Chuẩn bị mẫu thông lượng cao để chẩn đoán ty thể
Chẩn đoán ty thể trong nghiên cứu và phòng khám được thực hiện bằng các kỹ thuật khác nhau như giải trình tự, PCR và xét nghiệm sinh hóa. Những phương pháp này được sử dụng để xác định đột biến DNA và đo chức năng ty thể. Giải trình tự giúp phát hiện đột biến gen, trong khi PCR có thể định lượng trình tự DNA cụ thể. Xét nghiệm sinh hóa đánh giá chức năng của protein ty thể và enzyme.
Việc chẩn đoán các bệnh ty thể đặc biệt khó khăn do sự biến đổi lâm sàng rõ rệt của các bệnh này cũng như do sự tương tác phức tạp giữa hai bộ gen di truyền khác nhau: DNA ty thể (mtDNA) và bộ gen hạt nhân.
Trích xuất DNA và phân mảnh bằng cách sử dụng Sonication
Chiết xuất DNA từ mô cơ đặc biệt hữu ích khi nghi ngờ những thay đổi mô cụ thể trong mtDNA. Những thay đổi này có thể bao gồm xóa mtDNA trong liệt mắt ngoài tiến triển mạn tính (CPEO), đột biến điểm mtDNA trong bệnh cơ ty thể hoặc suy giảm mtDNA trong hội chứng Alpers. DNA chiết xuất từ mô cơ sau đó có thể được sử dụng cho các xét nghiệm di truyền khác nhau, chẳng hạn như PCR miền Nam và PCR tầm xa để xóa, PCR thời gian thực để suy giảm hoặc giải trình tự đột biến điểm.
Sonication, sử dụng sóng siêu âm cường độ cao, được áp dụng cho một số ứng dụng trong chẩn đoán ty thể. Nó được sử dụng để lyse các tế bào để trích xuất nội dung nội bào như ty thể và DNA, để cắt DNA như mtDNA và nDNA để giải trình tự và đồng nhất hóa các mẫu.
UIP400MTP Sonicator tấm để chuẩn bị mẫu thông lượng cao đồng đều sonicates mẫu trong các tấm đa giếng và 96 giếng
Làm thế nào để cô lập ty thể từ các tế bào và mô
Phân lập ty thể bao gồm hai bước thiết yếu: phá vỡ các tế bào để giải phóng nội dung của chúng và sử dụng ly tâm vi sai để tách và phục hồi các phân đoạn ty thể.
Sonication
Hielscher sonicators tương thích với bộ đệm ly giải tiêu chuẩn và bộ dụng cụ, làm cho chúng phù hợp để phân lập ty thể. Sonication phục vụ hai mục đích chính:
- Ly giải tế bào: Các sóng siêu âm phá vỡ màng tế bào, giải phóng nội dung nội bào.
- Sự gián đoạn ty thể: Sonication trong một bước tiếp theo có thể phá vỡ ty thể để giải phóng protein ty thể hoặc DNA ty thể.
- Phân mảnh mtDNA: Sonication là một kỹ thuật đáng tin cậy để cắt DNA ty thể để giải trình tự.
Máy sonicator tấm đa giếng UIP400MTP cho phép chuẩn bị mẫu thông lượng cao của các mẫu ty thể. Kết hợp với ly tâm vi sai, sonication tăng cường hiệu quả cách ly ty thể, đảm bảo năng suất cao của ty thể nguyên vẹn phù hợp cho các ứng dụng hạ nguồn khác nhau.
Hielscher UIP400MTP sonicator tấm đa giếng Hoạt động với bất kỳ tấm tiêu chuẩn
Máy sonicator tấm đa giếng UIP400MTP cung cấp nhiều lợi ích cho việc chuẩn bị mẫu thông lượng cao, ví dụ như trong chẩn đoán ty thể.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator để chuẩn bị mẫu thông lượng cao trong chẩn đoán dấu ấn sinh học.
Hướng dẫn mẫu mực cho siêu âm mtDNA phân mảnh
Chuẩn bị và chiết xuất:
- Chuột C57BL / 6 đã bị chết do trật khớp cổ tử cung.
- Gan nhanh chóng được chiết xuất và rửa sạch trong PBS vô trùng lạnh như băng.
Phân lập ty thể:
- Ty thể được phân lập bằng máy xay mô Dounce 2 ml và Bộ cách ly ty thể cho mô.
- Ly tâm ban đầu ở 700× g và 3.000× g.
