Mitokondriyal Tanı İçin Yüksek Numune İşleme Kapasitesiyle Numune Hazırlama
Araştırmalarda ve kliniklerde mitokondriyal tanı, dizileme, PCR ve biyokimyasal analizler gibi çeşitli teknikler kullanılarak gerçekleştirilir. Bu yöntemler, DNA mutasyonlarını belirlemek ve mitokondriyal işlevi ölçmek için kullanılır. Dizileme, genetik mutasyonların saptanmasına yardımcı olurken PCR, belirli DNA dizilerinin miktarını belirleyebilir. Biyokimyasal analizler, mitokondriyal proteinlerin ve enzimlerin işlevselliğini değerlendirir.
Mitokondriyal hastalıkların tanısı, bu hastalıkların belirgin klinik değişkenliğinin yanı sıra farklı biçimlerde kalıtılan iki genom arasındaki karmaşık etkileşim nedeniyle özellikle zordur: mitokondriyal DNA (mtDNA) ve nükleer genom.
Sonikasyon ile DNA Ekstraksiyonu ve Fragmentasyonu
Kas dokusundan DNA ekstraksiyonu, mtDNA’da dokuya özgü değişikliklerden şüphelenildiğinde özellikle yararlıdır. Bu değişiklikler, kronik progresif eksternal oftalmoplejide (CPEO) mtDNA delesyonlarını, mitokondriyal miyopatilerde mtDNA nokta mutasyonlarını veya Alpers sendromunda mtDNA deplesyonunu içerebilir. Kas dokusundan ekstrakte edilen DNA daha sonra delesyonlar için Southern blot ve uzun menzilli PCR, deplesyon için gerçek zamanlı PCR veya nokta mutasyonları için dizileme gibi çeşitli genetik testlerde kullanılabilir.
Yoğun ultrason dalgalarının kullanıldığı sonikasyon, mitokondriyal tanıda çeşitli uygulamalarda kullanılır. Mitokondri ve DNA gibi hücre içi içerikleri ekstrakte etmek amacıyla hücreleri lizise uğratmak, dizileme için mtDNA ve nDNA gibi DNA’ları kesmek ve numuneleri homojenize etmek için kullanılır.
Yüksek numune işleme kapasitesiyle numune hazırlama için UIP400MTP plaka sonikatörü çok kuyucuklu ve 96 kuyucuklu plakalardaki numunelere eşit biçimde sonikasyon uygular
Hücrelerden ve Dokulardan Mitokondri Nasıl İzole Edilir?
Mitokondri izolasyonu iki temel adımdan oluşur: içeriklerini serbest bırakmak için hücrelerin parçalanması ve mitokondriyal fraksiyonları ayırıp geri kazanmak için diferansiyel santrifüj uygulanması.
Sonikasyon
Hielscher sonikatörleri, standart lizis tamponları ve kitleriyle uyumludur; bu da onları mitokondri izolasyonuna uygun kılar. Sonikasyon iki temel amaca hizmet eder:
- Hücre Lizisi: Ultrason dalgaları hücre zarlarını parçalayarak hücre içi içerikleri serbest bırakır.
- Mitokondri Parçalama: Sonraki bir adımda uygulanan sonikasyon, mitokondriyal proteinleri veya mitokondriyal DNA’yı serbest bırakmak için mitokondrileri parçalayabilir.
- mtDNA Fragmentasyonu: Sonikasyon, dizileme için mitokondriyal DNA’yı kesmeye yönelik güvenilir bir tekniktir.
UIP400MTP çok kuyucuklu plaka sonikatörü, mitokondriyal numunelerin yüksek numune işleme kapasitesiyle hazırlanmasına olanak tanır. Diferansiyel santrifüj ile birlikte sonikasyon, mitokondri izolasyonunun verimliliğini artırarak çeşitli sonraki uygulamalara uygun, bütünlüğünü koruyan mitokondrilerin yüksek verimle elde edilmesini sağlar.
Hielscher UIP400MTP çok kuyucuklu plaka sonikatörü her türlü standart plakayla çalışır
UIP400MTP çok kuyucuklu plaka sonikatörü, örneğin mitokondriyal tanıda yüksek numune işleme kapasitesiyle numune hazırlama için çok sayıda avantaj sunar.
Biyobelirteç tanısında yüksek numune işleme kapasitesiyle numune hazırlama için UIP400MTP çok kuyucuklu plaka sonikatörü.
Ultrasonik mtDNA Fragmentasyonu İçin Örnek Talimatlar
Hazırlık ve Ekstraksiyon:
- C57BL/6 fareleri servikal dislokasyon ile öldürüldü.
- Karaciğerler hızla çıkarıldı ve buz soğukluğundaki steril PBS içinde yıkandı.
Mitokondri İzolasyonu:
- Mitokondriler, 2-mL Dounce doku öğütücüsü ve doku için mitokondri izolasyon kiti kullanılarak izole edildi.
- 700× g ve 3.000× g’de ilk santrifüjleme.
- C tamponuyla iki ek yıkama adımı uygulayın.
DNA İzolasyonu:
- 700× g’deki ilk santrifüjlemeden elde edilen pelet, nükleer DNA’yı (nDNA) izole etmek için kullanıldı.
- DNA, spin kolonları kullanılarak izole edildi.
- Mitokondriyal DNA (mtDNA), izole edilmiş mitokondrilerden ekstrakte edildi.
- Nükleer DNA (nDNA), ham nükleer ekstraktlardan ekstrakte edildi; her iki DNA da fare karaciğer dokusundan elde edildi.
DNA Fragmentasyonu:
- DNA, 0,5-mm mikro uçlu sonotroda sahip 30-kHz/50-W UP50H ultrasonik sonikatörü kullanılarak buz üzerinde 14 μm’de 2 × 30 saniye boyunca fragmente edildi.
Fragmentasyonun Görüntülenmesi ve Miktarının Belirlenmesi:
- Ultrasonikasyon sonrası fragmentasyon, SYBR safe DNA boyası ile %1 agaroz jel üzerinde görüntülendi.
- mtDNA ve nDNA’nın göreli bolluğu qPCR ile belirlendi.
(bkz. Mariero et al., 2019)
Yüksek numune işleme kapasitesiyle numune hazırlama için UIP400MTP çok kuyucuklu plaka sonikatörü, standart 96 kuyucuklu, çok kuyucuklu ve mikrotitre plakalarda çok sayıda numunenin hazırlanmasını kolaylaştırır.
UIP400MTP ile yüksek numune işleme kapasitesiyle numune hazırlamanın avantajları hakkında daha fazla bilgi edinin!
Sonikasyon ile Optimum Mitokondri İzolasyonu İçin İpuçları:
- Sıcaklık Kontrolü: Tüm adımları 0°C–4°C sıcaklık aralığında gerçekleştirin. Bu, mitokondrilerin bütünlüğünü ve işlevselliğini korumak için kritik öneme sahiptir.
- Verimlilik ve Hız: Hızlı çalışın ve mitokondrileri yalnızca kendi uygulamanızın gerektirdiği ölçüde saflaştırın. Aşırı işlem, mitokondriyal içerikte önemli kayıplara yol açabilir.
- Süspansiyonların Seyreltilmesi: İzolasyon süreci boyunca hücre ve organel süspansiyonlarının konsantrasyonlarını düşük tutun. Bu, hapsolma ve aglütinasyon risklerini en aza indirmeye yardımcı olarak izole edilen mitokondrilerin saflığını artırır.
- Numune Hacmi: Tek bir büyük ölçekli hazırlama yerine birden fazla küçük ölçekli hazırlamayı tercih edin. Ölçeğin büyütülmesi geri kazanılabilir mitokondri miktarını orantılı olarak artırmadığından, bu yaklaşım genellikle daha iyi verim sağlar. UIP400MTP çok kuyucuklu plaka sonikatörü, mitokondri izolasyonu için hücrelerin hızlı ve güvenilir biçimde lizise uğratılmasının yanı sıra mitokondrilerden protein ekstraksiyonunu da kolaylaştırır.
Bu yönergeler, ultrasonik lizis ve santrifüj kullanılan izolasyon sürecini daha verimli hale getirerek sonraki uygulamalara uygun, yüksek kaliteli mitokondriyal preparatların elde edilmesini sağlayacaktır.
Hielscher Sonikatörleri – Almanya’da Üretilen Kalite
Hielscher ultrasonikatörleri, en yüksek kalite ve tasarım standartlarıyla tanınır. Sağlamlık ve kolay kullanım, ultrasonikatörlerimizin endüstriyel tesislere sorunsuz entegrasyonunu mümkün kılar. Hielscher ultrasonikatörleri, zorlu koşulların ve güçlüklerle dolu ortamların kolaylıkla üstesinden gelir.
Hielscher Ultrasonics, ISO sertifikalı bir şirkettir ve en ileri teknolojiye ve kullanıcı dostu özelliklere sahip yüksek performanslı ultrasonikatörlere özel önem verir. Elbette Hielscher ultrasonikatörleri CE uyumludur ve UL, CSA ve RoHs gerekliliklerini karşılar.
Mikrotitre ve çok kuyucuklu plakaların sonikasyonu için UIP400MTP 96 kuyucuklu plaka sonikatörü
Literatür / Kaynaklar
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mitokondriler ve Mitokondriyal Tanı Hakkında Sıkça Sorulan Sorular
Mitokondriler Nedir?
