztrátě produktu.

Závěr: Ve svém závěru výzkumný tým shrnuje, že ultrazvukové zpracování je účinná technologie pro výrobu nízkomolekulárního schizofylanu, který pak může být použit v kosmetice a medicíně. Ultrasonikace, je-li aplikována na celé kultivační médium s myceliem, přináší výrobě schizofylanu určité výhody. Snižuje ztráty produktu během následného zpracování a díky efektivnímu využití ultrafiltrace umožňuje výrobu vysoce purifikovaného polysacharidu.
Vědci dále zjistili, že ultrazvukové zpracování schizofylanu je snadno škálovatelné. Jedna jednotka poloprovozního ultrazvukového dezintegrátoru UIP2000hdT zpracovala v průtokovém režimu 1 litr kultivačního média za 110 s. Produktivitu systému lze snadno zvýšit sériovým zapojením dalších ultrazvukových jednotek.

Přečtěte si více o jednoduchém zvětšení měřítka extrakce z hub!
 

Vysoce výkonná ultrazvuková zařízení pro zpracování houbových glukanů

Fragmentaci polysacharidů, jako jsou glukany, i dalších bioaktivních sloučenin, jako je chitin a chitosan, lze spolehlivě provádět pomocí vysoce výkonných ultrazvukových zařízení Hielscher. Naše ultrazvukové přístroje dokážou dodávat vysoké amplitudy, nabízejí přesnou kontrolu nad procesními parametry a mohou být provozovány 24/7 pod vysokou zátěží a v náročných prostředích. Sortiment zařízení Hielscher Ultrasonics tyto požadavky spolehlivě splňuje. Kromě vynikajícího ultrazvukového výkonu se ultrazvukové přístroje Hielscher vyznačují vysokou energetickou účinností, což je významná ekonomická výhoda – zejména při nasazení v komerční velkoobjemové výrobě.
Ultrazvukové přístroje Hielscher jsou vysoce výkonné systémy, které lze vybavit příslušenstvím, jako jsou sonotrody, boostery, reaktory nebo průtokové cely, aby optimálně odpovídaly potřebám Vašeho procesu. Digitální barevný displej, možnost předvolby sonikačních cyklů, automatický záznam dat na integrovanou SD kartu, vzdálené ovládání přes prohlížeč a mnoho dalších funkcí zajišťují nejvyšší kontrolu procesu a uživatelskou přívětivost. Ve spojení s robustností a vysokou zatížitelností jsou ultrazvukové systémy Hielscher Vaším spolehlivým tahounem ve výrobě. Snížení molekulové hmotnosti β-glukanů, jako je schizofylan, vyžaduje výkonný ultrazvuk, aby bylo dosaženo cíleného štěpení a vysoce kvalitního finálního produktu schizofylanu, který lze použít pro farmaceutické aplikace.

Další informace o ultrazvukové extrakci beta-glukanů z hub včetně podrobného návodu krok za krokem naleznete zde!

Níže uvedená tabulka Vám poskytne představu o přibližné zpracovatelské kapacitě našich ultrazvukových přístrojů: