Sản xuất beta-glucan schizophyllan có độ tinh sạch cao bằng siêu âm
Schizophyllan là một β-glucan có nguồn gốc từ nấm với đặc tính điều hòa miễn dịch. Để có tác dụng dược lý mạnh, schizophyllan phải có khối lượng phân tử thấp nhằm cải thiện sinh khả dụng. Xử lý bằng siêu âm đã được chứng minh là làm giảm khối lượng phân tử của schizophyllan. Là một phương pháp đáng tin cậy và hiệu quả, xử lý bằng siêu âm có thể dễ dàng được áp dụng để sản xuất schizophyllan có khối lượng phân tử thấp.
Nấm Schizophyllum và chiết xuất beta-glucan bằng siêu âm
Các loài nấm Schizophyllum mọc tự nhiên trên cây mục sau mùa mưa. Thể quả được thu hái vào mùa khô tiếp theo. Các loài Schizophyllum giàu các hợp chất sinh hóa như glucan, do đó được sử dụng làm thực phẩm và thuốc, đặc biệt ở các nước nhiệt đới. Nhờ các đặc tính điều hòa miễn dịch, kháng nấm, chống ung thư và kháng vi-rút, Schizophyllum commune, còn gọi là nấm chân chim, đã thu hút sự quan tâm của các công ty công nghệ sinh học và dược phẩm.
Polysaccharide schizophyllan, còn được gọi là sizofiran, sonifilan hoặc sizofilan, là β-glucan chủ yếu có trong nấm Schizophyllum, nguồn cung cấp β-glucan schizophyllan có hoạt tính sinh học với hiệu quả cao.
Nấm Schizophyllum commune mọc tự nhiên trên cây; hệ sợi nấm cũng có thể được nuôi cấy trong dịch lên men. Trong các ứng dụng dược phẩm và mỹ phẩm, schizophyllan có khối lượng phân tử thấp có hiệu quả cao hơn nhiều so với schizophyllan có khối lượng phân tử cao. Điều này là do schizophyllan có khối lượng phân tử thấp có sinh khả dụng và tỷ lệ hấp thu tốt hơn đáng kể. Ngoài ra, schizophyllan có khối lượng phân tử cao thường gây khó khăn trong các ứng dụng vì dung dịch của chất này trong nước có độ nhớt cao.
Giảm kích thước bằng siêu âm là một kỹ thuật hiệu quả cao và đáng tin cậy để giảm khối lượng phân tử của schizophyllan, qua đó nâng cao chất lượng của phân tử β-glucan.
Thiết bị siêu âm UIP2000hdT đã được sử dụng thành công để giảm khối lượng phân tử của schizophyllan, một β-glucan có nguồn gốc từ nấm
Quy trình sản xuất schizophyllan có khối lượng phân tử thấp
Do schizophyllan có khối lượng phân tử thấp có sinh khả dụng và các đặc tính ứng dụng tốt hơn rõ rệt, nhóm nghiên cứu của Smirnou đã nghiên cứu việc xử lý bằng siêu âm để cắt mạch và giảm kích thước phân tử β-glucan schizophyllan.
Xử lý schizophyllan bằng siêu âm
β-1.3(1.6)-Glucan schizophyllan (SPG) được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy chìm nấm S. commune trong thiết bị phản ứng sinh học, sử dụng sucrose làm cơ chất.
Sau khi kết thúc nuôi cấy, dịch nuôi cấy được pha loãng bằng nước khử khoáng đến nồng độ schizophyllan 2 g/L và được xử lý bằng siêu âm với thiết bị xử lý siêu âm UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Đức) ở chế độ tuần hoàn với các thông số và điều kiện sau: lưu lượng môi trường 50 mL/s, tần số 20 kHz, công suất đầu ra 2000 W, đầu sonotrode loại BS2d22, bộ tăng biên độ loại B2-1.4 và biên độ 100%. Nhiệt độ dịch nuôi cấy khi bắt đầu xử lý bằng siêu âm là 25°C. Dịch nuôi cấy đã xử lý bằng siêu âm (năng lượng riêng đầu vào 100 Ws/mL) được lọc qua bộ lọc sâu Seitz HS800 dưới áp suất 1,5 bar ở 40°C. Schizophyllan đã xử lý bằng siêu âm (uSPG) dùng để xác định đặc tính hóa học được kết tủa từ dịch lọc bằng lượng cồn isopropyl gấp ba lần ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và được sấy ở 60°C trong 12h. Các dung dịch uSPG dùng cho nghiên cứu miễn dịch học được chuẩn bị như sau: (1) dịch lọc của dịch nuôi cấy đã xử lý bằng siêu âm được lọc rửa qua màng bằng cassette PES Pall Centramate T-series 0,1m2 (ngưỡng cắt 100 kDa) ở 0,8 bar và quá trình lọc rửa qua màng được tiếp tục cho đến khi độ dẫn điện của dịch giữ lại đạt 20 μS/cm; (2) dung dịch được cô đặc bằng phương pháp lọc rửa qua màng đến nồng độ uSPG 1 g/L và được tiệt trùng bằng nồi hấp ở 120°C/20 min. uSPG biến tính được chuẩn bị theo cách tương tự, ngoại trừ việc NaOH được bổ sung vào dịch lọc của dịch nuôi cấy đến nồng độ 0,2 M và dung dịch đã kiềm hóa được ủ trong 30 min ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trước khi lọc rửa qua màng.
Các phương pháp phân tích
Hiệu suất thu hệ sợi nấm được ước tính bằng phương pháp khối lượng: dịch nuôi cấy được pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:4, ly tâm ở 10.000 × g tại 25°C trong 20 min, phần kết tủa được rửa bằng lượng nước gấp ba lần, sấy ở 60°C và cân. Schizophyllan được kết tủa từ dịch nổi bằng lượng cồn isopropyl gấp ba lần, sấy ở 60°C trong 24h và hiệu suất thu được xác định bằng phương pháp khối lượng. pO2 trong dịch nuôi cấy được đo bằng đầu dò quang học Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Thụy Sĩ).
Độ nhớt động lực học của dịch nuôi cấy được đo trên HAAKE Visco Tester 6L với các trục quay 1L và 2L ở 4°C và tốc độ quay 30 rpm. Tốc độ lọc được tính từ thời gian lọc 500 mL dịch nuôi cấy qua bộ lọc sâu Seitz HS800 (Pall, Hoa Kỳ) kích thước 200 × 200 mm ở áp suất 1,5 bar và nhiệt độ 40°C.
Khối lượng phân tử của uSPG được đo bằng SEC-MALLS trên hệ thống HPLC Alliance (Waters) với các cột PL aquagel OH60 và PL aquagel OH40 nối tiếp, và đầu dò miniDAWN TREOS (Wyatt) được cô đặc bằng phương pháp lọc thẩm tích đến nồng độ uSPG 1 g/L và được tiệt trùng bằng hấp khử trùng ở 120°C/20 min. uSPG biến tính được chuẩn bị theo cách tương tự, ngoại trừ việc NaOH được thêm vào dịch lọc của dịch nuôi cấy ở nồng độ 0,2 M và dung dịch đã kiềm hóa được ủ trong 30 min ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trước khi lọc thẩm tích.
UIP2000hdT để giảm khối lượng phân tử của schizophyllan
Thiết bị siêu âm UP400St (400W, 24kHz) để xử lý schizophyllan
Phương pháp xử lý bằng siêu âm được áp dụng trực tiếp cho dịch nuôi cấy S. commune sau 144 giờ có chứa hệ sợi nấm nhằm tạo thuận lợi cho quá trình xử lý SPG sau nuôi cấy.
Đặc tính của schizophyllan được xử lý bằng siêu âm: Schizophyllan được xử lý bằng siêu âm (uSPG) được kết tủa từ dịch lọc của dịch nuôi cấy bằng cồn và được xác định đặc tính. SEC-MALLS ước tính Mw của uSPG vào khoảng 1 MDa. Khối lượng phân tử trung bình của schizophyllan từ quá trình lên men lỏng là khoảng 5 MDa, trong khi khi nuôi cấy ở trạng thái rắn, khối lượng phân tử có thể đạt tới 10 MDa. Khi so sánh khối lượng phân tử của schizophyllan được xử lý bằng siêu âm với khối lượng phân tử của schizophyllan tự nhiên chưa qua xử lý, có thể quan sát thấy khối lượng phân tử giảm từ 5 đến 10 lần nhờ xử lý bằng siêu âm.
Polysaccharide uSPG được xử lý bằng siêu âm chứa 0,7%w/w protein và 1,0%w/w cặn sau khi nung. Dịch thủy phân uSPG có thành phần glucose chiếm hơn 99%. Các kết quả phân tích cho thấy xử lý bằng siêu âm cắt ngẫu nhiên mạch chính β-glucan trong khi các nhánh bên vẫn nguyên vẹn, qua đó làm giảm kích thước và khối lượng phân tử của schizophyllan. Các nghiên cứu miễn dịch học trên uSPG về cơ bản không chứa protein và nội độc tố cho thấy schizophyllan có Mw thấp được xử lý bằng siêu âm có hoạt tính điều hòa miễn dịch rõ rệt.
Ảnh AFM (phía trên) và biên dạng địa hình bề mặt (phía dưới) của schizophyllan tự nhiên được xử lý bằng siêu âm. Phép đo ở chế độ bán tiếp xúc với độ phân giải 512 × 512 pxs2. Điều kiện: phủ vàng, hằng số lò xo 15,3 N/m, góc nón đầu dò <22°.
(hình ảnh và nghiên cứu: ©Smirnou và cộng sự, 2017)
Giảm độ nhớt: Xử lý bằng siêu âm làm giảm đáng kể độ nhớt của dịch nuôi cấy. Trong quá trình xử lý bằng siêu âm, độ nhớt của dịch nuôi cấy thay đổi phi tuyến: độ nhớt giảm nhanh khi bắt đầu xử lý bằng siêu âm, nhưng sau đó giảm chậm lại. Năng lượng đầu vào riêng 100 Ws/mL đủ để giảm độ nhớt của dịch nuôi cấy gần 7 lần.
Xử lý bằng siêu âm dịch nuôi cấy S.commune thu được bằng cách nuôi cấy nấm trong thiết bị phản ứng sinh học trong 144h. Ảnh hưởng của thời gian xử lý bằng siêu âm (biểu thị dưới dạng năng lượng đầu vào riêng tính bằng Ws/mL) đến tốc độ lọc sâu dịch nuôi cấy (cột màu đen) và nồng độ schizophyllan (SPG) trong dịch lọc (cột màu xám). Điều kiện xử lý bằng siêu âm: Thiết bị xử lý siêu âm UIP2000hd (20 kHz, 2000W), đầu siêu âm BS2d22, bộ tăng biên độ B2-1.4, biên độ 100%, lưu lượng 50 mL/s.
(hình ảnh và nghiên cứu: ©Smirnou và cộng sự, 2017)
Cải thiện quá trình lọc: Dịch nuôi cấy được xử lý bằng siêu âm chảy qua bộ lọc nhanh hơn dịch nuôi cấy chưa được xử lý (năng lượng đầu vào riêng 0 Ws/mL) chứa SPG có khối lượng phân tử cao. Ngoài ra, xử lý bằng siêu âm làm giảm đáng kể tổn thất sản phẩm trong quá trình lọc. Dịch lọc từ dịch nuôi cấy chưa được xử lý chứa SPG có khối lượng phân tử cao (năng lượng đầu vào riêng 0 Ws/mL) chứa 0,3 ± 0,07 g/L SPG, trong khi nồng độ SPG trước khi lọc sâu là 2 g/L. Ngược lại, dịch lọc từ dịch nuôi cấy được xử lý bằng siêu âm ở mức 100 Ws/mL chứa SPG ở nồng độ 2,2 ± 0,2 g/L, tương ứng với tổn thất sản phẩm gần như bằng không.
Xử lý bằng siêu âm dịch nuôi cấy S.commune thu được sau khi nuôi cấy nấm trong thiết bị phản ứng sinh học trong 144h. Ảnh hưởng của thời gian xử lý bằng siêu âm (biểu thị bằng năng lượng đầu vào riêng tính bằng Ws/mL) đến tốc độ lọc sâu dịch nuôi cấy (cột đen) và nồng độ schizophyllan (SPG) trong dịch lọc (cột xám). Điều kiện xử lý bằng siêu âm: Thiết bị xử lý siêu âm UIP2000hd (20 kHz, 2000W), đầu sonotrode BS2d22, bộ tăng biên độ B2-1.4, biên độ 100%, lưu lượng 50 mL/s.
(hình ảnh và nghiên cứu: ©Smirnou et al., 2017)
Ảnh AFM (phía trên) và biên dạng địa hình bề mặt (phía dưới) của schizophyllan đã được xử lý bằng siêu âm và biến tính. Phép đo ở chế độ bán tiếp xúc với độ phân giải 512 × 512 pxs2. Điều kiện: phủ vàng, hằng số lò xo 15,3 N/m, góc nón của đầu dò < 22°.
(hình ảnh và nghiên cứu: ©Smirnou et al., 2017)
Ngoài ra, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng quy trình xử lý schizophyllan bằng siêu âm dễ dàng mở rộng quy mô. Một thiết bị phân rã bằng siêu âm UIP2000hdT của hệ thống sản xuất thử nghiệm đã xử lý 1 lít dịch nuôi cấy trong 110 s ở chế độ dòng chảy. Có thể dễ dàng tăng năng suất của hệ thống bằng cách nối tiếp thêm các thiết bị siêu âm.
Đọc thêm về cách mở rộng quy mô chiết xuất nấm một cách đơn giản!
Thiết bị siêu âm hiệu suất cao để xử lý glucan từ nấm
Quá trình phân mảnh các polysaccharide như glucan cũng như các hợp chất có hoạt tính sinh học khác như chitin và chitosan có thể được thực hiện một cách đáng tin cậy bằng thiết bị siêu âm hiệu suất cao của Hielscher. Các thiết bị siêu âm của chúng tôi có thể tạo ra biên độ cao, cho phép kiểm soát chính xác các thông số quy trình và có thể vận hành 24/7 dưới tải nặng và trong môi trường khắc nghiệt. Dòng thiết bị của Hielscher Ultrasonics đáp ứng các yêu cầu này một cách đáng tin cậy. Bên cạnh hiệu suất siêu âm vượt trội, các thiết bị siêu âm Hielscher còn có hiệu suất năng lượng cao, mang lại lợi thế kinh tế đáng kể – đặc biệt khi được sử dụng trong sản xuất thương mại quy mô lớn.
Các thiết bị siêu âm Hielscher là những hệ thống hiệu suất cao có thể được trang bị các phụ kiện như đầu sonotrode, bộ tăng biên độ, thiết bị phản ứng hoặc buồng dòng chảy để đáp ứng tối ưu nhu cầu quy trình của bạn.
Với màn hình màu kỹ thuật số, tùy chọn cài đặt trước các chu trình xử lý bằng siêu âm, chức năng tự động ghi dữ liệu trên thẻ SD tích hợp, điều khiển từ xa qua trình duyệt và nhiều tính năng khác, khả năng kiểm soát quy trình và mức độ thân thiện với người dùng cao nhất được bảo đảm. Kết hợp với độ bền và khả năng chịu tải nặng, các hệ thống siêu âm Hielscher là thiết bị chủ lực đáng tin cậy của bạn trong sản xuất.
Việc giảm khối lượng phân tử của các β-glucan như schizophyllan đòi hỏi siêu âm công suất cao để đạt được sự phân cắt mong muốn và thu được sản phẩm schizophyllan cuối cùng có chất lượng cao, có thể được sử dụng cho các ứng dụng dược phẩm.
Tìm thêm thông tin về chiết xuất beta-glucan từ nấm bằng siêu âm, bao gồm hướng dẫn từng bước, tại đây!
Bảng dưới đây cho biết năng lực xử lý gần đúng của các thiết bị siêu âm của chúng tôi:
| Thể tích mẻ | Lưu lượng | Thiết bị được khuyến nghị |
|---|---|---|
| 1 đến 500mL | 10 đến 200mL/min | UP100H |
| 10 đến 2000mL | 20 đến 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 đến 20L | 0,2 đến 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 đến 100L | 2 đến 10L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 đến 100L/min | UIP16000 |
| n.a. | lớn hơn | cụm thiết bị UIP16000 |
Liên hệ với chúng tôi! / Đặt câu hỏi cho chúng tôi!
Hielscher Ultrasonics sản xuất các thiết bị đồng nhất hóa siêu âm hiệu suất cao cho các ứng dụng trộn, phân tán, nhũ hóa và chiết xuất ở quy mô phòng thí nghiệm, thí điểm và công nghiệp.
Tài liệu / Tài liệu tham khảo
- Smirnou, Dzianis; Knotek, Petr; Nesporova, Kristina; Smejkalova, Daniela; Pavlik, Vojtech; Franke, Lukas; Velebny, Vladimir (2017): Ultrasound-assisted production of highly-purified β-glucan schizophyllan and characterization of its immune properties. Process Biochemistry 2017.
- Zhong, Kui; Tong, Litao; Liu, Liya; Zhou, Xianrong; Liu, Xingxun; Zhang, Qi; Zhou, Sumei (2015): Immunoregulatory and antitumor activity of schizophyllan under ultrasonic treatment. International Journal of Biological Macromolecules, 80, 2015. 302–308.
- Kengo Tabata, Wataru Ito, Takemasa Kojima, Shozo Kawabata, Akira Misaki (1981): Ultrasonic degradation of schizophyllan, an antitumor polysaccharide produced by Schizophyllum commune fries. Carbohydrate Research, Volume 89, Issue 1, 1981. 121-135.
Những điều cần biết
Schizophyllan – Một β-glucan từ nấm
Schizophyllan, còn được gọi là sizofiran, SPG, sonifilan, sizofilan, là một polysaccharide ngoại bào trung tính do nấm Schizophyllum commune Fries, một loài nấm thuộc nhóm Basidiomycetes, tạo ra. Schizophyllan là một beta-D-glucan hòa tan có cơ chế tác dụng chính xác chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn, nhưng β-glucan đặc thù này cho thấy tác dụng điều hòa miễn dịch và chống khối u. Mặc dù cơ chế tác dụng chính xác của sizofiran vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn, tác nhân này dường như kích thích hệ miễn dịch bằng cách tăng sản xuất cytokine, hoạt hóa đại thực bào và tế bào Langerhans, đồng thời tăng cường hoạt động của bạch cầu đa nhân (PML) và tế bào diệt tự nhiên (NK). Sizofiran được ghi nhận là khá kém hiệu quả đối với ung thư dạ dày, nhưng kéo dài thời gian sống ở bệnh nhân ung thư đầu và cổ. Trong ung thư cổ tử cung, Sizofiran kéo dài thời gian sống và thời gian đến khi tái phát ở các trường hợp giai đoạn II nhưng không phải giai đoạn III, đồng thời cho thấy hiệu quả tăng thêm khi được tiêm trực tiếp vào khối u. Sonifilan được sử dụng làm chất điều biến đáp ứng sinh học (BRM) kết hợp với xạ trị để điều trị ung thư tại Nhật Bản. Thuốc được đưa ra thị trường để điều trị ung thư cổ tử cung tại Hàn Quốc vào năm 1998.
Hielscher Ultrasonics sản xuất các thiết bị đồng nhất hóa siêu âm hiệu suất cao từ quy mô phòng thí nghiệm đến quy mô công nghiệp.