Ultrazvuková deacetylace chitinu na chitosan
Ultrazvuková výroba chitosanu
Chitosan se získává N-deacetylací chitinu. Při konvenční deacetylaci se chitin máčí ve vodných alkalických rozpouštědlech (typicky 40 až 50% (w/w) NaOH). Proces máčení vyžaduje vysoké teploty 100 až 120ºC, je velmi časově náročný a výtěžek chitosanu získaný v jednom kroku máčení je nízký. Použití výkonového ultrazvuku výrazně intenzifikuje proces deacetylace chitinu a vede k vysokému výtěžku chitosanu s nízkou molekulovou hmotností při rychlém zpracování za nižší teploty. Ultrazvuková deacetylace poskytuje chitosan vynikající kvality, který se používá jako potravinářská a farmaceutická složka, jako hnojivo a v mnoha dalších průmyslových aplikacích.
Ultrazvukové ošetření vede k výjimečnému stupni acetylace (DA) chitinu a snižuje stupeň acetylace z chitinu s DA≥90 na chitosan s DA≤10.
Účinnost ultrazvukové deacetylace chitinu na chitosan potvrzuje řada výzkumných studií. Weiss J. et al. (2008) zjistili, že sonikace drasticky zlepšuje konverzi chitinu na chitosan. Ultrazvukové ošetření chitinu přináší významnou úsporu času a zkracuje potřebnou dobu procesu z 12–24 hodin na několik hodin. Kromě toho je k dosažení úplné konverze zapotřebí méně rozpouštědla, což snižuje dopad na životní prostředí spojený s nutností vyřazovat a likvidovat použité nebo nezreagované rozpouštědlo, tj. koncentrovaný NaOH.
Deacetylaci chitinu na chitosan podporuje sonikace
UIP4000hdT – výkonný ultrazvukový systém 4kW
Princip ultrazvukového zpracování chitosanu
Výkonová nízkofrekvenční ultrazvuková sonikace (∼20–26kHz) vytváří v kapalinách a suspenzích akustickou kavitaci. Výkonový ultrazvuk podporuje konverzi chitinu na chitosan, neboť rozpouštědlo (např. NaOH) fragmentuje pevné částice chitinu a proniká do nich, čímž se zvětšuje povrch a zlepšuje přenos hmoty mezi pevnou a kapalnou fází. Vysoké smykové síly ultrazvukové kavitace navíc vytvářejí volné radikály, které zvyšují reaktivitu činidla (tj. NaOH) během hydrolýzy. Jako netermální technika zpracování zabraňuje sonikace tepelné degradaci, a poskytuje tak vysoce kvalitní chitosan. Ultrazvuk zkracuje doby zpracování potřebné k extrakci chitinu z korýšů a zároveň poskytuje chitin (a tedy následně i chitosan) vyšší čistoty ve srovnání s tradičními podmínkami zpracování. Při výrobě chitinu a chitosanu má tedy ultrazvuk potenciál snížit výrobní náklady, zkrátit dobu zpracování, umožnit lepší řízení výrobního procesu a snížit dopad procesního odpadu na životní prostředí.
- Vyšší výtěžek chitosanu
- Vynikající kvalita
- Kratší doba
- Nižší procesní teplota
- Vyšší účinnost
- Snadný a bezpečný provoz
- Šetrnost k životnímu prostředí
Ultrazvuková deacetylace chitinu na chitosan – protokol
1) Příprava chitinu:
Při použití krabích krunýřů jako výchozího materiálu je třeba krunýře důkladně omýt, aby se odstranily veškeré rozpustné organické látky a ulpívající nečistoty včetně zeminy a bílkovin. Poté musí být materiál krunýřů zcela vysušen (např. při 60ºC po dobu 24h v sušárně). Vysušené krunýře se následně rozemelou (např. pomocí kladivového mlýna), deproteinují v alkalickém prostředí (např. NaOH o konc. 0,125 až 5,0 M) a demineralizují v kyselině (např. ve zředěné kyselině chlorovodíkové).
2) Ultrazvuková deacetylace
Při typické ultrazvukové deacetylační reakci se částice beta-chitinu (0,125 mm < d < 0,250 mm) suspendují ve 40% (w/w) vodném NaOH v poměru beta-chitin/vodný roztok NaOH 1/10(g mL-1), suspenze se převede do dvouplášťové skleněné kádinky a sonikuje se pomocí přístroje Hielscher UP400St – ultrazvukového homogenizátoru. Při provádění ultrazvukové deacetylační reakce chitinu se udržují konstantní následující parametry (srov. Fiamingo et al. 2016): (i) ultrazvuková sonda (sonotroda Hielscher S24d22D, průměr špičky = 22 mm); (ii) pulzní režim sonikace (IP = 0,5sec); (iii) povrchová intenzita ultrazvuku
(I = 52,6 W cm-2), (iv) reakční teplota (60ºC ±1ºC), (v) reakční doba (50 min), (vi) poměr hmotnosti beta-chitinu k objemu 40% (w/w) vodného hydroxidu sodného (BCHt/NaOH = 1/10 g mL-1); (vii) objem suspenze beta-chitinu (50mL).
První reakce probíhá 50min za stálého magnetického míchání a poté se přeruší rychlým ochlazením suspenze na 0ºC. Následně se přidá zředěná kyselina chlorovodíková k dosažení pH 8,5 a vzorek CHs1 se izoluje filtrací, důkladně promyje deionizovanou vodou a vysuší za okolních podmínek. Pokud se stejná ultrazvuková deacetylace zopakuje jako druhý krok na vzorku CHs1, vznikne vzorek CHs2.
Snímky ze skenovací elektronové mikroskopie (SEM) při zvětšení 100×: a) gladius, b) gladius ošetřený ultrazvukem, c) β-chitin, d) β-chitin ošetřený ultrazvukem a e) chitosan (zdroj: Preto et al. 2017)
Fiamingo et al. zjistili, že ultrazvuková deacetylace beta-chitinu efektivně poskytuje chitosan s vysokou molekulovou hmotností a nízkým stupněm acetylace, a to bez použití aditiv, inertní atmosféry či dlouhých reakčních dob. A to přesto, že se ultrazvuková deacetylační reakce provádí za mírnějších podmínek – tj. při nízké reakční teplotě ve srovnání s většinou termochemických deacetylací. Ultrazvuková deacetylace beta-chitinu umožňuje připravit náhodně deacetylovaný chitosan s variabilním stupněm acetylace (4% ≤ DA ≤ 37%), vysokou hmotnostně průměrnou molekulovou hmotností (900 000 g mol-1 ≤ Mw ≤ 1 200 000 g mol-1 ) a nízkou disperzitou (1,3 ≤ Ð ≤ 1,4), a to provedením tří po sobě jdoucích reakcí (50 min/krok) při 60ºC.
Výkonné ultrazvukové procesory od laboratorního přes pilotní až po průmyslové měřítko.
Vysoce výkonné ultrazvukové systémy pro výrobu chitosanu
Fragmentace chitinu a deacetylace chitinu na chitosan vyžadují výkonné a spolehlivé ultrazvukové zařízení, které dokáže dodávat vysoké amplitudy, nabízí přesné řízení procesních parametrů a lze je provozovat v režimu 24/7 při vysokém zatížení a v náročných prostředích. Produktová řada Hielscher Ultrasonics pokryje vás i požadavky vašeho procesu. Ultrazvukové přístroje Hielscher jsou vysoce výkonné systémy, které lze vybavit příslušenstvím, jako jsou sonotrody, boostery, reaktory nebo průtokové cely, aby optimálně odpovídaly potřebám vašeho procesu.
Digitální barevný displej, možnost předvolby sonikačních cyklů, automatický záznam dat na integrovanou SD kartu, vzdálené ovládání přes prohlížeč a mnoho dalších funkcí zajišťují nejvyšší kontrolu procesu a uživatelskou přívětivost. Ve spojení s robustností a vysokou zatížitelností jsou ultrazvukové systémy Hielscher vaším spolehlivým tahounem ve výrobě.
Fragmentace a deacetylace chitinu vyžadují výkonný ultrazvuk, aby bylo dosaženo cílové konverze a vysoce kvalitního konečného produktu – chitosanu. Zejména pro fragmentaci chitinových vloček jsou rozhodující vysoké amplitudy a zvýšené tlaky. Průmyslové ultrazvukové procesory Hielscher Ultrasonics snadno dodávají velmi vysoké amplitudy. Amplitudy až 200µm lze nepřetržitě provozovat v režimu 24/7. Pro ještě vyšší amplitudy jsou k dispozici zakázkové ultrazvukové sonotrody. Výkonová kapacita ultrazvukových systémů Hielscher umožňuje efektivní a rychlou deacetylaci v bezpečném a uživatelsky přívětivém procesu.
Níže uvedená tabulka poskytuje orientační přehled přibližné zpracovatelské kapacity našich ultrazvukových přístrojů:
| Objem dávky | Průtok | Doporučená zařízení |
|---|---|---|
| 1 až 500mL | 10 až 200mL/min | UP100H |
| 10 až 2000mL | 20 až 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 až 20L | 0,2 až 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 až 100L | 2 až 10L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 až 100L/min | UIP16000 |
| n.a. | větší | klastr UIP16000 |
Kontaktujte nás! / Zeptejte se nás!
Literatura a reference
- Butnaru E., Stoleru E., Brebu M.A., Darie-Nita R.N., Bargan A., Vasile C. (2019): Chitosan-Based Bionanocomposite Films Prepared by Emulsion Technique for Food Preservation. Materials 2019, 12(3), 373.
- Fiamingo A., de Moura Delezuk J.A., Trombotto St. David L., Campana-Filho S.P. (2016): Extensively deacetylated high molecular weight chitosan from the multistep ultrasound-assisted deacetylation of beta-chitin. Ultrasonics Sonochemistry 32, 2016. 79–85.
- Kjartansson, G., Wu, T., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Sonochemically-Assisted Conversion of Chitin to Chitosan, USDA National Research Initiative Principal Investigators Meeting, New Orleans, LA, June 28th.
- Kjartansson, G., Kristbergsson, K. Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Influence of temperature during deacetylation of chitin to chitosan with high-intensity ultrasound as a pre-treatment, Annual Meeting of the Institute of Food Technologists, New Orleans, LA, June 30th, 95-18.
- Kjartansson, G., Kristbergsson, K., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Influence of high-intensity ultrasound to accelerate the conversion of chitin to chitosan, Annual Meeting of the Institute of Food Technologists, New Orleans, LA, June 30th, 95-17.
- Preto M.F., Campana-Filho S.P., Fiamingo A., Cosentino I.C., Tessari-Zampieri M.C., Abessa D.M.S., Romero A.F., Bordon I.C. (2017): Gladius and its derivatives as potential biosorbents for marine diesel oil. Environmental Science and Pollution Research (2017) 24:22 932–22 939.
- Wijesena R.N., Tissera N., Kannangara Y.Y., Lin Y., Amaratunga G.A.J., de Silva K.M.N. (2015): A method for top down preparation of chitosan nanoparticles and nanofibers. Carbohydrate Polymers 117, 2015. 731–738.
- Wu, T., Zivanovic, S., Hayes, D.G., Weiss, J. (2008). Efficient reduction of chitosan molecular weight by high-intensity ultrasound: Underlying mechanism and effect of processing parameters. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(13):5112-5119.
- Yadav M.; Goswami P.; Paritosh K.; Kumar M.; Pareek N.; Vivekanand V. (2019): Seafood waste: a source for preparation of commercially employable chitin/chitosan materials. Bioresources and Bioprocessing 6/8, 2019.
Fakta, která stojí za to znát
Jak funguje ultrazvuková deacetylace chitinu?
Když se výkonový nízkofrekvenční ultrazvuk (např. 20–26kHz) přenáší do kapaliny nebo suspenze, působí na kapalinu střídavé cykly vysokého a nízkého tlaku, které vyvolávají kompresi a zředění. Během těchto střídavých cyklů vysokého a nízkého tlaku vznikají malé vakuové bublinky, které rostou v průběhu několika tlakových cyklů. V okamžiku, kdy vakuové bublinky již nemohou absorbovat další energii, prudce kolabují. Během této imploze bublin vznikají lokálně velmi intenzivní podmínky: vysoké teploty až 5000K, tlaky až 2000atm, velmi vysoké rychlosti ohřevu/chlazení a tlakové rozdíly. Protože dynamika kolapsu bublin je rychlejší než přenos hmoty a tepla, energie v kolabující dutině je soustředěna do velmi malé zóny, nazývané také „hot spot“. Imploze kavitační bubliny má dále za následek mikroturbulence, kapalinové trysky o rychlosti až 280m/s a z nich vyplývající smykové síly. Tento jev je známý jako ultrazvuková neboli akustická kavitace.
Kapičky a částice v sonikované kapalině jsou zasahovány těmito kavitačními silami, a když se urychlené částice srazí, rozbijí se v důsledku mezičásticových kolizí. Akustická kavitace je principem ultrazvukového mletí, dispergace, emulgace a sonochemie.
Při deacetylaci chitinu zvětšuje ultrazvuk vysoké intenzity povrch tím, že jej aktivuje, a podporuje přenos hmoty mezi částicemi a činidlem.
Chitosan
Chitosan je modifikovaný, kationtový, netoxický sacharidový polymer se složitou chemickou strukturou tvořenou β-(1,4) glukosaminovými jednotkami jako hlavní složkou (>80%) a N-acetylglukosaminovými jednotkami (<20%), které jsou podél řetězce náhodně rozmístěny. Chitosan se získává z chitinu chemickou nebo enzymatickou deacetylací. Stupeň deacetylace (DA) určuje obsah volných aminoskupin ve struktuře a slouží k rozlišení mezi chitinem a chitosanem. Chitosan vykazuje dobrou rozpustnost v mírných rozpouštědlech, jako je zředěná kyselina octová, a nabízí několik volných aminových skupin jako aktivních míst. Díky tomu má chitosan v mnoha chemických reakcích výhodu oproti chitinu.
Chitosan je ceněn pro svou vynikající biokompatibilitu a biologickou rozložitelnost, netoxicitu, dobrou antimikrobiální aktivitu (proti bakteriím a houbám), nepropustnost pro kyslík a filmotvorné vlastnosti. Na rozdíl od chitinu má chitosan tu výhodu, že je rozpustný ve vodě, a je proto snadněji zpracovatelný a použitelný ve formulacích.
Jako druhý nejrozšířenější polysacharid po celulóze je chitin díky své obrovské hojnosti levnou a udržitelnou surovinou.
Výroba chitosanu
Chitosan se vyrábí dvoustupňovým procesem. V prvním kroku se surovina, například krunýře korýšů (tj. krevet, krabů, humrů), deproteinuje, demineralizuje a přečistí, čímž se získá chitin. Ve druhém kroku se chitin zpracuje silnou zásadou (např. NaOH), aby se odstranily acetylové postranní řetězce a získal se chitosan. Proces konvenční výroby chitosanu je známý tím, že je velmi časově a nákladově náročný.
Chitin
Chitin (C8H13O5N)n je lineární polymer β-1,4-N-acetylglukosaminu a dělí se na α-, β- a γ-chitin. Chitin jako derivát glukózy je hlavní složkou exoskeletů členovců, jako jsou korýši a hmyz, radul měkkýšů, zobáků hlavonožců a šupin ryb a obojživelníků skupiny Lissamphibia a nachází se také v buněčných stěnách hub. Struktura chitinu je srovnatelná s celulózou a tvoří krystalické nanofibrily neboli whiskery. Celulóza je nejrozšířenějším polysacharidem na světě, po ní následuje chitin jako druhý nejrozšířenější polysacharid.
Glukosamin
Glukosamin (C6H13NO5) je aminocukr a důležitý prekurzor při biochemické syntéze glykosylovaných proteinů a lipidů. Glukosamin je v přírodě hojně se vyskytující sloučenina, která je součástí struktury obou polysacharidů, chitosanu i chitinu, což z glukosaminu činí jeden z nejrozšířenějších monosacharidů. Většina komerčně dostupného glukosaminu se vyrábí hydrolýzou exoskeletů korýšů, tj. krunýřů krabů a humrů.
Glukosamin se používá především jako doplněk stravy, a to ve formě glukosamin-sulfátu, glukosamin-hydrochloridu nebo N-acetylglukosaminu. Doplňky s glukosamin-sulfátem se podávají perorálně k léčbě bolestivého onemocnění způsobeného zánětem, rozpadem a případnou ztrátou chrupavky (osteoartróza).