Ultraljudsbehandling för celllys: Cell Disruption och extraktion
Ultraljudscelllys är en provberedningsprocedur i biotekniska laboratorier. Målet är att störa cellväggar eller hela celler för att frigöra biologiska molekyler. Ultraljudsbehandling används ofta för celllys, cellstörning och extraktion. Den stora fördelen med sonikatorer för celllys ligger i den exakta kontrollen av processparametrar, såsom intensitet och temperatur, vilket möjliggör skonsam men effektiv cellstörning och extraktion.
Celllys med hjälp av ultraljud
Ultraljudscelllys använder högfrekventa ljudvågor för att bryta upp celler och extrahera deras innehåll. Ultraljudsbehandling är etablerad och tillförlitlig för cellstörning och extraktion av intracellulärt material, såsom plasmider, receptoranalyser, proteiner, DNA och RNA. Genom att justera processparametrarna kan ultraljudsintensiteten finjusteras för att uppfylla specifika applikationskrav, allt från mild till intensiv ultraljudsbehandling. Stegen efter lysering inkluderar fraktionering, organellisolering och proteinextraktion och rening. Det resulterande lysatet måste separeras för ytterligare undersökningar eller tillämpningar, såsom proteomisk forskning.
Om du vill lära dig mer om ultraljudsbehandling för lys, cellstörning och extraktion, vänligen kontakta oss. Vårt tekniska team hjälper dig gärna med ditt celllysprojekt.
Ultraljud homogenisatorer UP100H (100 watt) och UP400St (400 watt): Ultraljudsbehandling för celllys och extraktion.
Fördelar med att använda ultraljudsbehandling för celllys
Jämfört med andra celllys- och extraktionsmetoder har ultraljudscelllys flera fördelar:
- Hastighet: Ultraljud celllys och extraktion är en snabb metod som kan bryta upp celler på några sekunder. Detta är mycket snabbare än andra metoder som homogenisering, frysupptining eller pärlmalning.
- Effektivitet: Ultraljudscelllys och extraktion kan användas för att behandla små, stora eller flera prover samtidigt, vilket gör det mer effektivt än andra metoder som kräver individuell bearbetning av små prover.
- Fri från kemikalier: Ultraljudscelllys och extraktion är en icke-invasiv metod som inte kräver användning av starka kemikalier eller enzymer. Detta gör den idealisk för applikationer där integriteten hos cellinnehållet måste upprätthållas. Oönskad kontaminering av prover kan undvikas.
- Hög avkastning: Ultraljudscelllys och extraktion kan extrahera ett högt utbyte av cellulärt innehåll, inklusive DNA, RNA och proteiner. Detta beror på att de högfrekventa ljudvågorna bryter upp cellväggarna och släpper ut innehållet i den omgivande lösningen.
- Temperaturreglering: Sofistikerade ultraljudsapparater möjliggör exakt temperaturkontroll av provet. Hielscher digitala sonikatorer är utrustade med en pluggbar temperatursensor och programvara för temperaturövervakning.
- Reproducerbara: Protokoll för ultraljudscelllys kan enkelt reproduceras och till och med matchas till olika större eller mindre provvolymer genom en enkel linjär uppskalning.
- Mångsidig: Ultraljud celllys och extraktion kan användas för att extrahera ett brett spektrum av celltyper, inklusive bakterier, jäst, svampar, växt- och däggdjursceller. Det kan också användas för att extrahera olika typer av molekyler, inklusive proteiner, DNA, RNA och lipider.
- Samtidig beredning av många prover: Hielscher Ultrasonics erbjuder flera lösningar för att bekvämt bearbeta många prover under exakt samma processförhållanden. Detta gör provberedningssteget för lys och extraktion mycket effektivt och tidsbesparande.
- Lätt att använda: Utrustning för ultraljudscelllys och extraktion är lätt att använda och kräver minimal utbildning. Utrustningen är också ekonomisk eftersom det är en enda investering utan krav på återköp av avyttringar. Detta gör det attraktivt för ett brett spektrum av forskare och laboratorier.
Sammantaget är ultraljudscelllys och extraktion en snabb, effektiv, exakt kontrollerbar och mångsidig metod för att extrahera cellulärt innehåll. Dess fördelar jämfört med alternativa metoder gör det till ett attraktivt val för ett brett spektrum av forskning och industriella tillämpningar.
Arbetsprincip för ultraljudscelllys
Ultraljudscelllys och extraktion använder högfrekventa ljudvågor för att störa celler och extrahera deras innehåll. Ljudvågorna skapar tryckförändringar i den omgivande vätskan, vilket gör att små bubblor bildas och kollapsar i en process som kallas kavitation. Dessa bubblor genererar lokaliserade mycket intensiva mekaniska krafter som kan bryta upp celler och släppa ut deras innehåll i den omgivande lösningen.
Celllys med hjälp av en ultraljudsapparat innebär vanligtvis följande steg:
- Provet placeras i ett rör eller en behållare med en vätskebuffert.
- En ultraljudssond sätts in i provet och högfrekventa ljudvågor med ca 20-30 kHz appliceras.
- Ultraljudsvågorna orsakar svängning och kavitation i den omgivande vätskan, vilket genererar lokala krafter som bryter upp celler och frigör deras innehåll.
- Provet centrifugeras eller filtreras för att avlägsna eventuellt cellulärt skräp, och det extraherade innehållet samlas in för nedströmsanalys.
Kraftfulla ultraljudsvågor stör cellmatrisen av biologiska strukturer och frigör de bioaktiva föreningarna. Massöverföringen mellan växtmaterialet och lösningsmedlet (t.ex. buffert) intensifieras. (grafik: ©Vilkhu et al., 2006)
Nackdelar med vanliga lyseringsmetoder
Under ditt arbete i laboratorier kanske du redan har upplevt besväret med celllys med traditionella mekaniska eller kemiska lysprotokoll.
- Mekanisk lysering: Mekaniska lyseringsmetoder, såsom malning med mortel och mortelstöt eller homogenisering med hjälp av en fransk press, strängkvarn eller rotor-statorsystem, saknar ofta alternativ för kontroll och justering. Detta innebär att användning av malning och malning snabbt kan generera värme och skjuvkrafter som kan skada provet och denaturera proteiner. De kan också vara tidskrävande och kräva stora mängder utgångsmaterial.
- Kemisk lys: Kemiska lyseringsmetoder, såsom tvättmedelsbaserad lys, kan skada provet genom att störa lipiddubbelskiktet och denaturera proteiner. De kan också kräva flera steg och kan lämna kvarvarande föroreningar som stör nedströmsapplikationer. Att hitta den optimala doseringen av tvättmedel är en ytterligare utmaning.
- Frys-upptiningscykler: Frys-upptiningscykler kan få cellmembran att brista, men upprepade cykler kan också orsaka proteindenaturering och nedbrytning. Denna metod kan också kräva flera cykler, vilket kan vara tidskrävande och ofta resulterar i lägre avkastning.
- Enzymatisk lys: Enzymatiska lyseringsmetoder kan vara specifika för vissa celltyper och kräver flera steg, vilket gör dem tidskrävande. De genererar också avfall och kräver noggrann optimering för att undvika nedbrytning av provet. Enzymatiska lyseringskit är ofta dyra. Om din nuvarande enzymatiska lysprocedur ger otillräckliga resultat, ultraljudsbehandling som synergistisk metod kan tillämpas för att intensifiera cellstörningar.
