Образуване на амилоидни фибрили с ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP

Амилоидните фибрили, подобно на кристалите, се образуват чрез процес на нуклеация и последващ растеж. Поради високата свободноенергийна бариера на нуклеацията обаче спонтанното образуване на амилоидни фибрили настъпва само след продължителна лаг фаза. Ултразвуковата обработка се утвърди като мощен инструмент за предизвикване на амилоидна нуклеация, като по този начин значително ускорява образуването на фибрили. В комбинация с четец за микроплаки, използващ флуоресценцията на тиофлавин T (ThT), ултразвуковата обработка позволява откриване на амилоидни фибрили едновременно в множество проби с висок капацитет за обработка.

Образуване на амилоидни фибрили, индуцирано с ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP

С ултразвуковия апарат за многогнездови плаки UIP400MTP могат бързо да се синтезират големи количества амилоидни фибрили с еднакво качество за изследователски цели. Този ефективен подход позволява изучаване на амилоидогенността на протеините. Техниката улеснява бързото и възпроизводимо образуване на амилоидни фибрили, както е демонстрирано с β2-микроглобулин (β2-m) – амилоидогенен протеин, свързан с диализно асоциирана амилоидоза.

Прост експериментален подход: индуцирано с ултразвук образуване на амилоидни фибрили

За да се предизвика образуване на фибрили, микроплака с 96 гнезда беше поставена в центъра на ултразвуковия апарат за многогнездови плаки UIP400MTP, който осигурява равномерно ултразвуково въздействие във всички гнезда. Експерименталните условия бяха следните:

1. Всяко гнездо съдържаше 0,2 ml разтвор на β2-микроглобулин (0,3 mg/ml, pH 2,5) с добавени 5 μM ThT.
2. Плаката беше подложена на цикли на ултразвукова обработка, например 1 минута ултразвукова обработка, последвана от 9 минути пауза.
3. След ултразвуковата обработка флуоресценцията на ThT беше измерена с четец за микроплаки.

(вж. So et al., 2011)

Сравнение с конвенционално разклащане

В сравнение с традиционните методи на разклащане ултразвуковата обработка драстично намали лаг фазата на образуване на фибрили. При конвенционални условия на разклащане на микроплаки само 1 от 10 гнезда показа повишена флуоресценция на ThT след 20 часа. За разлика от това, при циклична ултразвукова обработка (15 минути ултразвукова обработка, последвани от 5 минути покой) беше установено значително повишаване на флуоресценцията на ThT непосредствено след първата ултразвукова обработка.

Бързо ускоряване на кинетиката на образуване на фибрили

Резултатите, получени от So et al. (2011), показаха, че спонтанното образуване на фибрили от β2-микроглобулин при pH 2,5 може да се ускори от няколко часа до само 10–15 минути чрез ултразвукова обработка.
Изображенията от атомно-силова микроскопия (AFM) потвърдиха, че фибрилите, получени чрез 10-минутна ултразвукова обработка на всеки 15 минути, са морфологично неразличими от тези, образувани чрез 1-минутна ултразвукова обработка на всеки 10 минути. Това подчертава възпроизводимостта и устойчивостта на индуцираното с ултразвук образуване на амилоидни фибрили.

AFM изображения на амилоидни фибрили, получени чрез 1 min ултразвукова обработка на всеки 10 min (i), чрез 10 min ултразвукова обработка на всеки 15 min (ii) и чрез реакция със засяване без ултразвукова обработка (iii). Бялата мащабна линия обозначава 1 μm.
Изследване и изображения: ©So et al., 2011

Образуване на фибрили при неутрално pH

Дори при неутрално pH образуването на фибрили беше постигнато след лаг период от 1,5 часа, което показва, че ултразвуковата обработка значително понижава енергийната бариера за нуклеация и растеж. Това допълнително подкрепя хипотезата, че образуването на амилоидни фибрили е предимно физична реакция, ограничена до голяма степен от енергийната бариера на нуклеацията, която ултразвуковата обработка ефективно намалява.

Въздействие върху изследванията на заболявания, свързани с амилоиди

Лесното и надеждно образуване на амилоидни фибрили с ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP има съществено значение за изследванията на болестта на Алцхаймер (AD) и други заболявания, свързани с амилоиди, като болестта на Паркинсон, диабет тип II и системните амилоидози. При AD агрегацията на амилоид-β (Aβ) е ключов патологичен белег, но изучаването на кинетиката на образуването на неговите фибрили остава трудно поради дългите лаг фази и вариабилността при конвенционалните методи. Образуването на фибрили, предизвикано чрез ултразвукова обработка, ускорява нуклеацията, като осигурява висока възпроизводимост и намалена вариабилност, което е от решаващо значение за скрининга на потенциални инхибитори и разбирането на амилоидогенните механизми. Освен това високият капацитет за обработка на проби на UIP400MTP позволява мащабни изследвания на неправилното нагъване и агрегацията на протеините, като улеснява откриването на терапевтични агенти, които могат да модулират образуването на фибрили и потенциално да ограничат прогресирането на невродегенерацията.

Това изследване установява ултразвуковата обработка с ултразвуковия апарат за многогнездови плаки UIP400MTP като високоефективен метод за ускоряване на образуването на амилоидни фибрили. Основните предимства на този подход включват:

• Драстично намаляване на лаг периода при образуването на фибрили.
• Равномерно ултразвуково въздействие във всички гнезда, позволяващо възпроизводимо образуване на фибрили.
• Възможност за скрининг с висок капацитет за обработка на проби, което го прави подходящ за търсене на амилоидогенност на протеините в мащаба на целия геном.

Чрез съчетаване на ултразвуковата обработка с флуоресцентно откриване чрез ThT този метод осигурява бърза, мащабируема и надеждна платформа за изучаване на образуването на амилоидни фибрили. Предвид неговата ефективност и потенциал за висок капацитет за обработка на проби, този подход може да улесни лесния синтез на амилоидни фибрили за биофизични и фармацевтични изследвания, като предлага обещаващ инструмент за изследвания, свързани с амилоиди, и скрининг на лекарствени средства.