Mitokondriyal Tanı için Yüksek Verimli Numune Hazırlama
Araştırma ve kliniklerde mitokondriyal teşhis, dizileme, PCR ve biyokimyasal testler gibi çeşitli teknikler kullanılarak gerçekleştirilir. Bu yöntemler, DNA mutasyonlarını tanımlamak ve mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için kullanılır. Dizileme, genetik mutasyonları tespit etmeye yardımcı olurken, PCR belirli DNA dizilerini ölçebilir. Biyokimyasal analizler, mitokondriyal proteinlerin ve enzimlerin işlevselliğini değerlendirir.
Mitokondriyal hastalıkların teşhisi, bu hastalıkların belirgin klinik değişkenliği ve iki farklı kalıtsal genom arasındaki karmaşık etkileşim nedeniyle özellikle zordur: mitokondriyal DNA (mtDNA) ve nükleer genom.
Sonikasyon kullanarak DNA Ekstraksiyonu ve Parçalanması
Kas dokusundan DNA ekstraksiyonu, mtDNA'da dokuya özgü değişikliklerden şüphelenildiğinde özellikle yararlıdır. Bu değişiklikler, kronik ilerleyici eksternal oftalmoplejide (CPEO) mtDNA delesyonlarını, mitokondriyal miyopatilerde mtDNA'nın nokta mutasyonlarını veya Alpers sendromunda mtDNA'nın tükenmesini içerebilir. Kas dokusundan ekstrakte edilen DNA daha sonra delesyonlar için Southern blot ve uzun menzilli PCR, tükenme için gerçek zamanlı PCR veya nokta mutasyonları için dizileme gibi çeşitli genetik testler için kullanılabilir.
Yoğun ultrason dalgaları kullanan sonikasyon, mitokondriyal teşhiste çeşitli uygulamalar için uygulanır. Mitokondri ve DNA gibi hücre içi içerikleri çıkarmak için hücreleri parçalamak, dizileme için mtDNA ve nDNA gibi DNA'ları kesmek ve örnekleri homojenize etmek için kullanılır.
Yüksek verimli numune hazırlama için UIP400MTP Plakalı Sonikatör çok kuyulu ve 96 oyuklu plakalardaki numuneleri eşit şekilde sonikleştirir
Mitokondri Hücrelerden ve Dokulardan Nasıl İzole Edilir
Mitokondriyal izolasyon iki temel adımdan oluşur: içeriklerini serbest bırakmak için hücreleri bozmak ve mitokondriyal fraksiyonları ayırmak ve geri kazanmak için diferansiyel santrifüjleme kullanmak.
Sonikasyon
Hielscher sonicators standart lizis tamponları ve kitleri ile uyumludur, bu da onları mitokondri izolasyonu için uygun hale getirir. Sonikasyon iki ana amaca hizmet eder:
- Hücre Parçalanması: Ultrasonik dalgalar hücre zarlarını bozarak hücre içi içeriği serbest bırakır.
- Mitokondriyal Bozulma: Sonraki bir adımdaki sonikasyon, mitokondriyal proteinleri veya mitokondriyal DNA'yı serbest bırakmak için mitokondriyi kırabilir.
- mtDNA Parçalanması: Sonikasyon, sıralama için mitokondriyal DNA'yı kesmek için güvenilir bir tekniktir.
Çok kuyulu plakalı sonikatör UIP400MTP, mitokondriyal numunelerin yüksek verimli numune hazırlanmasına izin verir. Diferansiyel santrifüjleme ile bağlantılı olarak, sonikasyon mitokondriyal izolasyonun verimliliğini arttırır ve çeşitli aşağı akış uygulamaları için uygun yüksek bozulmamış mitokondri verimi sağlar.
Hielscher UIP400MTP çok kuyulu plaka sonikatörü Herhangi bir standart plaka ile çalışır
Çok kuyulu plakalı sonikatör UIP400MTP, örneğin mitokondriyal teşhiste yüksek verimli numune hazırlama için çok sayıda avantaj sunar.
UIP400MTP Biyobelirteç teşhisinde yüksek verimli numune hazırlama için Çok Kuyulu Plaka Sonikatörü.
Ultrasonik mtDNA parçalanması için örnek talimatlar
Hazırlama ve Ekstraksiyon:
- C57BL / 6 fareleri servikal çıkık nedeniyle öldürüldü.
- Karaciğerler hızlı bir şekilde ekstrakte edildi ve buz gibi steril PBS'de yıkandı.
