Ultraljudsbehandling för lys: Cell störningar och extraktion

Cellupplösning eller lys är en vanlig del av daglig provberedning i biotekniklaboratorier. Målet med lys är att störa delar av cellväggen eller hela cellen för att frigöra biologiska molekyler. Ultraljud homogenisatorer används ofta för framgångsrik celllys. Den största fördelen med sofistikerade ultrasonicators är den exakta kontrollen över processparametrar som intensitet och temperatur, vilket möjliggör en mild, men ändå mycket effektiv cellstörning och extraktion.

Celllys med ultraljud

Ultraljud cell lys och extraktion är en metod som används för att bryta upp celler och extrahera innehållet med hjälp av högfrekventa ljudvågor, dvs ultraljud. Ultraljudsbehandling är en lysteknik, som används allmänt som en etablerad och pålitlig metod för cellstörning och extraktion av intracellulärt material. Ultraljud lys är en pålitlig teknik för att förbereda lysat ccontaining t.ex. plasmid, receptoranalyser, proteiner, DNA, RNA etc. Eftersom ultraljudsintensiteten kan jämnas ut genom att justera processparametrarna, den optimala ultraljudsbehandling intensitet från mycket mjuk till intensiv kan ställas in individuellt för varje ämne och medium för att uppfylla specifika applikationskrav. Följande steg i lysen är fraktionering, organellisolering eller / och proteinextraktion och rening. Det extraherade materialet (= lysat) måste separeras och är föremål för ytterligare undersökningar eller tillämpningar, t.ex. för proteomisk forskning.

Jämfört med andra celllys och extraktionsmetoder har ultraljud celllys flera fördelar:

1. Hastighet: Ultraljud cell lys och extraktion är en snabb metod som kan bryta upp celler på några sekunder. Detta är mycket snabbare än andra metoder som homogenisering, freez-upptining eller pärlfräsning.
2. Effektivitet: Ultraljud cell lys och extraktion kan användas för att behandla små, stora eller flera prover på en gång, vilket gör det effektivare än andra metoder som kräver individuell bearbetning av små prover.
3. Kemikaliefri: Ultraljud cell lys och extraktion är en icke-invasiv metod som inte kräver användning av hårda kemikalier eller enzymer. Detta gör den idealisk för applikationer där cellinnehållets integritet måste bibehållas. Oönskad kontaminering av prover kan undvikas.
4. Högt utbyte: Ultraljud cell lys och extraktion kan extrahera ett högt utbyte av cellulärt innehåll, inklusive DNA, RNA, och proteiner. Detta beror på att de högfrekventa ljudvågorna bryter upp cellväggarna och släpper ut innehållet i den omgivande lösningen.
5. Temperatur kontroll: Sofistikerade ultraljud möjliggör exakt temperaturkontroll av provet. Hielscher digital ultraljud är utrustade med en pluggbar temperatursensor och temperaturövervakningsprogramvara.
6. Reproducerbara: Protokoll för ultraljud cell lys kan enkelt reproduceras och även matchas till olika större eller mindre provvolymer genom en enkel linjär uppskalning.
7. Mångsidig: Ultraljud cell lys och extraktion kan användas för att extrahera ett brett spektrum av celltyper, inklusive bakterier, jäst, svampar, växt och däggdjursceller. Det kan också användas för att extrahera olika typer av molekyler, inklusive proteiner, DNA, RNA och lipider.
8. Samtidig beredning av många prover: Hielscher Ultrasonics erbjuder flera lösningar för att bekvämt bearbeta många prover under exakt samma processförhållanden. Detta gör provberedningssteget för lys och extraktion mycket effektivt och tidsbesparande.
9. Lätt att använda: Ultraljud cell lys och extraktion utrustning är lätt att använda och kräver minimal träning. Utrustningen är också ekonomisk eftersom det är en enda investering utan krav på återköp av bortskaffande. Detta gör det attraktivt för ett brett spektrum av forskare och laboratorier.

Sammantaget är ultraljud celllys och extraktion en snabb, effektiv, exakt kontrollerbar och mångsidig metod för att extrahera cellulärt innehåll. Dess fördelar jämfört med alternativa metoder gör det till ett attraktivt val för ett brett spektrum av forskning och industriella tillämpningar.

Arbetsprincip för ultraljud cell lys

Ultraljud cell lys och extraktion använder högfrekventa ljudvågor för att störa celler och extrahera deras innehåll. Ljudvågorna skapar tryckförändringar i den omgivande vätskan, vilket gör att små bubblor bildas och kollapsar i en process som kallas kavitation. Dessa bubblor genererar lokaliserade mycket intensiva mekaniska krafter som kan bryta upp celler och släppa ut innehållet i den omgivande lösningen.

Celllys med hjälp av en ultrasonicator innebär vanligtvis följande steg:

• Provet placeras i ett rör eller en behållare med en vätskebuffert.
• En ultraljudssond sätts in i provet och högfrekventa ljudvågor med ca 20-30 kHz appliceras.
• Ultraljudsvågorna orsakar svängning och kavitation i den omgivande vätskan, vilket genererar lokaliserade krafter som bryter upp celler och släpper ut innehållet.
• Provet centrifugeras eller filtreras för att avlägsna cellulärt skräp, och det extraherade innehållet samlas in för nedströmsanalys.

Kraftfulla ultraljudsvågor stör cellmatrisen av biologiska strukturer och frigör de bioaktiva föreningarna. Massöverföringen mellan växtmaterialet och lösningsmedlet (t.ex. buffert) intensifieras. (grafik: ©Vilkhu m.fl., 2006)

Nackdelar med vanliga lysmetoder

Under ditt arbete i laboratorier kanske du redan har upplevt besväret med celllys med traditionella mekaniska eller kemiska lysprotokoll.

• Mekanisk lys: Mekaniska lysmetoder, såsom slipning med murbruk och stöt eller homogenisering med hjälp av ett franskt press-, pärlkvarn- eller rotorstatorsystem saknar ofta precice-kontroll och justeringsalternativ. Detta innebär att användningen av fräsning och slipning snabbt kan generera värme och skjuvkrafter som kan skada provet och denaturera proteiner. De kan också vara tidskrävande och kräva stora mängder utgångsmaterial.
• Kemisk lys: Kemiska lysmetoder, såsom tvättmedelsbaserad lys, kan skada provet genom att störa lipid-dubbelskiktet och denaturera proteiner. De kan också kräva flera steg och kan lämna kvarvarande föroreningar som stör nedströmsapplikationer. Att hitta den optimala dosen av tvättmedel är en ytterligare utmaning.
• Frys-tina cykler: Frys-tina cykler kan orsaka cellmembran att brista, men upprepade cykler kan också orsaka proteindenaturering och nedbrytning. Denna metod kan också kräva flera cykler, vilket kan vara tidskrävande och ofta resulterar i lägre avkastning.
• Enzymatisk lys: Enzymatiska lysmetoder kan vara specifika för vissa celltyper och kräver flera steg, vilket gör dem tidskrävande. De genererar också avfall och kräver noggrann optimering för att undvika nedbrytning av provet. Enzymatiska lyssatser är ofta dyra. Om din nuvarande enzymatiska lysprocedur ger otillräckliga resultat, ultraljudsbehandling som synergistisk metod kan tillämpas för att intensifiera cellstörning.

I motsats till konventionella mekaniska och kemikalier cell lys, ultraljudsbehandling är ett mycket effektivt och pålitligt verktyg för cell sönderdelning som möjliggör en fullständig kontroll över ultraljudsbehandling parametrar. Detta säkerställer en hög selektivitet på materialfrisättning och produktrenhet. [jfr Balasundaram m.fl., 2009]
Den är lämplig för alla celltyper och lätt att applicera i liten och stor skala – alltid under kontrollerade förhållanden. Ultrasonicators är lätta att rengöra. En ultraljud homogenisator har alltid clean-in-place (CIP) och sterilisera-på-plats (SIP) funktion. Sonotroden består av ett massivt titanhorn som kan torkas eller spolas i vatten eller lösningsmedel (beroende på arbetsmedium). Underhållet av ultrasonicators beror på deras robusthet nästan försummande.

Ultraljud Lysis och cell störningar

I allmänhet kommer Lys av prover i labbet ta mellan 15 sekunder och 2 minuter. Eftersom intensiteten av ultraljudsbehandling är mycket lätt att justera genom amplitud inställning en ultraljudsbehandling tid samt genom att välja rätt utrustning, är det möjligt att störa cell membranen mycket försiktigt eller mycket abrupt, beroende på cell struktur och i syfte att Lys ( t. ex. DNA-extraktion kräver mjukare ultraljudsbehandling, komplett protein utvinning av bakterier kräver en intensivare ultraljud. Temperaturen under processen kan övervakas av en integrerad temperatur sensor och kan lätt kontrol leras genom kylning (isbad eller flöde celler med kylning jackor) eller genom ultraljudsbehandling i pulsade läge. Under puls-läge ultraljudsbehandling, korta ultraljudsbehandling burst cykler av 1-15 sekunder varaktighet tillåter värme avledning och kylning under längre intermittent perioder.
Alla ultraljud-drivna processer är helt reproducerbara och linjärt skalbar.

Ultraljud homogenisatorer för celllys och extraktion

Olika typer av ultraljudsenheter gör det möjligt att matcha provberedningsmålet och för att säkerställa användarvänlighet och driftskomfort. Sond-typ ultrasonicators är de vanligaste enheterna i labbet. De är mest lämpade för beredning av små och medelstora prover med volymer på 0,1 ml upp till 1000 ml. Olika kraftstorlekar och sonotroder gör det möjligt att anpassa ultrasonicator till provvolymen och kärlet för mest effektiva och effektiva ultraljudsbehandling resultat. Ultraljudssondanordningen är det bästa valet när enstaka prover måste förberedas.

Om fler prover måste beredas, t.ex. 8-10 injektionsflaskor med celllösning, är en intensiv indirekt ultraljudsbehandling med ultraljudssystem som VialTweeter eller en ultraljud cuphorn den mest lämpliga homogeniseringsmetoden för en effektiv lys. Flera injektionsflaskor är sonicated samtidigt, med samma intensitet. Detta sparar inte bara tid utan säkerställer också samma behandling av alla prover, vilket gör resultaten bland proverna tillförlitliga och jämförbara. Dessutom, under indirekt ultraljudsbehandling korskontaminering genom att nedsänka ultraljud sonotrode (även känd som ultraljud sond, horn, spets, eller finger) undviks. Eftersom individuellt till provstorlek matchade injektionsflaskor används, utelämnas tidskrävande rengöring och provförlust på grund av dekantering av kärl. För enhetlig ultraljudsbehandling av multiwell eller mikrotiter plattor, Hielscher erbjuder UIP400MTP.
För högre volymer, e.g. för reklamfilm produktionen av cell extrakt, är fort löp ande Ultraljuds-system med en flödes cell reaktor mest passande. Den kontinuerliga och även flödet av det bearbetade materialet försäkrar en ännu ultraljudsbehandling. Alla parametrar för ultraljud sönderfall processen kan optimeras och anpassas till kraven i ansökan och den specifika cell material.
 
 
Exemplariska förfarande för ultraljud lyseringslösning av bakterie celler:

• Beredning av cell SUS pensionen: cell pellets måste vara helt upphängd i en buffertlösning genom homogenisering (Välj din buffertlösning som är kompatibel med följande analys, t. ex. specifik kromatografimetod). Tillsätt lysozymes och/eller andra tillsatser, om det behövs (de måste också vara förenliga med separation/rening innebär). Blanda/homogenisera lösningen försiktigt under mild ultraljudsbehandling tills fullständig SUS pension uppnås.
• Ultraljud lysis: placera provet i ett isbad. För cell störningar, Sonikera SUS pensionen vid 60-90 andra skurar (med hjälp av din ultrasonicator puls läge).
• Separation: Centrifugera lysat (t. ex. 10 min. vid 10 000 x g; vid 4degC). Separera supernatanten från cellpelleten noggrant. Supernatanten är den totala cellen lysate. Efter filtrering av supernatanten, får du en klargj橬一j vätska av det lösliga cell proteinet.

 
 
De vanligaste tillämpningarna för ultrasonicators i biologi och bio teknik är:

• Beredning av cell extrakt
• Störning av jäst, bakterier, växtceller, mjuk eller hård cellvävnad, nukleinmaterial
• Proteinextraktion
• Beredning och isolering av enzymer
• Produktion av antigener
• DNA-extraktion och/eller riktad fragmentering
• Liposom förberedelse