PMCA за откриване на приони с висока производителност с помощта на UIP400MTP Sonicator

Многоямковият ултразвукораздавател UIP400MTP предлага мощно решение за високопроизводителна подготовка на проби при циклична амплификация с погрешно сгъване на протеини (PMCA). Осигурявайки равномерно разпределение на енергията в множество кладенци и поддържайки точни параметри на ултразвука, тази система позволява едновременна обработка на множество проби с изключителна възпроизводимост. Тези възможности са от решаващо значение за оптимизиране на PMCA за откриване на приони в ниски концентрации в предизвикателни биологични проби, като слюнка, където инхибиторите на анализа могат да скрият резултатите.

Прионните заболявания, като болестта на хроничното линеене (CWD) при животни и болестта на Кройцфелд-Якоб (CJD) при хората, са невродегенеративни заболявания, причинени от неправилно нагънати прионови протеини (PrP^Ск). Тези заболявания често включват ниски нива на инфекциозни приони в телесните течности, като слюнка, кръв и урина, усложнявайки диагнозата и изследванията. Хоризонталното предаване на CWD чрез приони, хвърлени в екологичните матрици, има особено значителни последици за управлението на дивата природа и екологичното здраве. По същия начин, при заболявания като болестта на Кройцфелд-Якоб, надеждната амплификация на неправилно нагънати прионни протеини от човешки проби е от решаващо значение за напредъка на диагностиката и разбирането на прогресията на заболяването.

Прилагането на модифициран протокол за PMCA позволява да се заобиколят често срещаните инхибитори на анализа (напр. муцини в слюнката) и да се постигне висока чувствителност при откриване на приони, които иначе биха били неоткриваеми или двусмислени, като се използват техники като преобразуване, предизвикано от земетресение в реално време (RT-QuIC). Тези постижения подобряват откриването на приони за различни заболявания, което прави PMCA незаменим инструмент за изследване и диагностика на приони. Многоямковият плачени ултразвук UIP400MTP улеснява високопроизводителното ултразвук на PMCA множество проби в микроплаки (напр. 6-, 24- или 96-ямкови плаки) или флакони в решетка за тръби.

Протокол за циклична амплификация с неправилно сгъване на протеини с висока производителност (PMCA)

Следният протокол позволява ефективна обработка на голям брой проби при абсолютно същите условия за надеждни резултати от изследванията.

Подготовка на пробата

Изходен материал:
Подгответе проби чрез:

• Ресуспендиране на гранули за екстракция на саркозил в субстрат от PMCA.
• Директно поставяне на мозъчни хомогенати или кръвни проби с прионови семена.

Субстрат:

• Използвайте 10% (тегловно/об) мозъчен хомогенат, приготвен от трансгенни мишки, свръхекспресиращи PrP^C (напр. Tg мишки).
• Хомогенизиране на мозъчната тъкан в:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Тритон Х-100.
• Съхранявайте субстрата при -80ºC до употреба.

Настройка на пробата в микроплаки или епруветки:
Тръби:

• Добавят се 90 μL мозъчен хомогенен субстрат и семена с 10 μL проба (напр. кръв, мозъчен хомогенат или саркозил пелети).
• Поставете 3 тефлонови мъниста (1,59 мм или 2,38 мм диаметър) във всяка тръба от 0,2 ml.
• Монтирайте тръбите в багажник, съвместим с UIP400MTP ултразвука.

6-ямкова микроплоча:

• Добавете 5 ml мозъчен хомогенен субстрат и семена с 500 μL проба на ямка.
• Добавете 3 тефлонови мъниста към всяка ямка.

Процедура за PMCA

Разположение:
Поставете тръбната решетка или 6-ямковата микроплоча в UIP400MTP ултразвука според инструкциите на производителя.

Колоездачна програма:
Изпълнете 144 цикъла PMCA, както следва:

• Инкубация: 29 минути и 30 секунди при 37°C.
• Соникация: 30 секунди при 60% амплитуда.
• Следете температурата: Използвайте щепселния температурен сензор, за да следите температурата на пробата и програмирайте UIP400MTP на максимална температура от 48–50°C.

Следващи кръгове:
След като завършите първия кръг от 144 цикъла, прехвърлете аликвотна част от амплифицирания материал:

• Разредете 10 пъти в пресен трансгенен мозъчен хомогенен субстрат на мишката.
• Извършете 96 цикъла PMCA за следващи кръгове, като поддържате същите параметри на ултразвук.
• Продължете за желания брой рундове (обикновено до 5).

Откриване на PrP^Ск

1. Храносмилане на протеиназа К:
   – Пробите се третират с протеиназа К (50 μg/ml) при 37°C в продължение на 1 час.
   – Прекратете храносмилането чрез добавяне на SDS-пробен буфер и кипване в продължение на 10 минути.
2. Анализ на западните петна:
   – Анализирайте разградените проби, като използвате:
   – 6H4 или PRC1 анти-PrP антитела.
   – Извършете SDS-PAGE и прехвърлете към PVDF мембрани за откриване.

 

 

Обработвайте повече проби за по-стабилни резултати

Многоямковият пластинчатият ултразвуков уред UIP400MTP значително подобрява ефективността и мащабируемостта на цикличната амплификация с погрешно сгъване на протеини (PMCA), адресирайки традиционно отнемащия време характер на процедурата. Като позволява едновременна обработка на до 96 проби в 96-ямкова плоча, системата рационализира работните процеси на PMCA, като същевременно поддържа прецизни и еднакви условия на ултразвук във всички кладенци. Тази възможност за висока производителност минимизира ръчното боравене, намалява трудоемките стъпки и гарантира възпроизводимост, което го прави незаменим инструмент за изследване на приони. Независимо дали изследва болестта на хроничното линеене или болестта на Кройцфелд-Якоб, UIP400MTP улеснява широкомащабните изследвания с по-голяма ефективност, позволявайки на изследователите да отговорят на изискванията на съвременните диагностични и научни приложения.

---

---

Литература / Препратки

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.