Mitokondri İzolasyonu:
- Mitokondri, 2 mL'lik Dounce doku öğütücü ve Doku için Mitokondri İzolasyon Kiti kullanılarak izole edildi.
- 700× g ve 3.000× g'da ilk santrifüjleme.
- Tampon C ile iki ek yıkama adımı gerçekleştirin.
DNA İzolasyonu:
- 700× g'daki ilk santrifüjlemeden elde edilen pelet, nükleer DNA'yı (nDNA) izole etmek için kullanıldı.
- DNA, spin kolonları kullanılarak izole edildi.
- Mitokondriyal DNA (mtDNA) izole edilmiş mitokondriden ekstrakte edildi.
- Nükleer DNA (nDNA), her ikisi de fare karaciğer dokusundan elde edilen ham nükleer ekstraktlardan ekstrakte edildi.
DNA Parçalanması:
- DNA, 2 × 30 saniye boyunca 14 μm'de 0.5 mm mikro uçlu sonotrotlu 30 kHz / 50-W ultrasonik sonikatör UP50H kullanılarak buz üzerinde parçalandı.
Parçalanma Görselleştirme ve Miktar Tayini:
- Ultrasonifikasyon sonrası parçalanma, SYBR güvenli DNA boyası ile% 1'lik bir agaroz jel üzerinde görüntülendi.
- MtDNA ve nDNA'nın nispi bolluğu qPCR ile belirlendi.
(bkz. Mariero ve diğerleri, 2019)
Yüksek verimli numune hazırlama için, çok kuyulu plaka sonikatörü, standart 96 kuyulu, çok kuyulu ve mikrotitre plakalarında büyük numune numaralarının hazırlanmasını UIP400MTP kolaylaştırır.
UIP400MTP kullanarak yüksek verimli numune hazırlamanın avantajları hakkında daha fazla bilgi edinin!
Sonikasyon kullanarak optimal mitokondri izolasyonu için ipuçları:
- Sıcaklık kontrolü: Tüm adımları 0°C ila 4°C sıcaklık aralığında gerçekleştirin. Bu, mitokondrinin bütünlüğünü ve işlevselliğini korumak için kritik öneme sahiptir.
- Verimlilik ve Hız: Hızlı çalışın ve mitokondriyi yalnızca özel uygulamanız için gereken ölçüde saflaştırın. Aşırı manipülasyon, önemli mitokondriyal içerik kayıplarına yol açabilir.
- Süspansiyonların Seyreltilmesi: İzolasyon işlemi boyunca düşük konsantrasyonlarda hücre ve organel süspansiyonlarını koruyun. Bu, sıkışma ve aglütinasyon risklerini en aza indirmeye yardımcı olur, böylece izole edilmiş mitokondrinin saflığını arttırır.
- Örnek Hacim: Tek bir büyük hazırlık yerine birden fazla küçük ölçekli hazırlığı tercih edin. Bu yaklaşım tipik olarak daha iyi verimle sonuçlanır, çünkü ölçek büyütme geri kazanılabilir mitokondri miktarını orantılı olarak artırmaz. Çok kuyulu plaka sonikatörü, mitokondri izolasyonu için hücrenin hızlı ve güvenilir bir şekilde parçalanmasını ve ayrıca mitokondriden protein ekstraksiyonunu UIP400MTP kolaylaştırır.
Bu yönergeler, ultrasonik lizis ve santrifüjleme kullanarak izolasyon sürecini daha verimli hale getirecek ve sonraki uygulamalar için uygun yüksek kaliteli mitokondriyal preparatlar sağlayacaktır.
Hielscher Sonikatörler – Almanya'da Üretilen Kalite
Hielscher ultrasonicators en yüksek kalite ve tasarım standartları için iyi bilinir. Sağlamlık ve kolay kullanım, ultrasonicators'ımızın endüstriyel tesislere sorunsuz bir şekilde entegre edilmesini sağlar. Zorlu koşullar ve zorlu ortamlar Hielscher ultrasonicators tarafından kolayca ele alınır.
Hielscher Ultrasonics, ISO sertifikalı bir şirkettir ve en son teknoloji ve kullanıcı dostu özelliklere sahip yüksek performanslı ultrasonicators'a özel önem vermektedir. Tabii ki, Hielscher ultrasonicators CE uyumludur ve UL, CSA ve RoHs gereksinimlerini karşılar.
Mikrotitre ve çok kuyulu plakaların sonikasyonu için 96 oyuklu plaka sonikatör UIP400MTP
Literatür / Referanslar
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Mitokondri ve Mitokondriyal Teşhis Hakkında Sıkça Sorulan Sorular
Mitokondri nedir?
Mitokondri, çoğu ökaryotik organizmanın hücrelerinde bulunan zara bağlı organellerdir. Hücresel solunum süreci boyunca adenozin trifosfat (ATP) formunda enerji ürettikleri için hücrenin güç merkezleri olarak bilinirler. Ek olarak, mitokondri kendi DNA'sına sahiptir ve hücre döngüsünün düzenlenmesi ve hücre ölümü dahil olmak üzere diğer hücresel süreçlerde kilit roller oynar.
mtDNA'yı Genomik DNA'dan ayıran nedir?
Mitokondriyal DNA (mtDNA), genomik DNA'dan (gDNA) birkaç önemli yönden farklıdır. MtDNA mitokondride bulunur, daireseldir ve maternal olarak kalıtılır, oysa gDNA hücre çekirdeğinde bulunur, doğrusaldır ve her iki ebeveynden de miras alınır. MtDNA çok daha küçüktür, sadece 37 geni kodlarken, gDNA yaklaşık 20.000-25.000 gen içerir. MtDNA, hücre başına birden fazla kopya halinde bulunur, daha yüksek bir mutasyon oranına sahiptir ve öncelikle mitokondriyal fonksiyonda yer alan proteinleri kodlar. Buna karşılık, gDNA tipik olarak diploiddir, daha düşük bir mutasyon oranına sahiptir ve organizmanın gelişimi ve işlevi için gerekli olan çok çeşitli genleri kodlar. Ek olarak, mtDNA transkripsiyonu ve translasyonu mitokondri içinde gerçekleşirken, gDNA transkripsiyonu çekirdekte gerçekleşir ve translasyon sitoplazmada gerçekleşir. Bu farklılıklar, farklı rollerini ve evrimsel kökenlerini yansıtır.
Hücresiz Ekstrakt Nedir?
Hücresiz bir ekstrakt, proteinler, nükleik asitler ve diğer hücresel bileşenler dahil olmak üzere parçalanmış hücrelerin içeriğini içeren, ancak bozulmamış hücre zarları olmayan bir çözeltidir. Bu ekstrakt, biyokimyasal ve moleküler biyoloji araştırmalarında hücresel süreçleri in vitro olarak incelemek için kullanılır ve araştırmacıların canlı hücrelerin dışındaki reaksiyonları ve mekanizmaları analiz etmelerini sağlar.
Diferansiyel Santrifüj Nedir?
Diferansiyel santrifüjleme, hücre fraksiyonasyonu ve mitokondriyal izolasyon için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu yöntem, hücresel yapıları hem yoğunluğa hem de şekle bağlı olan sedimantasyon katsayılarına göre ayırır. Proses, belirli yoğunluklara sahip tamponlanmış tuz çözeltilerindeki numunelere değişen seviyelerde merkezkaç kuvveti uygulanmasını içerir. Benzer sedimantasyon katsayılarına sahip yapılar aynı anda toplama tüpünün dibine çökerek geri kazanımlarına izin verecektir.
Mitokondri İzolasyonu için Diferansiyel Santrifüj nasıl kullanılır?
Diferansiyel santrifüjleme, araştırmacıların mitokondriyal fraksiyonları diğer hücresel bileşenlerden etkili bir şekilde ayırmasına olanak tanır. Mitokondrinin izolasyonu, birkaç santrifüjleme adımını ve ardından izolatın geri kazanılmasını içerir.
İlk Santrifüjleme: Büyük hücresel kalıntıları ve çekirdekleri çökeltmek için düşük bir merkezkaç kuvveti uygulayın.
Sonraki Santrifüjler: Mitokondri ile zenginleştirilmiş pelet fraksiyonlarına merkezkaç kuvvetini kademeli olarak artırın. Her santrifüjleme adımı, giderek daha yüksek sedimantasyon katsayılarına sahip yapıları ortadan kaldırır.
Fraksiyon Geri Kazanımı: Her santrifüjlemeden sonra, pelet toplanır ve süpernatant, bir sonraki fraksiyonu izole etmek için daha yüksek g-kuvvetlerine maruz bırakılır. Bu, istenen mitokondri saflığı elde edilene kadar tekrarlanır.