Ultrazvuková výroba vysoce purifikovaných beta-glukanů Schizophyllan
Schizophyallan je houbový β-glukan s imunomodulačními vlastnostmi. Pro vysoce aktivní léčivé účinky musí mít schizophyllan nízkou molekulovou hmotnost, aby se zlepšila biologická dostupnost. Bylo prokázáno, že ultrazvuku snižuje molekulovou hmotnost schizophyllan. Jako spolehlivá a účinná metoda může být sonikace snadno použita pro výrobu schizophyllan s nízkou molekulovou hmotností.
Houby Schizophyllum a ultrazvuková extrakce beta-glukanu
Druhy houby Schizophyllum rostou v přírodě na rozkládajících se stromech po obdobích dešťů. Plodnice se sbírají v následujícím období sucha. Druhy klanoprašky (Schizophyllum) jsou bohaté na biochemické sloučeniny, jako jsou glukany, a proto se konzumují zejména v tropických zemích jako potrava a lék. Díky svým imunomodulačním, protiplísňovým, cytostatickým a antivirovým vlastnostem přilákala Schizophyllum commune, známá také jako houba Splitgill, biotechnologické a farmaceutické společnosti.
Polysacharid schizophyllan, také známý jako sizofiran, sonifilan nebo sizofilan, je hlavní β-glukan nalezený v houbách Schizophyllum, které nabízejí vysoce účinný bioaktivní β-glukan schizophyllan.
Houby Schizophyllum commune rostou v přírodě na stromech, mycellium lze kultivovat i ve fermentačním vývaru. Pro farmaceutické a kosmetické aplikace je schizofylan s nízkou molekulovou hmotností mnohem účinnější než schizofyllan s vysokou molekulovou hmotností. To je způsobeno skutečností, že schizofylan s nízkou molekulovou hmotností vykazuje výrazně lepší biologickou dostupnost a míru absorpce. Navíc je schizofylan s vysokou molekulovou hmotností často problematický v aplikacích, protože má za následek vysokou viskozitu jeho vodných roztoků.
Ultrazvukové zmenšení velikosti je vysoce účinná a spolehlivá technika ke snížení molekulové hmotnosti schizophyllan, čímž se zvyšuje kvalita molekuly β-glukanu.

Ultrazvukový přístroj UIP2000hdT byl úspěšně použit ke snížení molekulové hmotnosti Schizophyllan, houby β-glukan
Protokol pro produkci nízkomolekulárního schizofylanu
Vzhledem k tomu, že molekulová hmotnost schizophyllan vykazuje drasticky lepší biologickou dostupnost a aplikační vlastnosti, výzkumný tým Smirnou zkoumal ultrazvuku pro štěpení a zmenšení velikosti molekuly β-glukanu schizophyllan.
Ultrazvuku Schizophyllan
β-1.3(1.6)-Glucan schizophyllan (SPG) byl vyroben submerzní kultivací houby S. commune v bioreaktoru za použití sacharózy jako substrátu.
Po ukončení kultivace byl kultivační vývar zředěn demineralizovanou vodou na koncentraci schizofylanu 2 g/l a ultrazvukově zředěn ultrazvukový procesor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Německo) v recyklačním režimu při následujících parametrech a podmínkách: průtok média 50 ml/s, frekvence 20 kHz, výkon 2000 W, sonotroda typ BS2d22, booster typ B2-1,4 a amplituda 100%. Teplota kultivačního vývaru na začátku sonikace byla 25 °C. Ultrazvukový kultivační bujón (měrný energetický vstup 100 Ws/ml) byl filtrován přes hloubkový filtr Seitz HS800 pod tlakem 1,5 baru při 40 °C. Ultrazvukový schizofyllan (uSPG) pro chemickou charakterizaci byl z filtrátu vysrážen trojnásobným množstvím isopropylalkoholu při laboratorní teplotě a sušen při 60 °C po dobu 12 hodin roztoky uSPG pro imunologické studie byly připraveny následovně: (1) filtrát bujónu s ultrazvukem byl diafiltrován přes 0,1 m2 PES kazety Pall Centramate T-series (mezní hodnota 100 kDa) při 0,8 baru a diafiltrace pokračovala, dokud vodivost retentátu nebyla 20 μS/cm; (2) roztok byl koncentrován diafiltrací na koncentraci uSPG 1 g/l a sterilizován autoklávováním při teplotě 120 °C/20 min. Denaturovaný uSPG byl připraven podobným způsobem, s tím rozdílem, že NaOH byl přidán do filtrátu kultivačního bujónu v koncentraci 0,2 M a alkalizovaný roztok byl před diafiltrací inkubován po dobu 30 minut při laboratorní teplotě.
Analytické metody
Výtěžek mycelia byl odhadnut gravimetricky: kultivační vývar byl zředěn vodou 1:4, odstředěn 10000 × g při 25 °C po dobu 20 minut, sraženina byla promyta trojnásobným množstvím vody, sušila při 60 °C a zvážena. Schizophyllan byl vysrážen ze supernatantu trojnásobným množstvím isopropylalkoholu, sušen při 60 °C po dobu 24 hodin a jeho výtěžek byl stanoven gravimetricky. pO2 v kultivačním bujónu byl měřen optickou sondou Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Švýcarsko).
Dynamická viskozita kultivačního bujónu byla měřena na HAAKE Visco Testeru 6L s vřeteny 1L a 2L při 4°C a rychlosti otáčení 30 ot./min. Rychlost filtrace byla vypočtena z doby filtrace 500 ml kultivačního bujónu přes hloubkový filtr 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, USA) při tlaku 1,5 baru a teplotě 40 °C.
Molekulová hmotnost uSPG byla měřena pomocí SEC-MALLS na HPLC systému Alliance (Waters) se sériově zapojenými kolonami PL aquagel OH60 a PL aquagel OH40 a detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) byl koncentrován diafiltrací na koncentraci uSPG 1 g/l a sterilizován autoklávováním při 120°C/20 min. Denaturovaný uSPG byl připraven podobným způsobem, s tím rozdílem, že NaOH byl přidán do filtrátu kultivačního bujónu v koncentraci 0,2 M a alkalizovaný roztok byl před diafiltrací inkubován po dobu 30 minut při laboratorní teplotě.

UIP2000hdT pro snížení molekulové hmotnosti schizophyllan

Ultrazvukový přístroj UP400St (400W, 24kHz) pro zpracování schizophyllan
Ultrazvuková léčba byla aplikována přímo na S. commune 144-h kultivační vývar s myceliem, aby se usnadnilo následné zpracování SPG.
Charakteristika sonikovaného Schizophyllan: Ultrazvukový schizofyllan (uSPG) byl vysrážen z filtrátu kultivačního vývaru alkoholem a charakterizován. SEC-MALLS odhadl Mw uSPG na přibližně 1 MDa. Průměrná molekulová hmotnost schizofylanu z tekuté fermentace je přibližně 5 MDa, zatímco při pěstování v pevné fázi může dosáhnout až 10 MDa. Porovnáním molekulové hmotnosti ultrazvuku schizophyllan s molekulovou hmotností nativního neléčeného schizophyllanu lze v důsledku ultrazvuku pozorovat 5 až 10násobné snížení molekulové hmotnosti.
Sonikovaný polysacharid uSPG obsahoval 0,7% hm/w protein a 1,0% hm/w zbytek po zapálení. Hydrolyzát uSPG se skládal z glukózy s více než 99 %. Analytické výsledky naznačují, že sonikace štěpí páteř β-glukanu náhodně a boční větve zůstávají neporušené, čímž se snižuje velikost a molekulová hmotnost schizophyllan. Imunologické studie v podstatě bez proteinů a endotoxinů uSPG ukázaly, že ultrazvukový schizofylan s nízkým Mw má výraznou imunomodulační aktivitu.

AFM zobrazování (nahoře) a topografický profil (dole) nativního ultrazvukového schizophyllanu. Měření v polokontaktním režimu s rozlišením 512 × 512 pxs2. Podmínky: pozlacení, konstanta pružiny 15,3 N/m, úhel kužele špičky <22°.
?>(picture and study: ©Smirnou et al., 2017)
Snížená viskozita: Ultrazvuku vedl k významnému snížení viskozity kultivačního bujónu. Během ultrazvuku se viskozita kultivačního bujónu měnila nelineárně: pokles viskozity byl rychlý na začátku ultrazvukové niky, ale později se zpomalil. Měrný energetický příkon 100 Ws/ml byl dostatečný ke snížení viskozity kultivačního bujónu téměř 7krát.

Ultrazvuku kultivačního vývaru S.commune, který byl získán kultivací plísní v bioreaktoru po dobu 144 hodin. Vliv období ultrazvuku (vyjádřený jako specifický energetický vstup ve Ws? ml) na rychlost filtrace hloubky kultivačního bujónu (černý sloupec) a koncentrace schizofylanu (SPG) ve filtrátu (šedý sloupec). Podmínky ultrazvuku: Ultrazvukový procesor UIP2000hd (20 kHz, 2000W), sonotroda BS2d22, booster B2-1.4, amplituda 100%, průtok 50 mL/s.
(obrázek a studie: ©Smirnou et al., 2017)
Vylepšená filtrace: Kultivační bujón ošetřený ultrazvukem protékal filtrem rychleji než neupravený kultivační bujón (měrný energetický vstup 0 Ws/ml) s vysokomolekulárním SPG. Kromě toho ultrazvuku významně snížil ztrátu produktu během filtrace. Filtrát neupraveného kultivačního bujónu s vysokomolekulárním SPG (měrný energetický vstup 0 Ws/ml) obsahoval 0,3 ± 0,07 g/l SPG, zatímco koncentrace SPG před hloubkovou filtrací byla 2 g/l. Naproti tomu filtrát 100 Ws/ml ultrazvukové kultury obsahoval SPG v koncentraci 2,2 ± 0,2 g? l, což odpovídá téměř nulové ztrátě produktu.

Ultrazvuku kultivačního vývaru S.commune, který byl získán kultivací plísní v bioreaktoru po dobu 144 hodin. Vliv období ultrazvuku (vyjádřený jako specifický energetický vstup ve Ws? ml) na rychlost filtrace hloubky kultivačního bujónu (černý sloupec) a koncentrace schizofylanu (SPG) ve filtrátu (šedý sloupec). Podmínky ultrazvuku: Ultrazvukový procesor UIP2000hd (20 kHz, 2000W), sonotroda BS2d22, booster B2-1.4, amplituda 100%, průtok 50 mL/s.
(obrázek a studie: ©Smirnou et al., 2017)

AFM zobrazování (nahoře) a topografický profil (dole) denaturovaného ultrazvukového schizophyllanu. Měření v polokontaktním režimu s rozlišením 512 × 512 pxs2. Podmínky: pozlacení, konstanta pružiny 15,3 N/m, úhel kužele špičky < 22°.
(obrázek a studie: ©Smirnou et al., 2017)
Vědci navíc zjistili, že ultrazvukové zpracování schizofylanu je snadno škálovatelné. Jedna jednotka pilotního ultrazvukového dezintegrátoru UIP2000hdT zpracovala 1 litr kultivačního vývaru za 110 s v průtokovém režimu. Produktivitu systému lze snadno zvýšit postupným připojováním dalších ultrazvukových jednotek.
Přečtěte si více o jednoduchém škálování extrakce hub!
Vysoce výkonné ultrazvukové zařízení pro zpracování houbového glukanu
Fragmentace polysacharidů, jako jsou glukany, stejně jako další bioaktivní sloučeniny, jako je chitin a chitosan, lze spolehlivě zpracovávat s vysoce výkonným ultrazvukovým zařízením Hielscher. Naše ultrasonicators mohou dodávat vysoké amplitudy, nabízejí přesnou ovladatelnost nad parametry procesu a mohou být provozovány 24 hodin denně, 7 dní v týdnu při velkém zatížení a v náročných prostředích. Řada zařízení Hielscher Ultrasonics splňuje tyto požadavky spolehlivě. Kromě vynikajícího ultrazvukového výkonu se Hielscher ultrasonicators mohou pochlubit vysokou energetickou účinností, což je významná ekonomická výhoda – zejména při použití v komerční velkosériové výrobě.
Hielscher ultrasonicators jsou vysoce výkonné systémy, které mohou být vybaveny příslušenstvím, jako jsou sonotrody, boostery, reaktory nebo průtokové buňky, aby optimálně odpovídaly vašim procesním potřebám. S digitálním barevným displejem je zajištěna možnost přednastavení ultrazvuku, automatické zaznamenávání dat na integrovanou SD kartu, dálkové ovládání prohlížeče a mnoho dalších funkcí, nejvyšší kontrola procesu a uživatelská přívětivost. Ve spojení s robustností a vysokou nosností jsou ultrazvukové systémy Hielscher vaším spolehlivým pracovním koněm ve výrobě. Snížení molekulové hmotnosti β-glukanů, jako je schizofyllan, vyžaduje silný ultrazvuk k dosažení cíleného štěpení a konečného schizofyllanového produktu vysoké kvality, který lze použít pro farmaceutické aplikace.
Více informací o ultrazvukové extrakci beta-glukanu z hub včetně pokynů krok za krokem najdete zde!
Níže uvedená tabulka vám poskytuje přibližný přehled o zpracovatelské kapacitě našich ultrasonicators:
Objem dávky | Průtok | Doporučená zařízení |
---|---|---|
1 až 500 ml | 10 až 200 ml? min | UP100H |
10 až 2000 ml | 20 až 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
0.1 až 20L | 0.2 až 4 l/min | UIP2000hdT |
10 až 100 l | 2 až 10 l/min | UIP4000hdT |
Není k dispozici | 10 až 100 l? min | UIP16000 |
Není k dispozici | větší | shluk UIP16000 |
Kontaktujte nás!? Zeptejte se nás!
Literatura? Reference
- Smirnou, Dzianis; Knotek, Petr; Nesporova, Kristina; Smejkalova, Daniela; Pavlik, Vojtech; Franke, Lukas; Velebny, Vladimir (2017): Ultrasound-assisted production of highly-purified β-glucan schizophyllan and characterization of its immune properties. Process Biochemistry 2017.
- Zhong, Kui; Tong, Litao; Liu, Liya; Zhou, Xianrong; Liu, Xingxun; Zhang, Qi; Zhou, Sumei (2015): Immunoregulatory and antitumor activity of schizophyllan under ultrasonic treatment. International Journal of Biological Macromolecules, 80, 2015. 302–308.
- Kengo Tabata, Wataru Ito, Takemasa Kojima, Shozo Kawabata, Akira Misaki (1981): Ultrasonic degradation of schizophyllan, an antitumor polysaccharide produced by Schizophyllum commune fries. Carbohydrate Research, Volume 89, Issue 1, 1981. 121-135.
Fakta, která stojí za to vědět
schizophyllan (schizofylán) – Plísňový β-glukan
Schizophyllan, také známý jako sizofiran, SPG, sonifilan, sizofilan, je neutrální extracelulární polysacharid produkovaný houbou Schizophyllum commune Fries, druhem houby Basidiomycetes. Schizophyllan je rozpustný beta-D-glukan, jehož přesný mechanismus účinku není dosud zcela objasněn, ale tento specifický β-glukan vykazuje imunomodulační a protinádorové účinky. Ačkoli přesný mechanismus účinku sizofiranu musí být ještě plně objasněn, zdá se, že toto činidlo stimuluje imunitní systém zvýšením produkce cytokinů, aktivací makrofágů a Langerhansových buněk a zvýšením aktivity polymorfonukleárních leukocytů (PML) a NK buněk. Sizofiran byl shledán spíše neúčinným proti rakovině žaludku, ale prodloužil dobu přežití u pacientů s rakovinou hlavy a krku. U rakoviny děložního čípku Sizofiran prodloužil přežití a dobu do recidivy u případů stadia II, ale ne ve stadiu III, a prokázal zvýšenou účinnost, když byl injikován přímo do nádorové hmoty. Sonifilan se používá jako modifikátor biologické odpovědi (BRM) s radiační terapií pro léčbu rakoviny v Japonsku. Byl zahájen v roce 1998 v Jižní Koreji kvůli rakovině děložního čípku.

Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratoř k průmyslová velikost.