Schizophyallan je houbový β-glukan s imunomodulačními vlastnostmi. Pro vysoce aktivní léčivé účinky musí mít schizophyllan nízkou molekulovou hmotnost, aby se prokázala lepší biologická dostupnost. Bylo prokázáno, že ultrazvuku snižuje molekulovou hmotnost schizophyllanu. Jako spolehlivá a účinná metoda, sonikace může být snadno použita pro výrobu schizophyllan s nízkou molekulovou hmotností.

Schizophyllum houby a ultrazvuková beta-glukanová extrakce

Druhy houby Schizophyllum rostou v přírodě na rozkládajících se stromech po období dešťů. Ovocná těla se sbírají v následujícím období sucha. Druhy Schizophyllum jsou bohaté na biochemické sloučeniny, jako jsou glukany, a proto se konzumují zejména v tropických zemích jako potraviny a léky. Díky svým imunomodulačním, antifungálním, antineoplastickým a antivirovým vlastnostem přilákala obec Schizophyllum, známá také jako houba Splitgill, biotechnologické a farmaceutické společnosti.
Polysacharid schizophyllan, také známý jako sizofiran, sonifilan nebo sizofilan, je hlavní β-glukan nalezený v houbách Schizophyllum, které nabízejí vysoce účinný bioaktivní β-glukan schizophyllan.
Schizophyllum commune houby rostou v přírodě na stromech, mycellium může být také kultivováno ve fermentačním vývaru. Pro farmaceutické a kosmetické aplikace je schizophyllan s nízkou molekulovou hmotností mnohem účinnější než schizophyllan s vysokou molekulovou hmotností. To je způsobeno skutečností, že schizophyllan s nízkou molekulovou hmotností vykazuje výrazně lepší biologickou dostupnost a míru absorpce. Navíc schizophyllan s vysokou molekulovou hmotností je často problematický v aplikacích, protože má za následek vysokou viskozitu jeho vodných roztoků.
Ultrazvukové zmenšení velikosti je vysoce účinná a spolehlivá technika pro snížení molekulové hmotnosti schizophyllanu, čímž se zvyšuje kvalita molekuly β-glukanu.

Protokol pro výrobu nízkomolekulárního schizophyllanu

Vzhledem k tomu, že molekulová hmotnost schizophyllan vykazuje drasticky lepší biologickou dostupnost a aplikační vlastnosti, výzkumný tým Smirnou zkoumal ultrazvuku pro štěpení a zmenšení velikosti molekuly β-glukanu schizophyllan.

Ultrazvuku Schizophyllan

β-1.3(1.6)-Glukan schizophyllan (SPG) byl produkován ponořenou kultivací houby S. commune v bioreaktoru s použitím sacharózy jako substrátu.
Po ukončení kultivace byl kultivační vývar zředěn demineralizovanou vodou na koncentraci schizophyllanu 2 g / l a ultrazvukem Ultrazvukový procesor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Německo) v recyklačním režimu za následujících parametrů a podmínek: střední průtok 50 ml / s, frekvence 20 kHz, výstup 2000 W, sonotroda typu BS2d22, posilovač typu B2-1,4 a amplituda 100%. Teplota kultivačního vývaru na začátku sonikace byla 25 ° C. Ultrazvukový kultivační vývar (specifický energetický vstup 100 W / ml) byl filtrován přes hloubkový filtr Seitz HS800 pod tlakem 1,5 baru při 40 ° C. Ultrazvukový schizophyllan (uSPG) pro chemickou charakterizaci byl vysrážen z filtrátu trojitým množstvím isopropylalkoholu při laboratorní teplotě a sušen při 60 ° C po dobu 12h roztoky uSPG pro imunologické studie byly připraveny takto: (1) ultrazvukový filtrát vývaru byl diafiltrován přes kazetu PES řady 0,1 m2 Pall Centramate T-series PES (100 kDa cut-off) při 0,8 baru a diafiltrace pokračovala, dokud nebyla retentovatová vodivost 20 μS / cm; (2) roztok byl koncentrován diafiltrací na koncentraci uSPG 1 g/l a sterilizován autoklávováním při 120 °C/20 min. Denaturovaný uSPG byl připraven podobným způsobem, s tím rozdílem, že NaOH byl přidán do filtrátu vývaru v koncentraci 0,2 M a alkalizovaný roztok byl inkubován po dobu 30 minut při laboratorní teplotě před diafiltrací.

Analytické metody

Výtěžek mycelia byl odhadnut gravimetricky: kultivační vývar byl zředěn vodou 1:4, odstřeďován 10000 × g při 25 °C po dobu 20 minut, sraženina byla promyta trojnásobným množstvím vody, vysušena při 60 °C a zvážena. Schizophyllan byl vysrážen ze supernatantu trojnásobným množstvím isopropylalkoholu, sušen při 60 °C po dobu 24 hodin a jeho výtěžek byl stanoven gravimetricky. pO2 v kultivačním vývaru byl měřen optickou sondou Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Švýcarsko).
Dynamická viskozita kultivačního vývaru byla měřena na HAAKE Visco Tester 6L s vřeteny 1L a 2L při 4 °C a rychlosti otáčení 30 ot/min. Rychlost filtrace byla vypočtena z doby filtrace kultivačního vývaru 500 ml přes hloubkový filtr 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, USA) při tlaku 1,5 baru a 40 °C.
Molekulová hmotnost uSPG byla měřena SEC-MALLS na HPLC systému Alliance (Waters) se sériově zapojenými PL aquagelovými oh60 a PL aquagelovými OH40 kolonami a detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) byl koncentrován diafiltrací na koncentraci uSPG 1 g/l a sterilizován autoklávováním při 120°C/20 min. Denaturovaný uSPG byl připraven podobným způsobem, s tím rozdílem, že NaOH byl přidán do filtrátu vývaru v koncentraci 0,2 M a alkalizovaný roztok byl inkubován po dobu 30 minut při laboratorní teplotě před diafiltrací.

Výsledek:
Ultrazvuková léčba byla aplikována přímo na S. commune 144-h kultivační vývar s myceliem pro usnadnění následného zpracování dělostřelectva.
 
Charakteristika Sonicated Schizophyllan: Ultrazvukový schizophyllan (uSPG) byl vysrážen z filtrátu vývaru kultury alkoholem a charakterizován. SEC-MALLS odhadl Mw uSPG na přibližně 1 MDa. Průměrná molekulová hmotnost schizophyllanu z kapalné fermentace je přibližně 5 MDa, zatímco při kultivaci v pevném stavu může dosáhnout až 10 MDa. Porovnáním molekulové hmotnosti ultrazvukového schizophyllanu s molekulovými hmotnostmi nativního neléčeného schizophyllanu lze v důsledku ultrazvuku pozorovat 5 až 10krát sníženou molekulovou hmotnost.
Sonikovaný polysacharid uSPG obsahoval 0,7% w / w proteinu a 1,0% w / w zbytku po zapálení. Hydrolyzát uSPG se skládal z glukózy s více než 99%. Analytické výsledky naznačují, že sonikace štěpí páteř β-glukanu náhodně a boční větve zůstávají neporušené, čímž se snižuje velikost a molekulová hmotnost schizophyllanu. Imunologické studie na v podstatě protein- a endotoxin volný uSPG ukázal,, že ultrazvuku low-Mw schizophyllan má výraznou imunomodulační aktivitu.

 
Snížená viskozita: Ultrazvuku vedla k významnému snížení viskozity kultivačního vývaru. Během ultrazvuku se viskozita kultivačního vývaru změnila nelineárně: pokles viskozity byl rychlý na začátku ultrazvuku, ale později se zpomalil. Specifický energetický příkon 100 W/ml stačil ke snížení viskozity vývaru téměř 7krát.

Vylepšená filtrace: Ultrazvukem ošetřený kultivační vývar protékal filtrem rychleji než neošetřený kultivační vývar (specifický energetický vstup 0 Ws/ml) s vysokomolekulárním dělostřelectvem. Kromě toho ultrazvuku významně snížila ztrátu produktu během filtrace. Filtrát neošetřeného kultivačního vývaru s vysokomolekulárním samohybným dělem (specifický energetický vstup 0 W/ml) obsahoval 0,3 ± 0,07 g/l samohybného děla, zatímco koncentrace samohybného děla před hloubkovou filtrací byla 2 g/l. Naproti tomu filtrát 100 W / ml ultrazvukové kultury obsahoval SPG v koncentraci 2,2 ± 0,2 g / l, což odpovídá téměř nulové ztrátě produktu.

Závěr: Ve svém závěru výzkumný tým pokračuje, že ultrazvukové zpracování je efektivní technologie pro výrobu nízkomolekulárního schizophyllanu, který pak může být použit v kosmetice a medicíně. Ultrazvuku, při aplikaci na kompletní kultivační vývar s myceliem, přináší určité výhody pro výrobu schizophyllanu. Snižuje ztráty produktu během následného zpracování a umožňuje výrobu vysoce čištěného polysacharidu díky efektivnímu využití ultrafiltrace.
Navíc vědci zjistili, že ultrazvukové zpracování schizophyllanu je snadno škálovatelné. Jedna jednotka pilotního zařízení ultrazvukového dezintegrátoru UIP2000hdT zpracovala 1 litr kultivačního vývaru za 110 s v režimu průtoku. Produktivitu systému lze snadno zvýšit sekvenčním připojením dalších ultrazvukových jednotek.

 
Přečtěte si více o jednoduchém rozšíření extrakce hub!
 

Vysoce výkonné ultrazvukové zařízení pro zpracování plísňového glukanu

Fragmentace polysacharidů, jako jsou glukany, stejně jako další bioaktivní sloučeniny, jako je chitin a chitosan, lze spolehlivě zpracovat pomocí vysoce výkonného ultrazvukového zařízení Hielscher. Naše ultrasonicators mohou dodávat vysoké amplitudy, nabízejí přesnou ovladatelnost nad parametry procesu a mohou být provozovány 24 hodin denně, 7 dní v týdnu při velkém zatížení a v náročných prostředích. Řada zařízení Hielscher Ultrasonics splňuje tyto požadavky spolehlivě. Kromě vynikajícího ultrazvukového výkonu se Hielscher ultrasonicators mohou pochlubit vysokou energetickou účinností, což je významná ekonomická výhoda – zejména pokud jsou zaměstnáni v komerční velkovýrobě.
Hielscher ultrasonicators jsou vysoce výkonné systémy, které mohou být vybaveny příslušenstvím, jako jsou sonotrody, boostery, reaktory nebo průtokové buňky, aby odpovídaly vašim procesním potřebám optimálním způsobem. S digitálním barevným displejem, možností přednastavených sonikačních běhů, automatickým záznamem dat na integrované SD kartě, dálkovým ovládáním prohlížeče a mnoha dalšími funkcemi, nejvyšší kontrolou procesu a uživatelskou přívětivostí. Ve spojení s robustností a těžkou nosností jsou ultrazvukové systémy Hielscher vaším spolehlivým pracovním koněm ve výrobě. Snížení molekulové hmotnosti β-glukanů, jako je schizophyllan, vyžaduje silný ultrazvuk k získání cíleného štěpení a konečného schizofylanového produktu vysoké kvality, který lze použít pro farmaceutické aplikace.
 
Více informací o ultrazvukové extrakci beta-glukanu z hub včetně pokynů krok za krokem najdete zde!
 
Níže uvedená tabulka vám dává informaci o přibližné zpracovatelské kapacity našich ultrasonicators: