Alg Hücrelerinin Parçalanmasını ve Ekstraksiyonunu İyileştirmek İçin Ultrasonikasyon

Algler, makroalgler ve mikroalgler, besleyici gıdalar, gıda katkı maddeleri, yakıt veya yakıt hammaddesi olarak kullanılan birçok değerli bileşik içerir. Hedef maddelerin alg hücresinden açığa çıkarılması için güçlü ve verimli bir hücre parçalama tekniği gerekir. Ultrasonik ekstraktörler, bitkilerden, alglerden ve mantarlardan biyoaktif bileşiklerin ekstraksiyonunda son derece verimli ve güvenilirdir. Laboratuvar, tezgâh üstü ve endüstriyel ölçeklerde sunulan Hielscher ultrasonik ekstraktörleri, gıda, ilaç ve biyoyakıt üretiminde hücre kaynaklı ekstraktların üretilmesinde yerleşik bir konuma sahiptir.

Beslenme ve Yakıt İçin Değerli Bir Kaynak Olarak Algler

Alg hücreleri, proteinler, karbonhidratlar, lipitler ve diğer biyoaktif maddelerin yanı sıra alkanlar gibi biyoaktif ve enerji bakımından zengin bileşikler için çok yönlü bir kaynaktır. Bu özellik, algleri hem gıda ve besleyici bileşikler hem de yakıtlar için bir kaynak hâline getirir.
Mikroalgler, beslenmede ve biyoyakıtlar (ör. biyodizel) için hammadde olarak kullanılan lipitlerin değerli bir kaynağıdır. Dicrateria rotunda gibi deniz fitoplanktonu Dicrateria suşları, C₁₀H₂₂ ile C₃₈H₇₈ arasında bir dizi doymuş hidrokarbon (n-alkan) sentezleyebilen, benzin üreten algler olarak bilinir; bu hidrokarbonlar benzin (C10–C15), motorin (C16–C20) ve fuel oil (C21–C38) olarak sınıflandırılır.
Besin değerleri nedeniyle algler, “fonksiyonel gıdalar” veya “nutrasötikler” olarak kullanılır. Alglerden ekstrakte edilen önemli mikrobesinler arasında karotenoidlerden astaksantin, fukoksantin ve zeaksantin yer alır; fukoidan, laminari ve diğer glukanlar, çok sayıda başka biyoaktif maddeyle birlikte besin takviyesi ve ilaç olarak kullanılır. Karragenan, aljinat ve diğer hidrokolloidler gıda katkı maddesi olarak kullanılır. Alg lipitleri vegan omega-3 kaynağı olarak kullanılır; ayrıca yakıt olarak veya biyodizel üretiminde hammadde olarak da kullanılır.

Güç Ultrasonuyla Alg Hücrelerinin Parçalanması ve Ekstraksiyonu

Ultrasonik ekstraktörler veya kısaca sonikatörler, laboratuvarda küçük numunelerden değerli bileşiklerin ekstraksiyonu için ve büyük ticari ölçekte üretim için kullanılır.
Alg hücreleri, lipitler, selüloz, proteinler, glikoproteinler ve polisakkaritlerden oluşan karmaşık hücre duvarı matrisleriyle korunur. Çoğu alg hücre duvarının temelini, jel benzeri bir protein matrisi içindeki mikrofibriler ağ oluşturur; ancak bazı mikroalgler, opalin silika frustüllerinden veya kalsiyum karbonattan oluşan inorganik, sert bir duvara sahiptir. Alg biyokütlesinden biyoaktif bileşikler elde etmek için verimli bir hücre parçalama tekniği gereklidir. Teknolojik ekstraksiyon faktörlerinin (yani ekstraksiyon yöntemi ve ekipmanının) yanı sıra, alg hücrelerinin parçalanmasının ve ekstraksiyonun verimliliği; hücre duvarının bileşimi, istenen biyomolekülün mikroalg hücrelerindeki konumu ve hasat sırasında mikroalglerin büyüme evresi gibi alglere bağlı çeşitli faktörlerden de güçlü biçimde etkilenir.

Ultrasonik Alg Hücresi Parçalama ve Ekstraksiyonu Nasıl İşler?

Yüksek yoğunluklu ultrason dalgaları, ultrasonik bir prob (ultrasonik horn veya sonotrot olarak da bilinir) aracılığıyla bir sıvıya veya bulamaca aktarıldığında, ses dalgaları sıvı içinde ilerler ve böylece dönüşümlü yüksek basınç / düşük basınç döngüleri oluşturur. Bu yüksek basınç / düşük basınç döngüleri sırasında çok küçük vakum kabarcıkları veya boşluklar oluşur. Kavitasyon kabarcıkları, düşük basınç döngüleri sırasında yerel basıncın, belirli bir sıcaklıkta sıvının çekme dayanımı tarafından belirlenen bir değer olan doymuş buhar basıncının yeterince altına düşmesiyle oluşur. Bu kabarcıklar birkaç döngü boyunca büyür. Bu vakum kabarcıkları daha fazla enerji soğuramayacakları bir boyuta ulaştığında, kabarcık yüksek basınç döngüsü sırasında şiddetle içe çöker. Kavitasyon kabarcıklarının içe çökmesi, sıvıda yoğun şok dalgaları, türbülanslar ve mikrojetler oluşturan, şiddetli ve enerji yoğun bir süreçtir. Ayrıca yerel olarak çok yüksek basınçlar ve çok yüksek sıcaklıklar oluşur. Bu aşırı koşullar, hücre duvarlarını ve zarlarını kolaylıkla parçalayabilir ve hücre içi bileşikleri etkili, etkin ve hızlı bir şekilde açığa çıkarabilir. Böylece proteinler, polisakkaritler, lipitler, vitaminler, mineraller ve antioksidanlar gibi hücre içi bileşikler, güç ultrasonu kullanılarak etkili biçimde ekstrakte edilebilir.

Hücre Parçalama ve Ekstraksiyon İçin Ultrasonik Kavitasyon

Yoğun ultrasonik enerjiye maruz kaldığında, her tür hücrenin (bitki, memeli, alg, mantar, bakteri hücreleri vb. dâhil) duvarı veya zarı parçalanır ve hücre, enerji yoğun ultrasonik kavitasyonun mekanik kuvvetleriyle daha küçük parçalara ayrılır. Hücre duvarı kırıldığında, protein, lipit, nükleik asit ve klorofil gibi hücresel metabolitler hem hücre duvarı matrisinden hem de hücrenin içinden açığa çıkar ve çevredeki kültür ortamına veya çözücüye aktarılır.
Yukarıda açıklanan ultrasonik / akustik kavitasyon mekanizması, bütün alg hücrelerini veya hücrelerin içindeki gaz ve sıvı vakuollerini ciddi biçimde parçalar. Ultrasonik kavitasyon, titreşim, türbülanslar ve mikroakışlar, hücrenin içi ile çevredeki çözücü arasındaki kütle transferini destekleyerek biyomoleküllerin (yani metabolitlerin) verimli ve hızlı biçimde açığa çıkmasını sağlar. Çünkü sonikasyon, sert, toksik ve/veya pahalı kimyasallar gerektirmeyen, tamamen mekanik bir işlemdir.
Yüksek yoğunluklu, düşük frekanslı ultrason, yüksek basınçlar, sıcaklıklar ve yüksek kesme kuvvetleri içeren, aşırı derecede enerji yoğun koşullar oluşturur. Bu fiziksel kuvvetler, hücre içi bileşiklerin ortama salınması için hücre yapılarının parçalanmasını destekler. Bu nedenle düşük frekanslı ultrason, alglerden biyoaktif maddelerin ve yakıtların ekstraksiyonunda yaygın olarak kullanılır. Çözücü ekstraksiyonu, boncuklu değirmende öğütme veya yüksek basınçlı homojenizasyon gibi geleneksel ekstraksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında ultrasonik ekstraksiyon, sonoporasyona uğramış ve parçalanmış hücreden biyoaktif bileşiklerin (lipitler, proteinler, polisakkaritler ve mikrobesinler gibi) çoğunu açığa çıkarmasıyla üstünlük gösterir. Doğru işlem koşulları uygulandığında ultrasonik ekstraksiyon, çok kısa bir işlem süresinde üstün ekstraksiyon verimleri sağlar. Örneğin yüksek performanslı ultrasonik ekstraktörler, uygun bir çözücüyle kullanıldığında alglerden ekstraksiyonda mükemmel performans gösterir. Asidik veya alkali bir ortamda alg hücre duvarı gözenekli ve buruşuk hâle gelir; bu da kısa bir sonikasyon süresinde (3 saatten az), düşük sıcaklıkta (60°C altında) daha yüksek verimler elde edilmesini sağlar. Ilımlı sıcaklıklardaki kısa ekstraksiyon süresi, fukoidanın bozunmasını önler ve böylece yüksek derecede biyoaktif bir polisakkarit elde edilir.
Ultrasonikasyon ayrıca yüksek molekül ağırlıklı fukoidanı, dalları giderilmiş yapısı nedeniyle belirgin biçimde daha biyoaktif olan düşük molekül ağırlıklı fukoidana dönüştürmek için bir yöntemdir. Yüksek biyoaktivitesi ve biyolojik erişilebilirliğiyle düşük molekül ağırlıklı fukoidan, ilaçlar ve ilaç taşıma sistemleri için ilgi çekici bir bileşiktir.

Vaka Çalışmaları: Alg Bileşiklerinin Ultrasonik Ekstraksiyonu

Ultrasonik ekstraksiyon verimliliği ve ultrasonik ekstraksiyon parametrelerinin optimizasyonu kapsamlı biçimde incelenmiştir. Aşağıda, çeşitli alg türlerinden ultrasonikasyon yoluyla ekstraksiyona ilişkin örnek sonuçları bulabilirsiniz.

Mano-Termo-Sonikasyon Kullanılarak Spirulinadan Protein Ekstraksiyonu

Prof. Chemat’ın (Avignon Üniversitesi) araştırma grubu, manotermosonikasyonun (MTS), kuru Arthrospira platensis siyanobakterilerinden (spirulina olarak da bilinir) proteinlerin (fikosiyanin gibi) ekstraksiyonu üzerindeki etkilerini araştırmıştır. Mano-Termo-Sonikasyon (MTS), ultrasonik ekstraksiyon sürecini yoğunlaştırmak amacıyla ultrasonun artırılmış basınç ve sıcaklıklarla birlikte uygulanmasıdır.
“Deneysel sonuçlara göre MTS, kütle transferini desteklemiş (yüksek etkin difüzivite, De) ve ultrason kullanılmayan geleneksel sürece (8,63 ± 1,15 g/100 g DW) kıyasla %229 daha fazla protein (28,42 ± 1,15 g/100 g DW) elde edilmesini sağlamıştır. Ekstraktta her 100 g kuru spirulina biyokütlesi başına 28,42 g proteinle, sürekli bir MTS süreci kullanılarak 6 etkin dakikada %50 protein geri kazanım oranına ulaşılmıştır. Mikroskobik gözlemler, akustik kavitasyonun spirulina filamentlerini parçalanma, sonoporasyon ve doku yapısının bozulması gibi farklı mekanizmalarla etkilediğini göstermiştir. Bu çeşitli olgular, spirulina biyoaktif bileşiklerinin ekstraksiyonunu, açığa çıkmasını ve çözünür hâle gelmesini kolaylaştırmaktadır.” [Vernès et al., 2019]

Zaman içinde MTS işlemine tabi tutulan bütün spirulina filamentlerinin optik mikroskopi görüntüleri. Tüm görüntüler için ölçek çubuğu (görüntü A) = 50 μm.
görüntü ve çalışma: ©Vernès et al. 2019

Ultrasonik Fukoidan ve Glukan Ekstraksiyonunun Kaynağı: Laminaria digitata

Dr. Tiwari’nin TEAGASC araştırma grubu, makroalg Laminaria digitata’dan polisakkaritlerin, yani fukoidan, laminarin ve toplam glukanların ekstraksiyonunu UIP500hdT sonikatörünü kullanarak araştırmıştır. İncelenen ultrason destekli ekstraksiyon (UAE) parametreleri, fukoz, FRAP ve DPPH düzeyleri üzerinde önemli bir etki göstermiştir. Çözücü olarak 0,1 M HCl kullanılarak optimize edilmiş sıcaklık (76◦C), süre (10 min) ve ultrasonik genlik (%100) koşullarında fukoz, toplam glukanlar, FRAP ve DPPH için sırasıyla 1060,75 mg/100 g ds, 968,57 mg/100 g ds, 8,70 μM trolox/mg fde ve %11,02 düzeyleri elde edilmiştir. Açıklanan UAE koşulları daha sonra polisakkarit bakımından zengin ekstraktlar elde etmek için ekonomik açıdan önemli diğer kahverengi makroalglere (L. hyperborea ve A. nodosum) başarıyla uygulanmıştır. Bu çalışma, çeşitli makroalg türlerinden biyoaktif polisakkaritlerin ekstraksiyonunu geliştirmek için UAE’nin uygulanabilirliğini göstermektedir.

Ultrasonik Fitokimyasal Ekstraksiyonunun Kaynakları: F. vesiculosus ve P. canaliculata

García-Vaquero’nun araştırma ekibi, kahverengi mikroalg türleri Fucus vesiculosus ve Pelvetia canaliculata’dan ekstraksiyonun verimliliğini değerlendirmek amacıyla yüksek performanslı ultrasonik ekstraksiyon, ultrason-mikrodalga ekstraksiyonu, mikrodalga ekstraksiyonu, hidrotermal destekli ekstraksiyon ve yüksek basınç destekli ekstraksiyon dâhil çeşitli yeni ekstraksiyon tekniklerini karşılaştırmıştır. Ultrasonikasyon için Hielscher UIP500hdT ultrasonik ekstraktörünü kullanmışlardır. Ekstraksiyon verimlerinin analizi, ultrasonik ekstraksiyonun her iki F. vesiculosus’tan çoğu fitokimyasal için en yüksek verimleri sağladığını ortaya koymuştur. Buna göre, F. vesiculosus’tan UIP500hdT ultrasonik ekstraktörü kullanılarak ekstrakte edilen bileşikler için en yüksek verimler şunlardır: toplam fenolik içerik (445,0 ± 4,6 mg gallik asit eşdeğeri/g), toplam florotanen içeriği (362,9 ± 3,7 mg floroglusinol eşdeğeri/g), toplam flavonoid içeriği (286,3 ± 7,8 mg kuersetin eşdeğeri/g) ve toplam tanen içeriği (189,1 ± 4,4 mg kateşin eşdeğeri/g).
Araştırma çalışmalarında ekip, ultrason destekli ekstraksiyon kullanımının “ekstraksiyon çözücüsü olarak %50 etanollü çözeltiyle birleştirildiğinde, hem F. vesiculosus hem de P. canaliculata’dan istenmeyen karbonhidratların birlikte ekstraksiyonunu azaltırken TPC, TPhC, TFC ve TTC’nin ekstraksiyonunu hedefleyen umut verici bir strateji olabileceği ve bu bileşikler ilaç, nutrasötik ve kozmesötik olarak kullanıldığında umut verici uygulamalar sunabileceği” sonucuna varmıştır. [García-Vaquero et al., 2021]

Avignon Üniversitesi’nde Hielscher sonikatörleri kullanılarak mano-termo-sonikasyonun ölçek büyütmesi: laboratuvar ekipmanı UIP1000hdT (A) ile pilot ölçekli ekipman UIP4000hdT (B, C ve D) arasındaki geçiş. D görüntüsünde enine kesiti şematik olarak gösterilen ultrasonik akış hücresi: FC100K.
görüntü ve çalışma: ©Vernès et al. 2019

Alglerin Parçalanması İçin Yüksek Performanslı Ultrasonik Ekstraktörler

Hielscher’in en ileri teknolojiye sahip ultrasonik ekipmanları, genlik, sıcaklık, basınç ve enerji girdisi gibi işlem parametreleri üzerinde tam kontrol sağlar.
Ultrasonik ekstraksiyonda, en iyi sonuçlar için hammadde parçacık boyutu, çözücü türü, katı/çözücü oranı ve ekstraksiyon süresi gibi parametreler değiştirilebilir ve optimize edilebilir.
Ultrasonik ekstraksiyon termal olmayan bir ekstraksiyon yöntemi olduğundan, algler gibi hammaddelerde bulunan biyoaktif bileşenlerin termal bozunması önlenir.
Genel olarak yüksek verim, kısa ekstraksiyon süresi, düşük ekstraksiyon sıcaklığı ve az miktarda çözücü gibi avantajlar, sonikasyonu üstün ekstraksiyon yöntemi hâline getirir.

Ultrasonik Ekstraksiyon: Laboratuvarda ve Endüstride Yerleşik Bir Yöntem

Ultrasonik ekstraksiyon, bitkilerden, alglerden, bakterilerden ve memeli hücrelerinden her türlü biyoaktif bileşiğin ekstraksiyonu için yaygın olarak uygulanır. Ultrasonik ekstraksiyon, daha yüksek ekstraksiyon verimleri ve daha kısa işlem süresiyle diğer geleneksel ekstraksiyon tekniklerinden üstün olan, basit, uygun maliyetli ve son derece verimli bir yöntem olarak yerleşmiştir.
Laboratuvar, tezgâh üstü ve tamamen endüstriyel ultrasonik sistemlerin kolayca temin edilebilmesiyle ultrasonik ekstraksiyon, günümüzde yerleşik ve güvenilir bir teknolojidir. Hielscher ultrasonik ekstraktörleri, dünya genelinde gıda ve ilaç kalitesinde biyoaktif bileşikler üreten endüstriyel işleme tesislerinde kuruludur.

Hielscher Ultrasonics ile Süreç Standardizasyonu

Gıdalarda, ilaçlarda veya kozmetiklerde kullanılan alg kaynaklı ekstraktlar, İyi Üretim Uygulamalarına (GMP) uygun olarak ve standartlaştırılmış işleme şartnameleri kapsamında üretilmelidir. Hielscher Ultrasonics’in dijital ekstraksiyon sistemleri, sonikasyon sürecini hassas biçimde ayarlamayı ve kontrol etmeyi kolaylaştıran akıllı yazılımla birlikte sunulur. Otomatik veri kaydı, ultrason enerjisi (toplam ve net enerji), genlik, sıcaklık ve basınç (sıcaklık ve basınç sensörleri takılı olduğunda) gibi tüm ultrasonik işlem parametrelerini tarih ve saat damgasıyla birlikte dahili SD karta yazar. Bu, ultrasonik olarak işlenen her partiyi gözden geçirmenizi sağlar. Aynı zamanda tekrarlanabilirlik ve sürekli yüksek ürün kalitesi güvence altına alınır.

Aşağıdaki tablo, sonikatörlerimizin yaklaşık işleme kapasitesi hakkında bilgi verir: