PMCA за откриване на приони с висок капацитет за обработка на проби чрез ултразвуковия апарат UIP400MTP

Ултразвуковият апарат UIP400MTP за многоямкови плаки предлага мощно решение за подготовка на проби с висок капацитет при цикличната амплификация на неправилно нагънати протеини (PMCA). Чрез равномерно разпределение на енергията между множество ямки и поддържане на прецизни параметри на ултразвуковата обработка тази система позволява едновременната обработка на многобройни проби с изключителна възпроизводимост. Тези възможности са от решаващо значение за оптимизирането на PMCA за откриване на приони при ниски концентрации в биологични проби, които представляват предизвикателство, като слюнка, в които инхибиторите на анализа могат да затруднят интерпретацията на резултатите.

Прионните заболявания, като хроничната изтощаваща болест (CWD) при еленовите и болестта на Кройцфелд-Якоб (CJD) при хората, са невродегенеративни заболявания, причинени от неправилно нагънати прионни протеини (PrP^Sc). Тези заболявания често са свързани с ниски нива на инфекциозни приони в телесните течности, като слюнка, кръв и урина, което усложнява диагностиката и изследванията. Хоризонталното предаване на CWD чрез приони, отделени в матрици на околната среда, има особено значими последици за управлението на дивата фауна и здравето на екосистемите. По подобен начин при заболявания като болестта на Кройцфелд-Якоб надеждната амплификация на неправилно нагънати прионни протеини от човешки проби е от решаващо значение за развитието на диагностиката и разбирането на прогресията на заболяването.

Прилагането на модифициран протокол за PMCA позволява да се преодолее действието на често срещани инхибитори на анализа (напр. муцини в слюнката) и да се постигне висока чувствителност при откриването на приони, които иначе не биха могли да бъдат открити или биха дали нееднозначни резултати при използване на техники като индуцирано чрез разклащане преобразуване в реално време (RT-QuIC). Тези постижения подобряват откриването на приони при различни заболявания, което прави PMCA незаменим инструмент за изследване и диагностика на приони. Ултразвуковият апарат UIP400MTP за многоямкови плаки улеснява PMCA с висок капацитет за обработка на проби, като обработва с ултразвук многобройни проби в микроплаки (напр. плаки с 6, 24 или 96 ямки) или във флакони в статив за епруветки.

Протокол за циклична амплификация на неправилно нагънати протеини (PMCA) с висок капацитет за обработка на проби

Следният протокол позволява ефективна обработка на голям брой проби при напълно еднакви условия за получаване на надеждни изследователски резултати.

Подготовка на пробите

Изходен материал:
Подгответе пробите чрез:

• Ресуспендиране на утайките от екстракцията със саркозил в субстрат за PMCA.
• Директно добавяне на прионни зародиши към мозъчни хомогенати или кръвни проби.

Субстрат:

• Използвайте 10% (маса/обем) мозъчен хомогенат, приготвен от трансгенни мишки със свръхекспресия на PrP^C (напр. Tg мишки).
• Хомогенизирайте мозъчната тъкан в:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Съхранявайте субстрата при -80ºC до употреба.

Разпределяне на пробите в микроплака или епруветки:
Епруветки:

• Добавете 90 μL субстрат от мозъчен хомогенат и внесете прионни зародиши с 10 μL проба (напр. кръв, мозъчен хомогенат или саркозилова утайка).
• Поставете 3 тефлонови микросфери (с диаметър 1,59 mm или 2,38 mm) във всяка епруветка с обем 0,2 mL.
• Поставете епруветките в статив, съвместим с ултразвуковия апарат UIP400MTP.

Микроплака с 6 ямки:

• Добавете 5 mL субстрат от мозъчен хомогенат и внесете прионни зародиши с 500 μL проба във всяка ямка.
• Добавете 3 тефлонови микросфери във всяка ямка.

Процедура за PMCA

Поставяне:
Поставете статива за епруветки или микроплаката с 6 ямки в ултразвуковия апарат UIP400MTP съгласно инструкциите на производителя.

Програма на циклите:
Изпълнете 144 цикъла на PMCA, както следва:

• Инкубация: 29 минути и 30 секунди при 37°C.
• Ултразвукова обработка: 30 секунди при 60% амплитуда.
• Следете температурата: използвайте свързваемия температурен сензор, за да следите температурата на пробите, и програмирайте UIP400MTP за максимална температура от 48–50°C.

Последващи серии:
След завършване на първата серия от 144 цикъла прехвърлете аликвотна част от амплифицирания материал:

• Разредете 10-кратно в пресен субстрат от мозъчен хомогенат от трансгенни мишки.
• Изпълнете 96 цикъла на PMCA за последващите серии, като поддържате същите параметри на ултразвуковата обработка.
• Продължете до желания брой серии (обикновено до 5).

Откриване на PrP^Sc

1. Разграждане с протеиназа K:
   – Обработете пробите с протеиназа K (50 μg/mL) при 37°C за 1 час.
   – Прекратете разграждането чрез добавяне на буфер за проби със SDS и кипене в продължение на 10 минути.
2. Уестърн блот анализ:
   – Анализирайте разградените проби, като използвате:
   – антитела срещу PrP 6H4 или PRC1.
   – Извършете SDS-PAGE и прехвърлете върху PVDF мембрани за откриване.

 

Hielscher UIP400MTP е най-гъвкавият ултразвуков процесор за Вашите многоямкови плаки, PCR плаки или епруветки за проби. С непрекъсната ултразвукова мощност от 400 вата той е предназначен за приложения като клетъчен лизис, емулгиране, извличане на протеини, фрагментиране на ДНК / РНК, деагломериране, извличане от FFPE проби, отделяне на клетки и биофилми или емулгиране. UIP400MTP не е ултразвукова вана. Той е чашков сонотрод с висок интензитет за фокусирана ултразвукова обработка. Този мощен безконтактен ултразвуков процесор осигурява равномерна ултразвукова обработка във всички ямки на Вашата стандартна плака. Разполагате с прецизен контрол върху амплитудата, мощността и импулсния режим. Вграден таймер и температурна сонда осигуряват възпроизводими резултати. Ултразвуковият процесор за плаки UIP400MTP охлажда пробите чрез водна баня с опционален външен охладител.

 

Обработвайте повече проби за по-надеждни резултати

Ултразвуковият апарат UIP400MTP за многоямкови плаки значително повишава ефективността и мащабируемостта на цикличната амплификация на неправилно нагънати протеини (PMCA), като преодолява традиционно продължителния характер на процедурата. Като позволява едновременната обработка на до 96 проби в плака с 96 ямки, системата оптимизира работните процеси на PMCA, като същевременно поддържа прецизни и равномерни условия на ултразвукова обработка във всички ямки. Този висок капацитет за обработка на проби свежда до минимум ръчните манипулации, намалява трудоемките стъпки и осигурява възпроизводимост, което го прави незаменим инструмент за изследване на приони. Независимо дали се изследва хроничната изтощаваща болест, или болестта на Кройцфелд-Якоб, UIP400MTP улеснява мащабните проучвания с по-голяма ефективност, като позволява на изследователите да отговорят на изискванията на съвременните диагностични и научни приложения.

---

---

Литература / Източници

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.