Till skillnad från konventionella mekaniska och kemiska celllyseringsmetoder, är ultraljudsbehandling ett mycket effektivt och tillförlitligt verktyg för cellupplösning som möjliggör en fullständig kontroll över ultraljudsbehandling. Detta säkerställer en hög selektivitet när det gäller frisläppning av material och produktens renhet. [jfr Balasundaram et al., 2009]
Den är lämplig för alla celltyper och lätt att applicera i liten och stor skala – Alltid under kontrollerade former. Ultraljudsapparater är lätta att rengöra. En ultraljudshomogenisator har alltid funktionen clean-in-place (CIP) och sterilize-in-place (SIP). Sonotroden består av ett massivt titanhorn som kan torkas eller spolas i vatten eller lösningsmedel (beroende på arbetsmediet). Underhållet av ultraljudsapparater är på grund av deras robusthet nästan försumbart.
Ultraljudslys och cellstörningar
I allmänhet tar lyseringen av prover i laboratoriet mellan 15 sekunder och 2 minuter. Eftersom intensiteten av ultraljudsbehandling är mycket lätt att justera genom amplitud ställa in en ultraljudsbehandling tid samt genom att välja rätt utrustning, är det möjligt att störa cellmembran mycket försiktigt eller mycket plötsligt, beroende på cellstrukturen och på syftet med lys (t.ex. DNA-extraktion kräver mjukare ultraljudsbehandling, fullständig proteinextraktion av bakterier kräver en mer intensiv ultraljudsbehandling). Temperaturen under processen kan övervakas av en integrerad temperatursensor och kan enkelt styras genom kylning (isbad eller flödesceller med kylmantel) eller genom ultraljudsbehandling i pulserande läge. Under puls-mode ultraljudsbehandling, korta ultraljudsbehandling burst cykler på 1-15 sekunders varaktighet möjliggör värmeavledning och kylning under de längre intermittenta perioderna.
Alla ultraljudsdrivna processer är helt reproducerbara och linjärt skalbara.
Den VialTweeter är en ultraljudshomogenisator för samtidig, enhetlig och snabb steril beredning av många prover.
Ultraljudshomogenisatorer för celllys och extraktion
Olika typer av ultraljudsenheter gör det möjligt att matcha provberedningsmålet och för att säkerställa användarvänlighet och driftskomfort. Ultraljudsapparater av sondtyp är de vanligaste enheterna i labbet. De är mest lämpliga för beredning av små och medelstora prover med volymer på 0,1 ml upp till 1000 ml. Olika effektstorlekar och sonotroder gör det möjligt att anpassa ultraljudsapparaten till provvolymen och kärlet för mest effektiva och effektiva ultraljudsbehandlingsresultat. Ultraljudssonden är det bästa valet när enstaka prover måste förberedas.
Om fler prover måste förberedas, t.ex. 8-10 injektionsflaskor celllösning, är en intensiv indirekt ultraljudsbehandling med ultraljudssystem som VialTweeter eller en ultraljudskopphorn den mest lämpliga homogeniseringsmetoden för en effektiv lys. Flera injektionsflaskor är ultraljudsbehandlade på samma gång, med samma intensitet. Detta sparar inte bara tid, utan säkerställer också samma behandling av alla prover, vilket gör resultaten bland proverna tillförlitliga och jämförbara. Dessutom, under indirekt ultraljudsbehandling korskontaminering genom nedsänkning av ultraljud sonotrode (även känd som ultraljud sond, horn, spets, eller finger) undviks. Eftersom injektionsflaskor som matchas individuellt till provstorlek används, utelämnas tidskrävande rengöring och provförlust på grund av dekantering av kärl. För enhetlig ultraljudsbehandling av multibrunns- eller mikrotiterplattor erbjuder Hielscher UIP400MTP.
För högre volymer, t.ex. för kommersiell produktion av cellextrakt, är kontinuerliga ultraljudssystem med en flödescellsreaktor mest lämpliga. Det kontinuerliga och jämna flödet av det bearbetade materialet säkerställer en jämn ultraljudsbehandling. Alla parametrar i ultraljudsdesintegrationsprocessen kan optimeras och justeras till kraven för applikationen och det specifika cellmaterialet.
Exemplarisk procedur för ultraljudslysering av bakterieceller:
- Beredning av cellsuspensionen: Cellpellets måste suspenderas helt i en buffertlösning genom homogenisering (välj din buffertlösning som är kompatibel med följande analys, t.ex. en specifik kromatografimetod). Tillsätt lysozymer och/eller andra tillsatser om det behövs (de måste också vara kompatibla med separations-/reningsmedel). Blanda/homogenisera lösningen försiktigt under mild ultraljudsbehandling tills fullständig suspension uppnås.
- Ultraljudslys: Placera provet i ett isbad. För cellstörning, sonikerat suspensionen vid 60-90 sekunders skurar (med hjälp av pulsläge på din sonikator).
- Separering: Centrifugera lysatet (t.ex. 10 minuter vid 10 000 x g, vid 4 °C). Separera supernatanten från cellpelleten försiktigt. Supernatanten är det totala celllysatet. Efter filtrering av supernatanten får du en klarad vätska av det lösliga cellproteinet.
De vanligaste tillämpningarna för ultraljudsapparater inom biologi och bioteknik är:
- Förberedelse av cellextrakt
- Störning av jäst, bakterier, växtceller, mjuk- eller hårdcellvävnad, nukleinärt material
- Utvinning av protein
- Framställning och isolering av enzymer
- Produktion av antigener
- DNA-extraktion och/eller riktad fragmentering
- Förberedelse av liposom
Cellstörning med ultraljud av sondtyp är en effektiv provberedningsmetod.
Tabellen nedan ger dig en översikt över våra ultraljudsapparater för cellstörning och extraktion. Klicka på enhetstypen för att få mer information om varje ultraljudshomogenisator. Vår välutbildade och långvariga erfarenhet tekniska personal hjälper dig gärna att välja den mest lämpliga ultraljudsapparaten för dina prover!
| Batchvolym | Flöde | Rekommenderade enheter |
|---|---|---|
| Upp till 10 injektionsflaskor eller tuber | N.A. | VialTweeter |
| Multiwell / Microtiterplattor | N.A. | UIP400MTP |
| Flera rör / kärl | N.A. | Kopparhorn |
| 1 till 500 ml | 10 till 200 ml/min | UP100H |
| 10 till 1000 ml | 20 till 200 ml/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 till 2000 ml | 20 till 400 ml/min | UP400St |
De många tillämpningarna av ultraljud förgrenar sig inom sektorerna bioteknik, bioteknik, mikrobiologi, molekylärbiologi, biokemi, immunologi, bakteriologi, virologi, proteomik, genetik, fysiologi, cellbiologi, hematologi och botanik.
Lys: Bryta cellstrukturer
Cellerna skyddas av ett halvpermeabelt plasmamembran som består av ett dubbelskikt av fosfolipider (även protein-lipiddubbelskikt; bildat av hydrofoba lipider och hydrofila fosformolekyler med inbäddade proteinmolekyler) och skapar en barriär mellan cellens inre (cytoplasma) och den extracellulära miljön. Växtceller och prokaryota celler är omgivna av en cellvägg. På grund av flera lager tjock cellvägg av cellulosa är växtceller svårare att lysera än djurceller. Cellens inre, såsom organeller, kärna, mitokondrier, stabiliseras av cytoskelettet.
Genom att lysera cellerna syftar det till att extrahera och separera organeller, proteiner, DNA, mRNA eller andra biomolekyler.
Konventionella metoder för celllys och deras nackdelar
Det finns flera metoder för att lysera celler, som kan delas in i mekaniska och kemiska metoder, som inkluderar användning av rengöringsmedel eller lösningsmedel, applicering av högt tryck eller användning av en pärlkvarn eller en fransk press. Den mest problematiska nackdelen med dessa metoder är den svåra kontrollen och justeringen av processparametrar och därmed påverkan.
Tabellen nedan visar de största nackdelarna med vanliga lyseringsmetoder:
Tabell: Konventionella metoder för celllys har stora nackdelar
Förfarande för Lysis
Lys är en känslig process. Under lyseringen förstörs skyddet av cellmembranet, men inaktivering, denaturering och nedbrytning av de extraherade proteinerna genom en ofysiologisk miljö (avvikelse från pH-värdet) måste förhindras. Därför utförs i allmänhet lys i en buffertlösning. De flesta svårigheter uppstår på grund av okontrollerad cellstörning som resulterar i en oriktad frisättning av allt intracellulärt material eller / och denaturering av målprodukten.
Vanliga frågor om ultraljudsbehandling och celllys
- Kan du lysera celler med ultraljudsbehandling? Ja, ultraljudsbehandling lyser effektivt celler med hjälp av högfrekventa ultraljudsvågor som inducerar kavitation, ett fenomen där små ångbubblor bildas och kollapsar våldsamt inom cellsuspensionen. De resulterande mekaniska krafterna stör cellmembranen och underlättar frisättningen av intracellulära komponenter i vätskan.
- Hur använder man en ultraljudsapparat för celllys? Att använda en sonikator för celllys innebär att sänka ner sonden sond i en cellsuspension och justera parametrar som amplitud och pulslängd. Processen bör övervakas noggrant för att optimera cellstörningen samtidigt som proteindenaturering och enzyminaktivering minimeras.
- Vad är principen för ultraljudsbehandling för celllys? Ultraljudsbehandling fungerar enligt principen om akustisk kavitation. Ultraljudsenergi överförs till det flytande mediet, vilket orsakar snabba tryckfluktuationer som leder till bildning och implosion av mikrobubblor. Dessa implosioner genererar intensiva skjuvkrafter och lokala höga temperaturer, vilket stör cellulära strukturer och förbättrar lysathomogeniteten.
- Hur lång tid tar celllys ultraljudsbehandling? Varaktigheten av ultraljudsbehandling för celllys kan variera avsevärt beroende på faktorer som celltyp, celldensitet, ultraljudsbehandling kraft, och det specifika protokoll som används. Typiska procedurer kan sträcka sig från några sekunder till några minuter, ofta utförda i cykler för att hantera värmeproduktion och säkerställa enhetlig cellstörning.
- Vad är syftet med ultraljudsbehandling vid proteinextraktion? Vid proteinextraktion, ultraljudsbehandling tjänar till att effektivt bryta cellmembran och solubilisera proteiner. Denna metod är särskilt användbar för att frigöra proteiner inifrån cellulära fack, vilket gör den viktig för att förbereda lysat från vilka proteiner ska renas eller analyseras.
- Varför används ultraljudsbehandling för extraktion? Ultraljudsbehandling är gynnad för extraktion på grund av dess snabba verkan och förmåga att tillämpa riktad energi, bryta ner cellulära strukturer för att frigöra bioaktiva molekyler utan användning av hårda kemiska behandlingar, vilket bevarar den funktionella integriteten hos de extraherade föreningarna.
- Stör ultraljudsbehandling protein-protein interaktioner? Medan ultraljudsbehandling effektivt kan störa cellmembran, kan det också störa protein-protein interaktioner. Graden av störning beror på ultraljudsbehandling intensitet och exponering varaktighet, vilket kan leda till denaturering eller dissociation av proteinkomplex, vilket kan påverka efterföljande analytiska eller funktionella studier.
- Kan ultraljudsbehandling användas för att lysera E. coli? Hielscher sonikatorer är särskilt effektiva för att lysera bakterieceller såsom E. coli, som har robusta cellväggar. Tekniken ger en fysikalisk metod för att skjuva cellväggen och membranet, vilket gör den till en föredragen metod för att framställa bakteriella lysat i molekylärbiologiska och biokemiska laboratorier.
Litteratur/Referenser
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.