- Thực hiện hai bước giặt bổ sung với bộ đệm C.
Phân lập DNA:
- Viên nén từ máy ly tâm đầu tiên ở 700× g được sử dụng để cô lập DNA hạt nhân (nDNA).
- DNA được phân lập bằng cách sử dụng các cột quay.
- DNA ty thể (mtDNA) được chiết xuất từ ty thể bị cô lập.
- DNA hạt nhân (nDNA) được chiết xuất từ chiết xuất hạt nhân thô, cả hai đều từ mô gan chuột.
Phân mảnh DNA:
- DNA được phân mảnh trên băng bằng cách sử dụng máy sonicator siêu âm 30 kHz / 50 W UP50H với sonotrode đầu siêu nhỏ 0,5 mm ở 14 μm trong 2 × 30 giây.
Trực quan hóa và định lượng phân mảnh:
- Sự phân mảnh sau khi siêu âm được hình dung trên gel agarose 1% với thuốc nhuộm DNA an toàn SYBR.
- Sự phong phú tương đối của mtDNA và nDNA được xác định bằng qPCR.
(xem Mariero và cộng sự, 2019)
Để chuẩn bị mẫu thông lượng cao, UIP400MTP sonicator tấm đa giếng tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuẩn bị số lượng mẫu lớn trong các tấm 96 giếng, đa giếng và microtiter tiêu chuẩn.
Đọc thêm về ưu điểm của việc chuẩn bị mẫu thông lượng cao bằng cách sử dụng UIP400MTP!
Mẹo để cách ly ty thể tối ưu bằng cách sử dụng sonication:
- Kiểm soát nhiệt độ: Tiến hành tất cả các bước ở phạm vi nhiệt độ từ 0 ° C đến 4 ° C. Điều này rất quan trọng để duy trì tính toàn vẹn và chức năng của ty thể.
- Hiệu quả và tốc độ: Làm việc nhanh chóng và làm sạch ty thể chỉ trong phạm vi cần thiết cho ứng dụng cụ thể của bạn. Thao tác quá mức có thể dẫn đến mất đáng kể nội dung ty thể.
- Pha loãng huyền phù: Duy trì nồng độ thấp của huyền phù tế bào và bào quan trong suốt quá trình cách ly. Điều này giúp giảm thiểu rủi ro bẫy và ngưng kết, do đó cải thiện độ tinh khiết của ty thể bị cô lập.
- Khối lượng mẫu: Lựa chọn nhiều chế phẩm quy mô nhỏ thay vì một chế phẩm lớn duy nhất. Cách tiếp cận này thường dẫn đến năng suất tốt hơn, vì việc mở rộng quy mô không làm tăng tỷ lệ thuận với lượng ty thể có thể phục hồi. Máy sonicator tấm đa giếng UIP400MTP tạo điều kiện cho việc ly giải tế bào nhanh chóng và đáng tin cậy để phân lập ty thể cũng như chiết xuất protein từ ty thể.
Những hướng dẫn này sẽ làm cho quá trình cô lập bằng cách sử dụng ly giải siêu âm và ly tâm hiệu quả hơn, mang lại các chế phẩm ty thể chất lượng cao phù hợp cho các ứng dụng hạ nguồn.
Hielscher Sonicators – Chất lượng Sản xuất tại Đức
Hielscher ultrasonicators nổi tiếng với chất lượng cao nhất và tiêu chuẩn thiết kế của họ. Mạnh mẽ và hoạt động dễ dàng cho phép tích hợp trơn tru của ultrasonicators của chúng tôi vào các cơ sở công nghiệp. Điều kiện khắc nghiệt và môi trường đòi hỏi dễ dàng được xử lý bởi Hielscher ultrasonicators.
Hielscher Ultrasonics là một công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt nhấn mạnh vào ultrasonicators hiệu suất cao có công nghệ tiên tiến và thân thiện với người dùng. Tất nhiên, Hielscher ultrasonicators là CE tuân thủ và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.
Sonicator tấm 96 giếng UIP400MTP cho sonication của tấm microtiter và multiwell
Văn học / Tài liệu tham khảo
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Câu hỏi thường gặp về ty thể và chẩn đoán ty thể
Ty thể là gì?
Ty thể là các bào quan liên kết màng được tìm thấy trong các tế bào của hầu hết các sinh vật nhân chuẩn. Chúng được gọi là cường quốc của tế bào vì chúng tạo ra năng lượng dưới dạng adenosine triphosphate (ATP) thông qua quá trình hô hấp tế bào. Ngoài ra, ty thể có DNA riêng và đóng vai trò quan trọng trong các quá trình tế bào khác, bao gồm điều chỉnh chu kỳ tế bào và chết tế bào.
