Chuẩn bị mẫu thông lượng cao cho chẩn đoán ty thể
Chẩn đoán ty thể trong nghiên cứu và lâm sàng được thực hiện bằng nhiều kỹ thuật khác nhau như giải trình tự, PCR và các xét nghiệm sinh hóa. Các phương pháp này được sử dụng để xác định đột biến DNA và đo lường chức năng ty thể. Giải trình tự giúp phát hiện các đột biến di truyền, trong khi PCR có thể định lượng các trình tự DNA cụ thể. Các xét nghiệm sinh hóa đánh giá hoạt tính của các protein và enzyme ty thể.
Việc chẩn đoán các bệnh ty thể đặc biệt khó khăn do biểu hiện lâm sàng của những bệnh này rất đa dạng, cũng như do sự tương tác phức tạp giữa hai bộ gen có phương thức di truyền khác nhau: DNA ty thể (mtDNA) và bộ gen nhân.
Chiết xuất và phân mảnh DNA bằng siêu âm
Chiết xuất DNA từ mô cơ đặc biệt hữu ích khi nghi ngờ có những thay đổi mtDNA đặc hiệu theo mô. Những thay đổi này có thể bao gồm mất đoạn mtDNA trong bệnh liệt vận nhãn ngoài tiến triển mạn tính (CPEO), đột biến điểm mtDNA trong các bệnh cơ ty thể hoặc suy giảm lượng mtDNA trong hội chứng Alpers. DNA được chiết xuất từ mô cơ sau đó có thể được sử dụng cho nhiều xét nghiệm di truyền khác nhau, chẳng hạn như Southern blot và PCR đoạn dài để phát hiện mất đoạn, PCR thời gian thực để xác định sự suy giảm lượng mtDNA hoặc giải trình tự để phát hiện đột biến điểm.
Xử lý bằng siêu âm, sử dụng sóng siêu âm cường độ cao, được áp dụng trong một số ứng dụng chẩn đoán ty thể. Kỹ thuật này được sử dụng để ly giải tế bào nhằm chiết xuất các thành phần nội bào như ty thể và DNA, cắt DNA như mtDNA và nDNA bằng lực cắt để giải trình tự, và đồng nhất hóa mẫu.
Máy siêu âm đĩa UIP400MTP để chuẩn bị mẫu thông lượng cao xử lý đồng đều các mẫu bằng siêu âm trong đĩa nhiều giếng và đĩa 96 giếng
Cách phân lập ty thể từ tế bào và mô
Phân lập ty thể gồm hai bước thiết yếu: phá vỡ tế bào để giải phóng các thành phần bên trong và sử dụng ly tâm vi sai để tách và thu hồi các phân đoạn ty thể.
Xử lý bằng siêu âm
Các máy siêu âm Hielscher tương thích với các dung dịch đệm và bộ kit ly giải tiêu chuẩn, nên phù hợp để phân lập ty thể. Xử lý bằng siêu âm phục vụ hai mục đích chính:
- Ly giải tế bào: Sóng siêu âm phá vỡ màng tế bào, giải phóng các thành phần nội bào.
- Phá vỡ ty thể: Xử lý bằng siêu âm ở bước tiếp theo có thể phá vỡ ty thể để giải phóng protein ty thể hoặc DNA ty thể.
- Phân mảnh mtDNA: Xử lý bằng siêu âm là một kỹ thuật đáng tin cậy để cắt DNA ty thể bằng lực cắt phục vụ giải trình tự.
Máy siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP cho phép chuẩn bị các mẫu ty thể với thông lượng cao. Khi kết hợp với ly tâm vi sai, xử lý bằng siêu âm nâng cao hiệu quả phân lập ty thể, đảm bảo thu được lượng lớn ty thể nguyên vẹn phù hợp cho nhiều ứng dụng tiếp theo.
Máy siêu âm đĩa nhiều giếng Hielscher UIP400MTP hoạt động với mọi đĩa tiêu chuẩn
Máy siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP mang lại nhiều lợi ích cho việc chuẩn bị mẫu thông lượng cao, ví dụ như trong chẩn đoán ty thể.
Máy siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP để chuẩn bị mẫu thông lượng cao trong chẩn đoán bằng dấu ấn sinh học.
Hướng dẫn minh họa về phân mảnh mtDNA bằng siêu âm
Chuẩn bị và chiết xuất:
- Chuột C57BL/6 được giết bằng phương pháp làm trật đốt sống cổ.
- Gan được nhanh chóng lấy ra và rửa trong PBS vô trùng lạnh như nước đá.
Phân lập ty thể:
- Ty thể được phân lập bằng dụng cụ nghiền mô Dounce 2-mL và bộ kit phân lập ty thể từ mô.
- Ly tâm ban đầu ở 700× g và 3.000× g.
- Thực hiện thêm hai bước rửa bằng dung dịch đệm C.
Phân lập DNA:
- Phần cặn từ lần ly tâm đầu tiên ở 700× g được sử dụng để phân lập DNA nhân (nDNA).
- DNA được phân lập bằng cột ly tâm.
- DNA ty thể (mtDNA) được chiết xuất từ ty thể đã phân lập.
- DNA nhân (nDNA) được chiết xuất từ dịch chiết nhân thô, cả hai đều từ mô gan chuột.
Phân mảnh DNA:
- DNA được phân mảnh trên đá bằng máy siêu âm UP50H 30-kHz/50-W với đầu phát siêu âm dạng đầu nhỏ 0,5-mm ở mức 14 μm trong 2 × 30 giây.
Quan sát và định lượng sự phân mảnh:
- Sự phân mảnh sau khi xử lý siêu âm được quan sát trên gel agarose 1% với thuốc nhuộm DNA SYBR safe.
- Hàm lượng tương đối của mtDNA và nDNA được xác định bằng qPCR.
(cf. Mariero et al., 2019)
Để chuẩn bị mẫu với thông lượng cao, máy siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP giúp chuẩn bị số lượng lớn mẫu trong các đĩa 96 giếng, đĩa nhiều giếng và đĩa vi chuẩn tiêu chuẩn.
Đọc thêm về những ưu điểm của việc chuẩn bị mẫu với thông lượng cao bằng UIP400MTP!
Các mẹo giúp tối ưu hóa việc phân lập ty thể bằng siêu âm:
- Kiểm soát nhiệt độ: Thực hiện tất cả các bước trong khoảng nhiệt độ từ 0°C đến 4°C. Điều này rất quan trọng để duy trì tính toàn vẹn và chức năng của ty thể.
- Hiệu quả và tốc độ: Thao tác nhanh chóng và chỉ tinh sạch ty thể đến mức cần thiết cho ứng dụng cụ thể của bạn. Thao tác quá nhiều có thể dẫn đến thất thoát đáng kể các thành phần của ty thể.
- Pha loãng huyền phù: Duy trì nồng độ thấp của huyền phù tế bào và bào quan trong suốt quá trình phân lập. Điều này giúp giảm thiểu nguy cơ bị giữ kẹt và ngưng kết, qua đó cải thiện độ tinh sạch của ty thể được phân lập.
- Thể tích mẫu: Chọn chuẩn bị nhiều mẻ quy mô nhỏ thay vì một mẻ quy mô lớn. Cách tiếp cận này thường mang lại hiệu suất thu hồi tốt hơn, vì việc tăng quy mô không làm tăng lượng ty thể có thể thu hồi theo tỷ lệ tương ứng. Máy siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP hỗ trợ ly giải tế bào nhanh chóng và đáng tin cậy để phân lập ty thể cũng như chiết xuất protein từ ty thể.
Những hướng dẫn này sẽ giúp quá trình phân lập bằng ly giải siêu âm và ly tâm hiệu quả hơn, thu được các chế phẩm ty thể chất lượng cao phù hợp cho các ứng dụng tiếp theo.
Máy siêu âm Hielscher – Chất lượng sản xuất tại Đức
Máy siêu âm Hielscher nổi tiếng với các tiêu chuẩn cao nhất về chất lượng và thiết kế. Độ bền và khả năng vận hành dễ dàng cho phép tích hợp thuận lợi các máy siêu âm của chúng tôi vào cơ sở công nghiệp. Máy siêu âm Hielscher dễ dàng đáp ứng các điều kiện khắc nghiệt và môi trường có yêu cầu cao.
Hielscher Ultrasonics là công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt chú trọng đến các máy siêu âm hiệu năng cao có công nghệ tiên tiến nhất và thân thiện với người dùng. Tất nhiên, máy siêu âm Hielscher tuân thủ CE và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.
Máy siêu âm đĩa 96 giếng UIP400MTP để xử lý siêu âm các đĩa vi chuẩn và đĩa nhiều giếng
Tài liệu / Tài liệu tham khảo
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Các câu hỏi thường gặp về ty thể và chẩn đoán ty thể
Ty thể là gì?
Ty thể là các bào quan có màng bao bọc, có trong tế bào của hầu hết các sinh vật nhân thực. Chúng được biết đến là những nhà máy năng lượng của tế bào vì chúng tạo ra năng lượng dưới dạng adenosine triphosphate (ATP) thông qua quá trình hô hấp tế bào. Ngoài ra, ty thể có DNA riêng và đóng vai trò then chốt trong các quá trình tế bào khác, bao gồm điều hòa chu kỳ tế bào và sự chết tế bào.
Điều gì phân biệt mtDNA với DNA hệ gen?
DNA ty thể (mtDNA) khác với DNA hệ gen (gDNA) ở một số điểm then chốt. MtDNA nằm trong ty thể, có dạng vòng và được di truyền theo dòng mẹ, trong khi gDNA nằm trong nhân tế bào, có dạng thẳng và được di truyền từ cả bố lẫn mẹ. MtDNA nhỏ hơn nhiều, chỉ mã hóa 37 gen, trong khi gDNA chứa khoảng 20.000–25.000 gen. MtDNA tồn tại dưới dạng nhiều bản sao trong mỗi tế bào, có tỷ lệ đột biến cao hơn và chủ yếu mã hóa các protein tham gia vào chức năng của ty thể. Ngược lại, gDNA thường ở trạng thái lưỡng bội, có tỷ lệ đột biến thấp hơn và mã hóa một tập hợp rất lớn các gen cần thiết cho sự phát triển và hoạt động của sinh vật. Ngoài ra, quá trình phiên mã và dịch mã mtDNA diễn ra trong ty thể, trong khi quá trình phiên mã gDNA diễn ra trong nhân và quá trình dịch mã diễn ra trong tế bào chất. Những khác biệt này phản ánh vai trò và nguồn gốc tiến hóa riêng biệt của chúng.
Dịch chiết không tế bào là gì?
Dịch chiết không tế bào là dung dịch chứa các thành phần bên trong tế bào đã được ly giải, bao gồm protein, axit nucleic và các thành phần tế bào khác, nhưng không có màng tế bào nguyên vẹn. Dịch chiết này được sử dụng trong nghiên cứu hóa sinh và sinh học phân tử để nghiên cứu các quá trình tế bào trong điều kiện in vitro, cho phép các nhà nghiên cứu phân tích các phản ứng và cơ chế bên ngoài tế bào sống.
Các xét nghiệm PCR đóng vai trò gì trong chẩn đoán bệnh ty thể?
Các xét nghiệm PCR đóng vai trò thiết yếu trong chẩn đoán bệnh ty thể nhờ cho phép phát hiện các đột biến, mất đoạn hoặc biến đổi số lượng bản sao trong DNA ty thể (mtDNA). Các xét nghiệm này cho phép khuếch đại các vùng mtDNA cụ thể để xác định các biến thể gây bệnh liên quan đến các rối loạn ty thể. Các kỹ thuật dựa trên PCR, chẳng hạn như PCR định lượng (qPCR) và PCR đoạn dài, cũng được sử dụng để đánh giá tính toàn vẹn của mtDNA, mức độ dị thể ty thể và sự suy giảm mtDNA, cung cấp những hiểu biết thiết yếu về chức năng và bệnh lý ty thể.
Tìm hiểu cách máy siêu âm đĩa vi thể UIP400MTP hỗ trợ các xét nghiệm và phép thử PCR!
Ly tâm phân đoạn là gì?
Ly tâm phân đoạn là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để phân tách các thành phần tế bào và phân lập ty thể. Phương pháp này phân tách các cấu trúc tế bào dựa trên hệ số lắng của chúng, vốn phụ thuộc vào cả khối lượng riêng và hình dạng. Quá trình này bao gồm việc áp dụng các mức lực ly tâm khác nhau lên các mẫu trong dung dịch muối đệm có khối lượng riêng cụ thể. Các cấu trúc có hệ số lắng tương tự nhau sẽ lắng xuống đáy ống thu mẫu cùng lúc, cho phép thu hồi chúng.
Ly tâm phân đoạn được sử dụng như thế nào để phân lập ty thể?
Ly tâm phân đoạn cho phép các nhà nghiên cứu tách hiệu quả các phân đoạn ty thể khỏi các thành phần tế bào khác. Việc phân lập ty thể bao gồm một số bước ly tâm và sau đó thu hồi phần đã phân lập.
Ly tâm ban đầu: Áp dụng lực ly tâm thấp để làm lắng các mảnh vụn tế bào lớn và nhân tế bào.
Các lần ly tâm tiếp theo: Tăng lực ly tâm từng bước để tạo cặn từ các phân đoạn giàu ty thể. Mỗi bước ly tâm loại bỏ các cấu trúc có hệ số lắng cao dần.
Thu hồi phân đoạn: Sau mỗi lần ly tâm, thu lấy cặn và cho dịch nổi chịu lực g cao hơn để phân lập phân đoạn tiếp theo. Lặp lại quy trình này cho đến khi đạt được độ tinh sạch ty thể mong muốn.