Mitokondriler, çoğu ökaryotik organizmanın hücrelerinde bulunan zarla çevrili organellerdir. Hücresel solunum süreciyle adenozin trifosfat (ATP) biçiminde enerji ürettikleri için hücrenin enerji santralleri olarak bilinirler. Ayrıca mitokondrilerin kendilerine ait DNA’ları vardır ve hücre döngüsünün ve hücre ölümünün düzenlenmesi de dahil olmak üzere diğer hücresel süreçlerde kilit roller oynarlar.
mtDNA’yı Genomik DNA’dan Ayıran Nedir?
Mitokondriyal DNA (mtDNA), genomik DNA’dan (gDNA) birkaç temel yönden farklıdır. MtDNA mitokondrilerde bulunur, halkasaldır ve anneden kalıtılırken gDNA hücre çekirdeğinde bulunur, doğrusaldır ve her iki ebeveynden kalıtılır. MtDNA çok daha küçüktür ve yalnızca 37 geni kodlar; gDNA ise yaklaşık 20.000–25.000 gen içerir. MtDNA her hücrede birden fazla kopya halinde bulunur, daha yüksek bir mutasyon oranına sahiptir ve esas olarak mitokondriyal işlevde rol oynayan proteinleri kodlar. Buna karşılık gDNA genellikle diploiddir, daha düşük bir mutasyon oranına sahiptir ve organizmanın gelişimi ve işlevi için gerekli çok çeşitli genleri kodlar. Ayrıca mtDNA transkripsiyonu ve translasyonu mitokondrilerin içinde gerçekleşirken gDNA transkripsiyonu çekirdekte, translasyonu ise sitoplazmada gerçekleşir. Bu farklılıklar, onların farklı rollerini ve evrimsel kökenlerini yansıtır.
Hücresiz Ekstrakt Nedir?
Hücresiz ekstrakt, proteinler, nükleik asitler ve diğer hücresel bileşenler de dahil olmak üzere lizise uğratılmış hücrelerin içeriklerini barındıran, ancak bütünlüğünü koruyan hücre zarları içermeyen bir çözeltidir. Bu ekstrakt, hücresel süreçleri in vitro incelemek için biyokimya ve moleküler biyoloji araştırmalarında kullanılır ve araştırmacıların canlı hücrelerin dışında reaksiyonları ve mekanizmaları analiz etmesini sağlar.
PCR Testleri Mitokondriyal Tanıda Nasıl Bir Rol Oynar?
PCR testleri, mitokondriyal DNA’daki (mtDNA) mutasyonların, delesyonların veya kopya sayısı varyasyonlarının saptanmasını sağlayarak mitokondriyal tanıda kritik bir rol oynar. Mitokondriyal bozukluklarla ilişkili patojenik varyantları belirlemek için belirli mtDNA bölgelerinin çoğaltılmasına olanak tanırlar. Kantitatif PCR (qPCR) ve uzun menzilli PCR gibi PCR tabanlı teknikler, mtDNA bütünlüğünü, heteroplazmi düzeylerini ve mtDNA deplesyonunu değerlendirmek için de kullanılarak mitokondriyal işlev ve hastalık hakkında temel bilgiler sağlar.
UIP400MTP mikroplaka sonikatörünün PCR testlerini ve analizlerini nasıl kolaylaştırdığını öğrenin!
Diferansiyel Santrifüj Nedir?
Diferansiyel santrifüj, hücre fraksiyonlama ve mitokondri izolasyonu için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu yöntem, hücresel yapıları hem yoğunluğa hem de şekle bağlı olan sedimentasyon katsayılarına göre ayırır. Süreç, belirli yoğunluklara sahip tamponlanmış tuz çözeltilerindeki numunelere farklı düzeylerde santrifüj kuvveti uygulanmasını içerir. Benzer sedimentasyon katsayılarına sahip yapılar, toplama tüpünün dibine aynı anda çökelerek geri kazanılmalarına olanak tanır.
Diferansiyel Santrifüj Mitokondri İzolasyonunda Nasıl Kullanılır?
Diferansiyel santrifüj, araştırmacıların mitokondriyal fraksiyonları diğer hücresel bileşenlerden etkili biçimde ayırmasına olanak tanır. Mitokondri izolasyonu, birkaç santrifüj adımını ve ardından izolatın geri kazanılmasını içerir.
İlk Santrifüjleme: Büyük hücresel kalıntıları ve çekirdekleri çöktürmek için düşük bir santrifüj kuvveti uygulayın.
Sonraki Santrifüjlemeler: Mitokondri bakımından zenginleştirilmiş fraksiyonları pelet haline getirmek için santrifüj kuvvetini kademeli olarak artırın. Her santrifüj adımı, giderek daha yüksek sedimentasyon katsayılarına sahip yapıları uzaklaştırır.
Fraksiyonun Geri Kazanılması: Her santrifüjlemeden sonra pelet toplanır ve bir sonraki fraksiyonu izole etmek için süpernatan daha yüksek g kuvvetlerine maruz bırakılır. Bu işlem, mitokondrilerin istenen saflığına ulaşılıncaya kadar tekrarlanır.