Điều gì phân biệt mtDNA với DNA gen?
DNA ty thể (mtDNA) khác với DNA bộ gen (gDNA) theo một số cách chính. MtDNA nằm trong ty thể, có hình tròn và được di truyền từ mẹ, trong khi gDNA nằm trong nhân tế bào, tuyến tính và được thừa hưởng từ cả bố và mẹ. MtDNA nhỏ hơn nhiều, chỉ mã hóa 37 gen, trong khi gDNA chứa khoảng 20.000-25.000 gen. MtDNA có mặt trong nhiều bản sao trên mỗi tế bào, có tỷ lệ đột biến cao hơn và chủ yếu mã hóa cho các protein liên quan đến chức năng ty thể. Ngược lại, gDNA thường là lưỡng bội, có tỷ lệ đột biến thấp hơn và mã hóa một loạt các gen cần thiết cho sự phát triển và chức năng của sinh vật. Ngoài ra, phiên mã và dịch mã mtDNA xảy ra trong ty thể, trong khi phiên mã gDNA xảy ra trong nhân và dịch mã xảy ra trong tế bào chất. Những khác biệt này phản ánh vai trò riêng biệt và nguồn gốc tiến hóa của chúng.
Cell-Free Extract là gì?
Chiết xuất không có tế bào là một giải pháp chứa nội dung của các tế bào bị phân ly, bao gồm protein, axit nucleic và các thành phần tế bào khác, nhưng không có màng tế bào nguyên vẹn. Chiết xuất này được sử dụng trong nghiên cứu sinh hóa và sinh học phân tử để nghiên cứu các quá trình tế bào in vitro, cho phép các nhà nghiên cứu phân tích các phản ứng và cơ chế bên ngoài tế bào sống.
Xét nghiệm PCR đóng vai trò gì trong chẩn đoán ty thể?
Xét nghiệm PCR đóng một vai trò quan trọng trong chẩn đoán ty thể bằng cách cho phép phát hiện đột biến, xóa hoặc biến thể số bản sao trong DNA ty thể (mtDNA). Chúng cho phép khuếch đại các vùng mtDNA cụ thể để xác định các biến thể gây bệnh liên quan đến rối loạn ty thể. Các kỹ thuật dựa trên PCR, chẳng hạn như PCR định lượng (qPCR) và PCR tầm xa, cũng được sử dụng để đánh giá tính toàn vẹn của mtDNA, mức độ dị chất và sự cạn kiệt mtDNA, cung cấp thông tin chi tiết cần thiết về chức năng ty thể và bệnh tật.
Tìm hiểu cách Máy siêu âm tấm siêu âm UIP400MTP tạo điều kiện thuận lợi cho các xét nghiệm và xét nghiệm PCR!
Ly tâm vi sai là gì?
Ly tâm vi sai là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để phân đoạn tế bào và phân lập ty thể. Phương pháp này tách cấu trúc tế bào dựa trên hệ số lắng đọng của chúng, phụ thuộc vào cả mật độ và hình dạng. Quá trình này liên quan đến việc áp dụng các mức lực ly tâm khác nhau cho các mẫu trong dung dịch muối đệm với mật độ cụ thể. Các cấu trúc có hệ số lắng tương tự sẽ lắng xuống đáy ống thu gom cùng một lúc, cho phép phục hồi chúng.
Máy ly tâm vi sai được sử dụng như thế nào để phân lập ty thể?
Ly tâm vi sai cho phép các nhà nghiên cứu tách hiệu quả các phân số ty thể khỏi các thành phần tế bào khác. Phân lập ty thể bao gồm một số bước ly tâm và sự phục hồi tiếp theo của phân lập.
Ly tâm ban đầu: Áp dụng một lực ly tâm thấp để lắng đọng các mảnh vụn và hạt nhân tế bào lớn.
Các lần ly tâm tiếp theo: Tăng lực ly tâm từng bước đến các phần viên được làm giàu với ty thể. Mỗi bước ly tâm loại bỏ các cấu trúc có hệ số lắng cao dần dần.
Phục hồi phân số: Sau mỗi lần ly tâm, viên được thu thập và supernatant phải chịu lực g cao hơn để cô lập phần tiếp theo. Điều này được lặp lại cho đến khi đạt được độ tinh khiết mong muốn của ty thể.