Ултразвуково производство на високопречистени бета-глюкани шизофилан

Шизофиланът е гъбен β-глюкан с имуномодулиращи свойства. За да проявява висока лечебна активност, шизофиланът трябва да има ниско молекулно тегло, което осигурява подобрена бионаличност. Доказано е, че ултразвуковата обработка намалява молекулното тегло на шизофилана. Като надежден и ефективен метод ултразвуковата обработка може лесно да се прилага за производството на шизофилан с ниско молекулно тегло.

Гъби Schizophyllum и ултразвукова екстракция на бета-глюкани

Видовете гъби от род Schizophyllum растат в природата върху разлагащи се дървета след дъждовните сезони. Плодните тела се събират през следващия сух сезон. Видовете Schizophyllum са богати на биохимични съединения като глюкани и затова се консумират като храна и лекарство, особено в тропическите страни. Поради своите имуномодулиращи, противогъбични, антинеопластични и антивирусни свойства Schizophyllum commune, известна още като разцепенолистна гъба, привлича интереса на биотехнологични и фармацевтични компании.
Полизахаридът шизофилан, известен още като сизофиран, сонифилан или сизофилан, е основният β-глюкан, открит в гъбите Schizophyllum, които са източник на високоефективния биоактивен β-глюкан шизофилан.
Гъбите Schizophyllum commune растат в природата върху дървета, а мицелът може да се култивира и във ферментационна среда. За фармацевтични и козметични приложения шизофиланът с ниско молекулно тегло е много по-ефективен от шизофилана с високо молекулно тегло. Това се дължи на факта, че шизофиланът с ниско молекулно тегло показва значително по-добра бионаличност и по-високи скорости на абсорбция. Освен това шизофиланът с високо молекулно тегло често създава проблеми при приложенията, тъй като водните му разтвори имат висок вискозитет.
Ултразвуковото намаляване на размера е високоефективна и надеждна техника за понижаване на молекулното тегло на шизофилана, с което се повишава качеството на молекулата на β-глюкана.

Протокол за производство на шизофилан с ниско молекулно тегло

Тъй като шизофиланът с молекулно тегло показва драстично по-добра бионаличност и свойства при приложение, изследователският екип на Smirnou проучи ултразвуковата обработка за разцепване и намаляване на размера на молекулата на β-глюкана шизофилан.

Ултразвукова обработка на шизофилан

β-1.3(1.6)-глюканът шизофилан (SPG) беше произведен чрез дълбочинно култивиране на гъбата S. commune в биореактор, като за субстрат беше използвана захароза.
След края на култивирането културалната течност беше разредена с деминерализирана вода до концентрация на шизофилан 2 g/L и обработена ултразвуково с ултразвуковия процесор UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Германия) в режим на рециркулация при следните параметри и условия: дебит на средата 50 mL/s, честота 20 kHz, изходна мощност 2000 W, сонотрод тип BS2d22, усилвател тип B2-1.4 и амплитуда 100%. Температурата на културалната течност в началото на ултразвуковата обработка беше 25°C. Ултразвуково обработената културална течност (специфична вложена енергия 100 Ws/mL) беше филтрирана през дълбочинен филтър Seitz HS800 при налягане 1,5 bar и температура 40°C. Ултразвуково обработеният шизофилан (uSPG) за химично характеризиране беше утаен от филтрата с тройно количество изопропилов алкохол при лабораторна температура и изсушен при 60°C за 12h. Разтворите на uSPG за имунологични изследвания бяха приготвени, както следва: (1) филтратът от ултразвуково обработената културална течност беше подложен на диафилтрация през PES касета Pall Centramate T-series с площ 0,1m2 (граница на задържане 100 kDa) при 0,8 bar, като диафилтрацията продължи, докато проводимостта на ретентата достигна 20 μS/cm; (2) разтворът беше концентриран чрез диафилтрация до концентрация на uSPG 1 g/L и стерилизиран чрез автоклавиране при 120°C/20 min. Денатуриран uSPG беше приготвен по подобен начин, с тази разлика, че към филтрата от културалната течност беше добавен NaOH до концентрация 0,2 M, а алкализираният разтвор беше инкубиран за 30 min при лабораторна температура преди диафилтрацията.

Аналитични методи

Добивът на мицел беше определен гравиметрично: културалната течност беше разредена с вода в съотношение 1:4 и центрофугирана при 10 000 × g и 25°C за 20 min, а утайката беше промита с тройно количество вода, изсушена при 60°C и претеглена. Шизофиланът беше утаен от супернатанта с тройно количество изопропилов алкохол, изсушен при 60°C за 24h и добивът му беше определен гравиметрично. pO2 в културалната течност беше измерено с оптична сонда Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Швейцария).
Динамичният вискозитет на културалната течност беше измерен с HAAKE Visco Tester 6L с шпиндели 1L и 2L при 4°C и скорост на въртене 30 rpm. Скоростта на филтрация беше изчислена от времето за филтриране на 500 mL културална течност през дълбочинен филтър Seitz HS800 (Pall, САЩ) с размери 200 × 200 mm при налягане 1,5 bar и температура 40°C.
Молекулното тегло на uSPG беше измерено чрез SEC-MALLS с HPLC система Alliance (Waters) с последователно свързани колони PL aquagel OH60 и PL aquagel OH40, а детекторът miniDAWN TREOS (Wyatt) беше концентриран чрез диафилтрация до концентрация на uSPG 1 g/L и стерилизиран чрез автоклавиране при 120°C/20 min. Денатуриран uSPG беше приготвен по подобен начин, с тази разлика, че към филтрата от културалната течност беше добавен NaOH до концентрация 0,2 M, а алкализираният разтвор беше инкубиран за 30 min при лабораторна температура преди диафилтрацията.

Резултати:
Ултразвуковата обработка беше приложена директно върху културална течност на S. commune с мицел след 144-h култивиране, за да се улесни последващата обработка на SPG.
 
Характеристики на ултразвуково обработения шизофилан: Ултразвуково обработеният шизофилан (uSPG) беше утаен с алкохол от филтрата на културалната течност и характеризиран. Чрез SEC-MALLS Mw на uSPG беше оценено на около 1 MDa. Средното молекулно тегло на шизофилана от течна ферментация е приблизително 5 MDa, докато при твърдофазно култивиране то може да достигне до 10 MDa. При сравняване на молекулното тегло на ултразвуково обработения шизофилан с молекулните тегла на нативния необработен шизофилан може да се наблюдава намаляване на молекулното тегло от 5 до 10 пъти вследствие на ултразвуковата обработка.
Ултразвуково обработеният полизахарид uSPG съдържаше 0,7%w/w белтък и 1,0%w/w остатък след накаляване. Хидролизатът на uSPG се състоеше от повече от 99% глюкоза. Аналитичните резултати показват, че ултразвуковата обработка разцепва основната верига на β-глюкана на случайни места, а страничните разклонения остават непокътнати, като по този начин се намаляват размерът и молекулното тегло на шизофилана. Имунологичните изследвания на uSPG, практически свободен от белтъци и ендотоксини, показаха, че ултразвуково обработеният шизофилан с ниско Mw има изразена имуномодулираща активност.

 
Намален вискозитет: Ултразвуковата обработка доведе до значително намаляване на вискозитета на културалната течност. По време на ултразвуковата обработка вискозитетът на културалната течност се изменяше нелинейно: намаляването на вискозитета беше бързо в началото на ултразвуковата обработка, но по-късно се забави. Специфична вложена енергия от 100 Ws/mL беше достатъчна, за да намали вискозитета на културалната течност почти 7 пъти.

Подобрена филтрация: Ултразвуково обработената културална течност преминаваше през филтъра по-бързо от необработената културална течност (специфична вложена енергия 0 Ws/mL) с високомолекулен SPG. Освен това ултразвуковата обработка значително намали загубата на продукт по време на филтрацията. Филтратът от необработената културална течност с високомолекулен SPG (специфична вложена енергия 0 Ws/mL) съдържаше 0,3 ± 0,07 g/L SPG, докато концентрацията на SPG преди дълбочинната филтрация беше 2 g/L. За разлика от това филтратът от културалната течност, обработена ултразвуково при 100 Ws/mL, съдържаше SPG с концентрация 2,2 ± 0,2 g/L, което съответства на почти нулева загуба на продукт.

Заключение: В заключението си изследователският екип обобщава, че ултразвуковата обработка е ефективна технология за производство на шизофилан с ниско молекулно тегло, който след това може да се използва в козметиката и медицината. Когато се прилага върху цялата културална течност с мицел, ултразвуковата обработка осигурява определени предимства при производството на шизофилан. Тя намалява загубите на продукт при последващата обработка и прави възможно производството на високопречистен полизахарид благодарение на ефективното използване на ултрафилтрация.
Освен това изследователите установиха, че ултразвуковата обработка на шизофилан се мащабира лесно. Един ултразвуков дезинтегратор UIP2000hdT от пилотната инсталация обработи 1 литър културална течност за 110 s в проточен режим. Производителността на системата може лесно да се увеличи чрез последователно свързване на допълнителни ултразвукови апарати.

 
Прочетете повече за лесното мащабиране на екстракцията от гъби!
 

Високопроизводително ултразвуково оборудване за обработка на гъбни глюкани

Фрагментацията на полизахариди като глюкани, както и на други биоактивни съединения като хитин и хитозан, може да се извършва надеждно с високопроизводителното ултразвуково оборудване на Hielscher. Нашите ултразвукови апарати могат да осигуряват високи амплитуди, предлагат прецизно управление на параметрите на процеса и могат да работят 24/7 при голямо натоварване и в тежки условия. Гамата оборудване на Hielscher Ultrasonics надеждно изпълнява тези изисквания. Освен изключителните ултразвукови характеристики, ултразвуковите апарати на Hielscher се отличават с висока енергийна ефективност, което е значително икономическо предимство – особено когато се използват в широкомащабно търговско производство.
Ултразвуковите апарати на Hielscher са високопроизводителни системи, които могат да бъдат оборудвани с принадлежности като сонотроди, усилватели, реактори или проточни клетки, за да отговарят оптимално на нуждите на вашия процес.
Цифровият цветен дисплей, възможността за предварително задаване на цикли на ултразвукова обработка, автоматичното записване на данни върху вградена SD карта, дистанционното управление чрез браузър и многобройните други функции осигуряват най-висока степен на управление на процеса и удобство при работа. В съчетание със здравината и способността да издържат на голямо натоварване, ултразвуковите системи на Hielscher са вашият надежден работен помощник в производството.
Намаляването на молекулното тегло на β-глюкани като шизофилан изисква мощен ултразвук, за да се постигнат целевото разцепване и висококачествен краен продукт от шизофилан, който може да се използва за фармацевтични приложения.
 
Тук ще намерите повече информация за ултразвуковата екстракция на бета-глюкани от гъби, включително инструкции стъпка по стъпка!
 
Таблицата по-долу дава представа за приблизителния капацитет за обработка на нашите ултразвукови апарати: