Образуване на амилоиден фибрил с помощта на UIP400MTP Microplate Sonicator

Амилоидните фибрили, подобно на кристалите, се образуват чрез процес на зародяване и последващ растеж. Въпреки това, поради високата бариера на свободната енергия на нуклеацията, спонтанното образуване на амилоиден фибрил се случва само след продължителна фаза на забавяне. Ултразвукът се очертава като мощен инструмент за индуциране на амилоидна нуклеация, като по този начин значително ускорява образуването на фибрили. Когато се комбинира с четец на микроплаки, използващ флуоресценция на тиофлавин Т (ThT), ултразвукът позволява откриване на амилоидни фибрили с висока производителност в множество проби едновременно.

Ултразвуково индуцирано образуване на амилоиден фибрил с UIP400MTP микроплачен соникатор

С UIP400MTP многоямковия плачен ултразвукоразтор, амилоидни фибрили със същото качество в големи количества могат бързо да бъдат синтезирани за изследователски цели. Този ефективен подход позволява изучаване на протеиновата амилоидогенност. Тази техника улеснява бързата и възпроизводима амилоидно мъждене, както е демонстрирано при β2-микроглобулин (β2-m), амилоидогенен протеин, свързан с амилоидоза, свързана с диализа.

Прост експериментален подход: ултразвуково индуцирано амилоидно мъждене

За да се предизвика образуването на фибрили, в центъра на многоямковия ултразвук UIP400MTP е поставена 96-ямкова микроплоча, която осигурява равномерно ултразвуково излагане във всички ямки. Условията на експеримента са както следва:

1. Всяка ямка съдържа 0,2 ml разтвор на β2-микроглобулин (0,3 mg/ml, pH 2,5), допълнен с 5 μM ThT.
2. Плочата е подложена на ултразвукови цикли, като 1-минутна ултразвукова обработка, последвана от 9 минути пауза.
3. След ултразвука флуоресценцията на ThT е измерена с помощта на четец на микроплаки.

(срв. So et al., 2011)

Сравнение с конвенционалното разбъркване

В сравнение с традиционните методи за разбъркване, ултразвукът драстично намалява лаг фазата на образуване на фибрили. При конвенционални условия на разклащане на микроплочи само 1 от 10 кладенци показват повишена ThT флуоресценция след 20 часа. За разлика от това, при използване на циклична ултразвукова реакция (15 минути ултразвук, последвана от 5 минути покой), значително увеличение на флуоресценцията на ThT е открито веднага след първата ултразвукова обработка.

Бързо ускоряване на кинетиката на фибрилацията

Резултатите, получени от So et al. (2011), показват, че спонтанното образуване на фибрил на β2-микроглобулин при рН 2,5 може да бъде ускорено от няколко часа до само 10-15 минути с ултразвук.
Изображенията на атомно-силовата микроскопия (AFM) потвърждават, че фибрилите, генерирани чрез 10-минутна ултразвукова диагностика на всеки 15 минути, са морфологично неразличими от тези, образувани с помощта на 1-минутен ултразвук на всеки 10 минути. Това подчертава възпроизводимостта и устойчивостта на ултразвуково индуцираното амилоидно мъждене.

AFM изображения на амилоидни фибрили, получени чрез 1-минутна ултразвукова обработка на всеки 10 минути (i), чрез 10-минутна ултразвукова обработка на всеки 15 минути (ii) и чрез реакцията на засяване без ултразвук (iii). Бялата скала представлява 1 μm.
Проучване и изображения: ©So et al., 2011

Мъждене при условия на неутрално рН

Дори при условия на неутрално рН, образуването на фибрил се постига след забавяне от 1,5 часа, което показва, че ултразвукът значително понижава енергийната бариера за нуклеация и растеж. Това допълнително подкрепя хипотезата, че амилоидното мъждене е предимно физическа реакция, до голяма степен ограничена от енергийната бариера на нуклеацията, която ултразвукът ефективно намалява.

Въздействие върху изследванията на амилоидните заболявания

Лесното и надеждно образуване на амилоидни фибрили с помощта на ултразвука на UIP400MTP микроплоча има значителни последици за изследванията на болестта на Алцхаймер (AD) и други свързани с амилоид заболявания, като болестта на Паркинсон, диабет тип II и системни амилоидози. При Алцхаймер агрегацията на амилоид-β (Aβ) е ключов патологичен отличителен белег, но изучаването на нейната фибрилационна кинетика остава предизвикателство поради дългите фази на забавяне и променливостта при конвенционалните методи. Образуването на фибрили, задвижвано от ултразвук, ускорява нуклеацията, осигурявайки висока възпроизводимост и намалена вариабилност, което е от решаващо значение за скрининг на потенциални инхибитори и разбиране на амилоидогенните механизми. Освен това, високата производителност на UIP400MTP позволява широкомащабни изследвания на неправилно нагъване и агрегиране на протеини, улеснявайки откриването на терапевтични агенти, които могат да модулират образуването на фибрила и потенциално да смекчат невродегенеративната прогресия.

Това изследване установява ултразвук с помощта на UIP400MTP многоямков плачен ултразвук като високоефективен метод за ускоряване на образуването на амилоиден фибрил. Основните предимства на този подход включват:

• Драстично намаляване на времето на забавяне за мъждене.
• Равномерно ултразвуково излагане във всички ямки, което позволява възпроизводимо образуване на фибрили.
• Възможност за скрининг с висока производителност, което го прави подходящ за търсене на протеинова амилоидогенност в целия геном.

Чрез интегриране на ултразвук с откриване на ThT флуоресценция, този метод осигурява бърза, мащабируема и надеждна платформа за изследване на амилоидно мъждене. Като се има предвид неговата ефективност и потенциал за висока производителност, този подход може да улесни лесния синтез на амилоидни фибрили за биофизични и фармацевтични изследвания, предлагайки обещаващ инструмент за изследвания, свързани с амилоиди, и скрининг на лекарства.