Yüksək dərəcədə təmizlənmiş şizofillan beta-qlükanlarının ultrasəslə istehsalı

Şizofillan immunomodulyator xüsusiyyətlərə malik göbələk mənşəli β-qlükandır. Yüksək fəallıqlı müalicəvi təsirlər üçün şizofillan daha yaxşı biomənimsənilmə göstərmək məqsədilə aşağı molekulyar çəkiyə malik olmalıdır. Ultrasəslə emalın şizofillanın molekulyar çəkisini azaltdığı sübut edilmişdir. Etibarlı və effektiv üsul kimi ultrasəslə emal aşağı molekulyar çəkili şizofillanın istehsalında asanlıqla tətbiq edilə bilər.

Schizophyllum göbələkləri və beta-qlükanın ultrasəslə ekstraksiyası

Schizophyllum göbələyinin növləri təbiətdə yağışlı mövsümlərdən sonra çürüyən ağacların üzərində böyüyür. Meyvə cisimləri növbəti quraq mövsümdə toplanır. Schizophyllum növləri qlükanlar kimi biokimyəvi birləşmələrlə zəngindir və buna görə də xüsusilə tropik ölkələrdə qida və dərman kimi istifadə olunur. İmmunomodulyator, göbələk əleyhinə, antineoplastik və virus əleyhinə xüsusiyyətlərinə görə yarıq lövhəcikli göbələk kimi də tanınan Schizophyllum commune biotexnologiya və əczaçılıq şirkətlərinin diqqətini cəlb etmişdir.
Sizofiran, sonifilan və ya sizofilan kimi də tanınan şizofillan polisaxaridi Schizophyllum göbələklərində tapılan əsas β-qlükandır; bu göbələklər yüksək effektivliyə malik bioaktiv β-qlükan olan şizofillanın mənbəyidir.
Schizophyllum commune göbələkləri təbiətdə ağacların üzərində böyüyür; miselium fermentasiya bulyonunda da yetişdirilə bilər. Əczaçılıq və kosmetik tətbiqlər üçün aşağı molekulyar çəkili şizofillan yüksək molekulyar çəkili şizofillandan xeyli daha effektivdir. Bunun səbəbi aşağı molekulyar çəkili şizofillanın əhəmiyyətli dərəcədə daha yaxşı biomənimsənilmə və sorulma göstəricilərinə malik olmasıdır. Bundan əlavə, yüksək molekulyar çəkili şizofillan sulu məhlullarının yüksək özlülüyünə səbəb olduğundan tətbiqlərdə çox vaxt problem yaradır.
Ultrasəslə ölçünün kiçildilməsi şizofillanın molekulyar çəkisini azaltmaq və bununla da β-qlükan molekulunun keyfiyyətini artırmaq üçün yüksək effektivliyə malik və etibarlı üsuldur.

Aşağı molekulyar çəkili şizofillanın istehsalı üçün protokol

Molekulyar çəkili şizofillan kəskin dərəcədə daha yaxşı biomənimsənilmə və tətbiq xüsusiyyətləri göstərdiyindən, Smirnou-nun tədqiqat qrupu β-qlükan molekulu olan şizofillanın parçalanması və ölçüsünün kiçildilməsi üçün ultrasəslə emalı araşdırmışdır.

Şizofillanın ultrasəslə emalı

β-1.3(1.6)-qlükan olan şizofillan (SPG) substrat kimi saxarozadan istifadə etməklə S. commune göbələyinin bioreaktorda maye mühitdə yetişdirilməsi yolu ilə istehsal edilmişdir.
Yetişdirilmə başa çatdıqdan sonra kultura bulyonu şizofillan konsentrasiyası 2 g/L olana qədər demineralizasiya edilmiş su ilə durulaşdırılmış və ultrasəslə emal üçün istifadə olunan cihaz UIP2000hdT ultrasəs prosessoru (Hielscher Ultrasonics GmbH, Almaniya) olmuşdur; emal təkrar dövriyyə rejimində aşağıdakı parametrlər və şəraitdə aparılmışdır: mühitin axın sürəti 50 mL/s, tezlik 20 kHz, çıxış gücü 2000 W, sonotrod tipi BS2d22, amplituda gücləndiricisinin tipi B2-1.4 və amplituda 100%. Ultrasəslə emalın əvvəlində kultura bulyonunun temperaturu 25°C olmuşdur. Ultrasəslə emal edilmiş kultura bulyonu (xüsusi enerji girişi 100 Ws/mL) 40°C-də 1,5 bar təzyiq altında Seitz HS800 dərinlik filtrindən keçirilmişdir. Kimyəvi xarakteristika üçün ultrasəslə emal edilmiş şizofillan (uSPG) laboratoriya temperaturunda filtratdan üçqat miqdarda izopropil spirti ilə çökdürülmüş və 60°C-də 12h ərzində qurudulmuşdur. İmmunoloji tədqiqatlar üçün uSPG məhlulları aşağıdakı qaydada hazırlanmışdır: (1) ultrasəslə emal edilmiş kultura bulyonunun filtratı 0,8 bar təzyiqdə 0,1m2 Pall Centramate T-series PES kasetindən (100 kDa ayırma həddi) diafiltrasiya edilmiş və retentatın elektrik keçiriciliyi 20 μS/cm olana qədər diafiltrasiya davam etdirilmişdir; (2) məhlul diafiltrasiya ilə uSPG konsentrasiyası 1 g/L olana qədər qatılaşdırılmış və 120°C/20 min şəraitində avtoklavlama ilə sterilizasiya edilmişdir. Denaturasiya edilmiş uSPG oxşar qaydada hazırlanmışdır, lakin kultura bulyonunun filtratına 0,2 M konsentrasiyada NaOH əlavə edilmiş və qələviləşdirilmiş məhlul diafiltrasiyadan əvvəl laboratoriya temperaturunda 30 min ərzində inkubasiya edilmişdir.

Analitik üsullar

Miselium çıxımı qravimetrik üsulla qiymətləndirilmişdir: kultura bulyonu su ilə 1:4 nisbətində durulaşdırılmış, 25°C-də 20 min ərzində 10.000 × g-də sentrifuqalanmış, çöküntü üçqat miqdarda su ilə yuyulmuş, 60°C-də qurudulmuş və çəkilmişdir. Şizofillan supernatantdan üçqat miqdarda izopropil spirti ilə çökdürülmüş, 60°C-də 24h ərzində qurudulmuş və çıxımı qravimetrik üsulla müəyyən edilmişdir. Kultura bulyonunda pO2 Hamilton-Visiferm DO 120 optik zondu (Hamilton, İsveçrə) ilə ölçülmüşdür.
Kultura bulyonunun dinamik özlülüyü HAAKE Visco Tester 6L cihazında 1L və 2L şpindelləri ilə 4°C-də və 30 rpm fırlanma sürətində ölçülmüşdür. Filtrasiya sürəti 500 mL kultura bulyonunun 1,5 bar təzyiqdə və 40°C-də 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, ABŞ) dərinlik filtrindən keçmə müddətinə əsasən hesablanmışdır.
uSPG-nin molekulyar çəkisi ardıcıl birləşdirilmiş PL aquagel OH60 və PL aquagel OH40 sütunları olan Alliance (Waters) HPLC sistemində SEC-MALLS üsulu ilə ölçülmüş və miniDAWN TREOS (Wyatt) detektoru diafiltrasiya ilə uSPG konsentrasiyası 1 g/L olana qədər qatılaşdırılmış və 120°C/20 min şəraitində avtoklavlama ilə sterilizasiya edilmişdir. Denaturasiya edilmiş uSPG oxşar qaydada hazırlanmışdır, lakin kultura bulyonunun filtratına 0,2 M konsentrasiyada NaOH əlavə edilmiş və qələviləşdirilmiş məhlul diafiltrasiyadan əvvəl laboratoriya temperaturunda 30 min ərzində inkubasiya edilmişdir.

Nəticələr:
SPG-nin sonrakı emalını asanlaşdırmaq üçün ultrasəslə emal birbaşa miselium olan S. commune-nin 144-h kultura bulyonuna tətbiq edilmişdir.
 
Ultrasəslə emal edilmiş şizofillanın xüsusiyyətləri: Ultrasəslə emal edilmiş şizofillan (uSPG) kultura bulyonunun filtratından spirtlə çökdürülmüş və xüsusiyyətləri müəyyən edilmişdir. SEC-MALLS üsulu ilə uSPG-nin Mw qiymətinin təxminən 1 MDa olduğu müəyyən edilmişdir. Maye fermentasiyadan alınan şizofillanın orta molekulyar çəkisi təxminən 5 MDa olduğu halda, bərk fazada yetişdirilmə zamanı bu göstərici 10 MDa-ya qədər çata bilər. Ultrasəslə emal edilmiş şizofillanın molekulyar çəkisini emal olunmamış təbii şizofillanın molekulyar çəkiləri ilə müqayisə etdikdə, ultrasəslə emal nəticəsində molekulyar çəkinin 5–10 dəfə azaldığı müşahidə edilə bilər.
Ultrasəslə emal edilmiş uSPG polisaxaridinin tərkibində 0,7%w/w zülal və yandırıldıqdan sonra 1,0%w/w qalıq olmuşdur. uSPG hidrolizatının 99%-dən çoxunu qlükoza təşkil etmişdir. Analitik nəticələr göstərir ki, ultrasəslə emal β-qlükanın əsas zəncirini təsadüfi şəkildə parçalayır, yan şaxələr isə bütöv qalır və bununla şizofillanın ölçüsü və molekulyar çəkisi azalır. Demək olar ki, zülal və endotoksinlərdən azad uSPG üzərində aparılan immunoloji tədqiqatlar ultrasəslə emal edilmiş aşağı Mw-li şizofillanın aydın ifadə olunmuş immunomodulyator fəallığa malik olduğunu göstərmişdir.

 
Azaldılmış özlülük: Ultrasəslə emal kultura bulyonunun özlülüyünün əhəmiyyətli dərəcədə azalmasına səbəb olmuşdur. Ultrasəslə emal zamanı kultura bulyonunun özlülüyü qeyri-xətti şəkildə dəyişmişdir: özlülük ultrasəslə emalın əvvəlində sürətlə azalmış, lakin sonradan bu azalma yavaşlamışdır. 100 Ws/mL xüsusi enerji girişi kultura bulyonunun özlülüyünü təxminən 7 dəfə azaltmaq üçün kifayət etmişdir.

Yaxşılaşdırılmış filtrasiya: Ultrasəslə emal edilmiş kultura bulyonu yüksək molekulyar çəkili SPG olan emal edilməmiş kultura bulyonuna (xüsusi enerji girişi 0 Ws/mL) nisbətən filtrdən daha sürətlə keçmişdir. Bundan əlavə, ultrasəslə emal filtrasiya zamanı məhsul itkisini əhəmiyyətli dərəcədə azaltmışdır. Yüksək molekulyar çəkili SPG olan emal edilməmiş kultura bulyonunun filtratında (xüsusi enerji girişi 0 Ws/mL) 0,3 ± 0,07 g/L SPG olduğu halda, dərinlik filtrasiyasından əvvəl SPG konsentrasiyası 2 g/L olmuşdur. Bunun əksinə olaraq, 100 Ws/mL enerji girişi ilə ultrasəslə emal edilmiş kultura bulyonunun filtratında SPG konsentrasiyası 2,2 ± 0,2 g/L olmuşdur ki, bu da məhsul itkisinin demək olar ki, sıfır olmasına uyğun gəlir.

Yekun: Tədqiqat qrupu yekununda bildirir ki, ultrasəslə emal sonradan kosmetikada və tibbdə istifadə edilə bilən aşağı molekulyar çəkili şizofillanın istehsalı üçün effektiv texnologiyadır. Miselium olan bütöv kultura bulyonuna tətbiq edildikdə ultrasəslə emal şizofillan istehsalına müəyyən üstünlüklər gətirir. O, sonrakı emal zamanı məhsul itkilərini azaldır və ultrafiltrasiyadan səmərəli istifadə hesabına yüksək dərəcədə təmizlənmiş polisaxaridin istehsalını mümkün edir.
Bundan əlavə, tədqiqatçılar şizofillanın ultrasəslə emalının miqyasının asanlıqla artırıla bildiyini müəyyən etmişlər. Təcrübə-sənaye qurğusunun bir UIP2000hdT ultrasəs dezinteqratoru axın rejimində 1 litr kultura bulyonunu 110 s ərzində emal etmişdir. Əlavə ultrasəs qurğularının ardıcıl qoşulması ilə sistemin məhsuldarlığı asanlıqla artırıla bilər.

 
Göbələk ekstraksiyasının miqyasının asanlıqla artırılması barədə daha ətraflı oxuyun!
 

Göbələk mənşəli qlükanların emalı üçün yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs avadanlığı

Qlükanlar kimi polisaxaridlərin, eləcə də xitin və xitozan kimi digər bioaktiv birləşmələrin parçalanması Hielscher yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs avadanlığı ilə etibarlı şəkildə həyata keçirilə bilər. Ultrasəs cihazlarımız yüksək amplitudalar təmin edə bilir, proses parametrlərinə dəqiq nəzarət imkanı verir və ağır yük altında, çətin mühitlərdə 24/7 işlədilə bilər. Hielscher Ultrasonics avadanlıq çeşidi bu tələbləri etibarlı şəkildə yerinə yetirir. Üstün ultrasəs göstəricilərindən əlavə, Hielscher ultrasəs cihazları yüksək enerji səmərəliliyi ilə seçilir ki, bu da əhəmiyyətli iqtisadi üstünlükdür – xüsusilə iri miqyaslı kommersiya istehsalında istifadə edildikdə.
Hielscher ultrasəs cihazları prosesinizin ehtiyaclarına optimal uyğunlaşmaq üçün sonotrodlar, amplituda gücləndiriciləri, reaktorlar və ya axın hüceyrələri kimi aksesuarlarla təchiz edilə bilən yüksək məhsuldarlıqlı sistemlərdir.
Rəqəmsal rəngli ekran, ultrasəslə emal dövrlərini əvvəlcədən təyin etmək imkanı, inteqrasiya edilmiş SD kartda məlumatların avtomatik qeydə alınması, brauzer vasitəsilə uzaqdan idarəetmə və bir çox digər funksiyalar sayəsində prosesə ən yüksək səviyyədə nəzarət və istifadə rahatlığı təmin edilir. Möhkəmlik və ağır yükə davamlılıqla birlikdə Hielscher ultrasəs sistemləri istehsalda etibarlı iş gücünüzdür.
Şizofillan kimi β-qlükanların molekulyar çəkisinin azaldılması hədəflənmiş parçalanmanı və əczaçılıq tətbiqlərində istifadə edilə bilən yüksək keyfiyyətli son şizofillan məhsulunu əldə etmək üçün güclü ultrasəs tələb edir.
 
Göbələklərdən beta-qlükanın ultrasəslə ekstraksiyası barədə addım-addım təlimatlar da daxil olmaqla daha ətraflı məlumatı burada tapa bilərsiniz!
 
Aşağıdakı cədvəl ultrasəs cihazlarımızın təxmini emal gücü barədə məlumat verir: