Ултразвучна производња високо пречишћених шизофилан бета-глукана
Схизопхиаллан је гљивични β-глукан са имуномодулирајућим својствима. За високо активне медицинске ефекте, шизофилан мора да има ниску молекуларну тежину да би показао побољшану биорасположивост. Доказано је да ултразвук смањује молекулску тежину шизофилана. Као поуздана и ефикасна метода, соникација се може лако применити за производњу шизофилана ниске молекуларне тежине.
Схизопхиллум печурке и ултразвучна екстракција бета-глукана
Врсте печурке Сцхизопхиллум расту у природи на пропадајућим стаблима након кишних сезона. Плодови се сакупљају у наредној сушној сезони. Врсте Сцхизопхиллум су богате биохемијским једињењима као што су глукани и стога се конзумирају посебно у тропским земљама као храна и лек. Због својих имуномодулаторних, антифунгалних, антинеопластичних и антивирусних својстава, Сцхизопхиллум цоммуне, такође позната као Сплитгилл печурка, привукла је биотехнолошке и фармацеутске компаније.
Полисахарид шизофилан, такође познат као сизофиран, сонифилан или сизофилан, је главни β-глукан који се налази у печуркама Сцхизопхиллум, које нуде високо ефикасан биоактивни β-глукан шизофилан.
Сцхизопхиллум цоммуне печурке расту у природи на дрвећу, мицелијум се такође може узгајати у ферментационом бујону. За фармацеутске и козметичке примене, шизофилан ниске молекуларне тежине је много ефикаснији од шизофилана високе молекулске тежине. Ово је због чињенице да шизофилан ниске молекуларне тежине показује значајно бољу биорасположивост и стопе апсорпције. Поред тога, шизофилан високе молекуларне тежине је често проблематичан у примени јер доводи до високог вискозитета његових водених раствора.
Ултразвучно смањење величине је веома ефикасна и поуздана техника за смањење молекулске тежине шизофилана, чиме се повећава квалитет молекула β-глукана.

Ултрасоникатор УИП2000хдТ успешно је коришћен за смањење молекулске тежине шизофилана, гљивичног β-глукана
Протокол за производњу шизофилана ниске молекуларне тежине
Пошто шизофилан молекуларне тежине показује драстично бољу биодоступност и својства примене, истраживачки тим Смирноуа је истраживао ултразвучну обраду за цепање и смањење величине молекула β-глукана шизофилана.
Ултразвук шизофилана
β-1.3(1.6)-Глуцан схизопхиллан (СПГ) је произведен потопљеном култивацијом С. цоммуне гљиве у биореактору користећи сахарозу као супстрат.
Након завршетка култивације, бујон културе је разблажен деминерализованом водом до концентрације шизофилана од 2 г/Л и ултразвучно обрађен са ултразвучни процесор УИП2000хдТ (Хиелсцхер Ултрасоницс ГмбХ, Немачка) у режиму рециклаже при следећим параметрима и условима: средњи проток 50 мЛ/с, фреквенција 20 кХз, излазна снага 2000 В, тип сонотроде БС2д22, бустер тип Б2-1.4 и амплитуда 100%. Температура бујона културе на почетку соникације била је 25°Ц. Ултразвучна бујон културе (специфични енергетски унос 100 Вс/мЛ) је филтриран кроз Сеитз ХС800 дубински филтер под притиском од 1,5 бара на 40°Ц. Ултразвучни шизофилан (уСПГ) за хемијску карактеризацију исталожен је из филтрата троструком количином изопропил алкохола на лабораторијској температури и сушен на 60°Ц током 12 х. УСПГ раствори за имунолошке студије су припремљени на следећи начин: (1) ултразвучни филтрат бујона културе је дијафилтриран кроз 0,1 м2 Палл Центрамате Т-серије ПЕС касету (100 кДа цут-офф) на 0,8 бара и дијафилтрација је настављена све док проводљивост ретентата није била 20 μС/цм; (2) раствор је концентрован дијафилтрацијом до концентрације уСПГ од 1 г/Л и стерилисан аутоклавом на 120°Ц/20 мин. Денатурисани уСПГ је припремљен на сличан начин, само што је у филтрат чорбе културе додат НаОХ у концентрацији 0,2 М и алкализовани раствор је инкубиран 30 мин на лабораторијској температури пре дијафилтрације.
аналитичке методе
Принос мицелија је процењен гравиметријски: бујон културе је разблажен водом 1:4, центрифугиран 10000 × г на 25°Ц 20 мин, талог је испран троструком количином воде, осушен на 60°Ц и измерен. Шизофилан је преципитиран из супернатанта троструком количином изопропил алкохола, сушен на 60°Ц током 24х и његов принос је одређен гравиметријски. пО2 у бујону културе мерен је оптичком сондом Хамилтон-Висиферм ДО 120 (Хамилтон, Швајцарска).
Динамичка вискозност бујона културе мерена је на ХААКЕ Висцо Тестер 6Л са вретенима 1Л и 2Л на 4°Ц и брзином ротације од 30 рпм. Брзина филтрирања је израчуната из времена филтрације 500 мЛ бујона културе кроз филтер дубине 200 × 200 мм Сеитз ХС800 (Палл, САД) на притиску од 1,5 бара и 40°Ц.
Молекуларна тежина уСПГ је мерена помоћу СЕЦ-МАЛЛС на ХПЛЦ систему Аллианце (Ватерс) са серијски повезаним ПЛ акуагел ОХ60 и ПЛ акуагел ОХ40 колонама, а детектор миниДАВН ТРЕОС (Виатт) је концентрисан дијафилтрацијом до концентрације уСПГ 1 г/Л и стерилисан помоћу аутоклавирање на 120°Ц/20 мин. Денатурисани уСПГ је припремљен на сличан начин, само што је у филтрат чорбе културе додат НаОХ у концентрацији 0,2 М и алкализовани раствор је инкубиран 30 мин на лабораторијској температури пре дијафилтрације.

УИП2000хдТ за смањење молекулске тежине шизофилана

ултрасоницатор УП400Ст (400В, 24кХз) за обраду шизофилана
Третман ултразвуком је примењен директно на С. цоммуне 144-часовни бујон културе са мицелијумом да би се олакшала обрада СПГ низводно.
Карактеристике Соницатед Схизопхиллан: Ултразвучни шизофилан (уСПГ) је исталожен из филтрата бујона културе алкохолом и окарактерисан. СЕЦ-МАЛЛС је проценио да је Мв уСПГ око 1 МДа. Просечна молекулска тежина шизофилана из течне ферментације је приближно 5 МДа, док у чврстом стању може достићи и до 10 МДа. Упоређујући молекулску тежину ултразвучног шизофилана са молекуларном тежином природног нетретираног шизофилана, може се приметити 5- до 10 пута смањена молекулска тежина услед ултразвучне обраде.
Соницирани полисахарид уСПГ је садржао 0,7% в/в протеина и 1,0% в/в остатка након паљења. уСПГ хидролизат се састојао од глукозе са више од 99%. Аналитички резултати показују да ултразвук насумично цепа кичму β-глукана, а бочне гране остају нетакнуте, чиме се смањују величина и молекуларна тежина шизофилана. Имунолошке студије на уСПГ-у, у суштини без протеина и ендотоксина, показале су да ултразвучни шизофилан ниске Мв има изражену имуномодулаторну активност.

АФМ снимање (на врху) и топографски профил (на дну) природног ултразвучног шизофилана. Мерење у полуконтактном режиму са резолуцијом 512 × 512 пкс2. Услови: златни премаз, константа опруге 15,3 Н/м, угао врха конуса <22°.r />(picture and study: ©Smirnou et al., 2017)
Смањени вискозитет: Ултразвук је довео до значајног смањења вискозитета бујона културе. Током ултразвучне обраде, вискозност бујона за културу се мењала нелинеарно: смањење вискозности је било брзо на почетку ултразвучне обраде, али је касније успорило. Специфични унос енергије од 100 Вс/мЛ био је довољан да смањи вискозитет бујона културе скоро 7 пута.

Ултразвучна обрада бујона културе С.цоммуне, који је добијен култивацијом гљиве у биореактору током 144х. Утицај периода ултразвучне обраде (изражен као специфичан унос енергије у Вс/мЛ) на брзину дубинске филтрације бујона културе (црни ступац) и концентрацију шизофилана (СПГ) у филтрату (сива колона). Услови ултразвука: Ултразвучни процесор УИП2000хд (20 кХз, 2000 В), сонотрода БС2д22, бустер Б2-1.4, амплитуда 100%, брзина протока 50 мЛ/с.
(слика и студија: ©Смирноу ет ал., 2017)
Побољшана филтрација: Ултразвучно третирана бујон за културу пролазила је кроз филтер брже од нетретиране културе бујона (специфични енергетски унос 0 Вс/мЛ) са високомолекуларним СПГ. Осим тога, ултразвук је значајно смањио губитак производа током филтрације. Филтрат нетретиране културе бујона са високомолекуларним СПГ (специфични енергетски унос 0 Вс/мЛ) је садржао 0,3 ± 0,07 г/Л СПГ, док је концентрација СПГ пре дубинске филтрације била 2 г/Л. Насупрот томе, филтрат 100 Вс/мЛ ултразвучне културе садржао је СПГ у концентрацији 2,2 ± 0,2 г/Л, што одговара скоро нултом губитку производа.

Ултразвучна обрада бујона културе С.цоммуне, који је добијен култивацијом гљиве у биореактору током 144х. Утицај периода ултразвучне обраде (изражен као специфичан унос енергије у Вс/мЛ) на брзину дубинске филтрације бујона културе (црни ступац) и концентрацију шизофилана (СПГ) у филтрату (сива колона). Услови ултразвука: Ултразвучни процесор УИП2000хд (20 кХз, 2000 В), сонотрода БС2д22, бустер Б2-1.4, амплитуда 100%, брзина протока 50 мЛ/с.
(слика и студија: ©Смирноу ет ал., 2017)

АФМ снимање (на врху) и топографски профил (на дну) денатурисаног ултразвучног шизофилана. Мерење у полуконтактном режиму са резолуцијом 512 × 512 пкс2. Услови: златни премаз, константа опруге 15,3 Н/м, угао врха конуса < 22°.
(слика и студија: ©Смирноу ет ал., 2017)
Поред тога, истраживачи су открили да је ултразвучна обрада шизофилана лако скалабилна. Једна јединица ултразвучног дезинтегратора пилот постројења УИП2000хдТ обрадила је 1 литар бујона за културу за 110 с у режиму протока. Продуктивност система се лако може повећати узастопним повезивањем додатних ултразвучних јединица.
Прочитајте више о једноставном повећању екстракције печурака!
Ултразвучна опрема високих перформанси за обраду гљивичних глукана
Фрагментација полисахарида као што су глукани као и других биоактивних једињења као што су хитин и хитозан може се поуздано процесирати са Хиелсцхер ултразвучном опремом високих перформанси. Наши ултрасоникатори могу да испоруче велике амплитуде, нуде прецизну контролу над параметрима процеса и могу да раде 24/7 под великим оптерећењем и у захтевним окружењима. Опсег опреме Хиелсцхер Ултрасоницс поуздано испуњава ове захтеве. Поред изванредних ултразвучних перформанси, Хиелсцхер ултрасоникатори се могу похвалити високом енергетском ефикасношћу, што је значајна економска предност – посебно када се користе у комерцијалној производњи великих размера.
Хиелсцхер ултрасоникатори су системи високих перформанси који могу бити опремљени додацима као што су сонотроде, појачивачи, реактори или проточне ћелије како би на оптималан начин одговарали вашим потребама процеса. Са дигиталним дисплејом у боји, обезбеђена је опција за унапред подешена соникација, аутоматско снимање података на интегрисану СД картицу, даљинска контрола претраживача и многе друге функције, највећа контрола процеса и једноставност за корисника. Упарени са робусношћу и великим капацитетом носивости, Хиелсцхер ултразвучни системи су ваш поуздан радни коњ у производњи. Смањење молекуларне тежине β-глукана као што је шизофилан захтева моћан ултразвук да би се добио циљано цепање и коначни шизофилан производ високог квалитета, који се може користити у фармацеутској примени.
Пронађите више информација о ултразвучном екстракцији бета-глукана из печурака, укључујући упутства корак по корак овде!
Табела у наставку даје вам индикацију приближних капацитета обраде наших ултразвучних апарата:
Батцх Волуме | Проток | Препоручени уређаји |
---|---|---|
1 до 500 мл | 10 до 200 мл/мин | УП100Х |
10 до 2000 мл | 20 до 400 мл/мин | УП200Хт, УП400Ст |
0.1 до 20Л | 0.2 до 4Л/мин | УИП2000хдТ |
10 до 100 л | 2 до 10 л/мин | УИП4000хдТ |
на | 10 до 100 л/мин | УИП16000 |
на | већи | кластер оф УИП16000 |
Контактирајте нас! / Питајте нас!
Литература / Референце
- Smirnou, Dzianis; Knotek, Petr; Nesporova, Kristina; Smejkalova, Daniela; Pavlik, Vojtech; Franke, Lukas; Velebny, Vladimir (2017): Ultrasound-assisted production of highly-purified β-glucan schizophyllan and characterization of its immune properties. Process Biochemistry 2017.
- Zhong, Kui; Tong, Litao; Liu, Liya; Zhou, Xianrong; Liu, Xingxun; Zhang, Qi; Zhou, Sumei (2015): Immunoregulatory and antitumor activity of schizophyllan under ultrasonic treatment. International Journal of Biological Macromolecules, 80, 2015. 302–308.
- Kengo Tabata, Wataru Ito, Takemasa Kojima, Shozo Kawabata, Akira Misaki (1981): Ultrasonic degradation of schizophyllan, an antitumor polysaccharide produced by Schizophyllum commune fries. Carbohydrate Research, Volume 89, Issue 1, 1981. 121-135.
Чињенице које вреди знати
шизофилан – Гљивични β-глукан
Шизофилан, такође познат као сизофиран, СПГ, сонифилан, сизофилан, је неутрални екстрацелуларни полисахарид који производи гљива Сцхизопхиллум цоммуне Фриес, врста печурке Басидиомицетес. Шизофилан је растворљиви бета-Д-глукан, чији тачан механизам деловања још није у потпуности разјашњен, али овај специфични β-глукан показује имуномодулирајуће и антитуморске ефекте. Иако тачан механизам деловања сизофирана тек треба да буде у потпуности разјашњен, чини се да овај агенс стимулише имуни систем повећавајући производњу цитокина, активирајући макрофаге и Лангерхансове ћелије и повећавајући активност полиморфонуклеарних леукоцита (ПМЛ) и природних ћелија убица (НК). Сизофиран је био прилично неефикасан против рака желуца, али је продужено време преживљавања код пацијената са раком главе и врата. Код рака грлића материце, Сизофиран је продужио преживљавање и време до рецидива за случајеве стадијума ИИ, али не и за стадијум ИИИ, и показао је додатну ефикасност када се убризгава директно у туморску масу. Сонифилан се користи као модификатор биолошког одговора (БРМ) са терапијом зрачењем за лечење рака у Јапану. Покренут је за рак грлића материце у Јужној Кореји 1998. године.

Хиелсцхер Ултрасоницс производи ултразвучне хомогенизаторе високих перформанси од лаб до индустријска величина.