Ултразвучна производња високопречишћених бета-глукана шизофилана

Шизофилан је гљивични β-глукан са имуномодулаторним својствима. Да би имао високоактивно лековито дејство, шизофилан мора имати малу молекулску масу како би показао побољшану биорасположивост. Доказано је да ултразвучна обрада смањује молекулску масу шизофилана. Као поуздана и делотворна метода, соникација се може лако применити за производњу шизофилана мале молекулске масе.

Гљиве рода Schizophyllum и ултразвучна екстракција бета-глукана

Врсте гљива рода Schizophyllum расту у природи на дрвећу које трули након кишних сезона. Плодоносна тела сакупљају се током наредне сушне сезоне. Врсте рода Schizophyllum богате су биохемијским једињењима као што су глукани и стога се, нарочито у тропским земљама, користе као храна и лек. Због својих имуномодулаторних, антифунгалних, антинеопластичних и антивирусних својстава, Schizophyllum commune, позната и као расцепљена листићарка, привукла је пажњу биотехнолошких и фармацеутских компанија.
Полисахарид шизофилан, познат и као сизофиран, сонифилан или сизофилан, главни је β-глукан присутан у гљивама рода Schizophyllum, које су извор високоактивног биоактивног β-глукана шизофилана.
Гљиве Schizophyllum commune расту у природи на дрвећу, а мицелијум се може узгајати и у ферментационој подлози. За фармацеутску и козметичку примену, шизофилан мале молекулске масе знатно је делотворнији од шизофилана велике молекулске масе. Разлог је то што шизофилан мале молекулске масе показује значајно бољу биорасположивост и веће стопе апсорпције. Поред тога, шизофилан велике молекулске масе често је проблематичан у примени јер доводи до високе вискозности својих водених раствора.
Ултразвучно смањење величине је веома ефикасна и поуздана техника за смањење молекулске масе шизофилана, чиме се повећава квалитет молекула β-глукана.

Протокол за производњу шизофилана мале молекулске масе

Пошто шизофилан мале молекулске масе показује драстично бољу биорасположивост и својства при примени, истраживачки тим Смирноуа испитивао је ултразвучну обраду ради цепања и смањења величине молекула β-глукана шизофилана.

Ултразвучна обрада шизофилана

β-1.3(1.6)-глукан шизофилан (SPG) произведен је субмерзним узгајањем гљиве S. commune у биореактору уз употребу сахарозе као супстрата.
По завршетку узгајања, култивациона подлога је разблажена деминерализованом водом до концентрације шизофилана од 2 g/L и ултразвучно обрађена помоћу ултразвучног процесора UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Немачка) у режиму рециркулације при следећим параметрима и условима: проток медијума 50 mL/s, фреквенција 20 kHz, излазна снага 2000 W, сонотрода типа BS2d22, појачивач амплитуде типа B2-1.4 и амплитуда 100%. Температура култивационе подлоге на почетку соникације била је 25°C. Ултразвучно обрађена култивациона подлога (специфични унос енергије 100 Ws/mL) филтрирана је кроз дубински филтер Seitz HS800 под притиском од 1,5 bar на 40°C. Ултразвучно обрађен шизофилан (uSPG) за хемијску карактеризацију исталожен је из филтрата троструком количином изопропил-алкохола на лабораторијској температури и сушен на 60°C током 12h. Раствори uSPG за имунолошка испитивања припремљени су на следећи начин: (1) филтрат ултразвучно обрађене култивационе подлоге дијафилтриран је кроз PES касету Pall Centramate T-series површине 0,1m2 (гранична молекулска маса 100 kDa) при притиску од 0,8 bar, а дијафилтрација је настављена док проводљивост ретентата није достигла 20 μS/cm; (2) раствор је концентрован дијафилтрацијом до концентрације uSPG од 1 g/L и стерилисан аутоклавирањем на 120°C/20 min. Денатурисани uSPG припремљен је на сличан начин, с тим што је у филтрат култивационе подлоге додат NaOH у концентрацији од 0,2 M, а алкализовани раствор је пре дијафилтрације инкубиран 30 min на лабораторијској температури.

Аналитичке методе

Принос мицелијума процењен је гравиметријски: култивациони бујон је разблажен водом у односу 1:4, центрифугиран при 10.000 × g на 25°C током 20 min, а талог је испран троструком количином воде, осушен на 60°C и измерена му је маса. Шизофилан је исталожен из супернатанта троструком количином изопропил алкохола, осушен на 60°C током 24h, а његов принос је одређен гравиметријски. pO2 у култивационом бујону мерен је оптичком сондом Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Швајцарска).
Динамичка вискозност култивационог бујона мерена је уређајем HAAKE Visco Tester 6L са вретенима 1L и 2L на 4°C и при брзини ротације од 30 rpm. Брзина филтрације израчуната је на основу времена филтрације 500 mL култивационог бујона кроз дубински филтер Seitz HS800 (Pall, САД) димензија 200 × 200 mm, при притиску од 1,5 bar и температури од 40°C.
Молекулска маса uSPG мерена је методом SEC-MALLS на HPLC систему Alliance (Waters) са серијски повезаним колонама PL aquagel OH60 и PL aquagel OH40, а детектор miniDAWN TREOS (Wyatt) је концентрован дијафилтрацијом до концентрације uSPG од 1 g/L и стерилисан аутоклавирањем на 120°C/20 min. Денатурисани uSPG припремљен је на сличан начин, с тим што је NaOH додат филтрату култивационог бујона у концентрацији од 0,2 M, а алкализовани раствор је инкубиран 30 min на лабораторијској температури пре дијафилтрације.

Резултати:
Ултразвучна обрада примењена је директно на култивациони бујон S. commune са мицелијумом након 144 часа култивације како би се олакшала даља прерада SPG.
 
Карактеристике соницираног шизофилана: Ултразвучно обрађени шизофилан (uSPG) исталожен је алкохолом из филтрата култивационог бујона и окарактерисан. Методом SEC-MALLS процењено је да Mw uSPG износи око 1 MDa. Просечна молекулска маса шизофилана добијеног ферментацијом у течној подлози износи приближно 5 MDa, док при култивацији на чврстој подлози може достићи и до 10 MDa. Поређењем молекулске масе ултразвучно обрађеног шизофилана са молекулским масама нативног, необрађеног шизофилана може се уочити смањење молекулске масе од 5 до 10 пута услед ултразвучне обраде.
Соницирани полисахарид uSPG садржао је 0,7%w/w протеина и 1,0%w/w остатка након жарења. Хидролизат uSPG састојао се од више од 99% глукозе. Аналитички резултати указују на то да соникација насумично цепа главни ланац β-глукана, док бочни огранци остају нетакнути, чиме се смањују величина и молекулска маса шизофилана. Имунолошка испитивања uSPG који је практично без протеина и ендотоксина показала су да ултразвучно обрађени шизофилан ниске Mw има изражену имуномодулаторну активност.

 
Смањена вискозност: Ултразвучна обрада довела је до значајног смањења вискозности култивационог бујона. Током ултразвучне обраде вискозност култивационог бујона мењала се нелинеарно: на почетку ултразвучне обраде вискозност се брзо смањивала, али је касније то смањивање успорено. Специфични унос енергије од 100 Ws/mL био је довољан да се вискозност култивационог бујона смањи скоро 7 пута.

Побољшана филтрација: Култивациона течност третирана ултразвуком протицала је кроз филтер брже од нетретиране култивационе течности (специфични унос енергије 0 Ws/mL) са SPG високе молекулске масе. Поред тога, ултразвучна обрада је значајно смањила губитак производа током филтрације. Филтрат нетретиране култивационе течности са SPG високе молекулске масе (специфични унос енергије 0 Ws/mL) садржао је 0,3 ± 0,07 g/L SPG, док је концентрација SPG пре дубинске филтрације износила 2 g/L. Насупрот томе, филтрат култивационе течности обрађене ултразвуком уз специфични унос енергије од 100 Ws/mL садржао је SPG у концентрацији од 2,2 ± 0,2 g/L, што одговара готово нултом губитку производа.

Закључак: У свом закључку истраживачки тим резимира да је ултразвучна обрада ефикасна технологија за производњу шизофилана ниске молекулске масе, који се затим може користити у козметици и медицини. Када се примењује на целокупну култивациону течност са мицелијумом, ултразвучна обрада доноси одређене предности у производњи шизофилана. Она смањује губитке производа током даље прераде и омогућава производњу високо пречишћеног полисахарида захваљујући ефикасном коришћењу ултрафилтрације.
Поред тога, истраживачи су утврдили да се ултразвучна обрада шизофилана лако преноси на већи обим производње. Једна јединица ултразвучног дезинтегратора UIP2000hdT у пилот-постројењу обрадила је 1 литар култивационе течности за 110 s у проточном режиму. Продуктивност система може се лако повећати редним повезивањем додатних ултразвучних јединица.

 
Прочитајте више о једноставном повећању обима екстракције из гљива!
 

Ултразвучна опрема високих перформанси за обраду глукана из гљива

Фрагментација полисахарида као што су глукани, као и других биоактивних једињења као што су хитин и хитозан, може се поуздано спроводити помоћу ултразвучне опреме високих перформанси компаније Hielscher. Наши ултразвучни уређаји могу да остваре високе амплитуде, омогућавају прецизну контролу параметара процеса и могу да раде 24/7 под великим оптерећењем и у захтевним окружењима. Асортиман опреме компаније Hielscher Ultrasonics поуздано испуњава ове захтеве. Поред изванредних ултразвучних перформанси, ултразвучни уређаји компаније Hielscher одликују се високом енергетском ефикасношћу, што представља значајну економску предност – посебно када се користе у комерцијалној производњи великог обима.
Ултразвучни уређаји компаније Hielscher су системи високих перформанси који се могу опремити додацима као што су сонотроде, бустери, реактори или проточне ћелије како би се оптимално прилагодили потребама вашег процеса.
Дигитални екран у боји, могућност унапред подешених циклуса ултразвучне обраде, аутоматско бележење података на интегрисану SD картицу, даљинско управљање путем прегледача и многе друге функције обезбеђују највиши степен контроле процеса и једноставности употребе. Уз робусност и способност подношења великих оптерећења, ултразвучни системи компаније Hielscher представљају ваш поуздан ослонац у производњи.
Смањење молекулске масе β-глукана као што је шизофилан захтева снажан ултразвук како би се постигло циљано цепање и добио висококвалитетан крајњи производ шизофилана, који се може користити у фармацеутске сврхе.
 
Овде пронађите више информација о ултразвучној екстракцији бета-глукана из гљива, укључујући упутства корак по корак!
 
Табела у наставку даје преглед приближног капацитета обраде наших ултразвучних уређаја: