Ултразвучна синтеза пептида применом технике TAGGING

Синтеза пептида је камен темељац фармацеутског истраживања и развоја, али конвенционалне методе – синтеза пептида на чврстој фази (SPPS) и класично спајање у раствору – и даље захтевају много рада, расипају реагенсе и тешко се преносе на веће размере. Ефикаснија алтернатива настала је комбиновањем две ортогоналне стратегије: технике TAGGING (привремена сидрена група) за изградњу пептида у раствору и ултразвучне (сонохемијске) обраде за убрзавање корака спајања, уклањања заштитних група и обраде реакционе смеше. Заједно омогућавају производњу терапијских пептида у грамским до великих производних размера – као што је липопептид липобактин са антибиотским и антиканцерским дејством – уз високу чистоћу, мање захтева за пречишћавањем и драстично мањи број ручних операција.

Које предности доноси ултразвучна синтеза пептида?

• Економичност синтезе у раствору: Реакције се одвијају у раствору уз знатно мању потрошњу аминокиселина него при синтези пептида на чврстој фази
• Пречишћавање засновано на филтрацији: Пептид везан за TAG таложи се у поларним растварачима, па се интермедијери изолују једноставном филтрацијом – без потребе за колонском хроматографијом или карактеризацијом после сваког корака.
• Огромна уштеда рада: Изостављање међукорачног пречишћавања и спектралних провера штеди знатан број радних сати током целокупног поступка синтезе.
• Сонохемијско убрзавање: Соникација скраћује сваки кључни корак – уклањање Fmoc заштитне групе, спајање бочних ланаца, циклизацију и уклањање свих заштитних група – без нарушавања селективности.
• Високи приноси, висока чистоћа: Свако спајање фрагмената и завршно састављање липобактина одвијају се уз висок принос; уклањањем свих заштитних група добија се циљно једињење уз принос од ~83 %.
• Спремност за производњу у великим размерама: Техника TAGGING изричито је описана као техника која омогућава добијање пептида највеће чистоће у великим размерама, што је чини практичним путем до грамских и килограмских количина терапијски значајних липопептида.
• Потпуна компатибилност метода: Приступ је потпуно компатибилан са конвенционалном SPPS и хемијом у раствору, па се постојеће стратегије примене заштитних група (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) и реагенси за спајање (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) примењују без измена.

Шта је техника TAGGING?

У приступу TAG, пептидни фрагмент се ковалентно везује за уклоњиву сидрену групу налик смоли (TAG), која остаје у раствору. То омогућава да се растућим ланцем рукује као пептидом на чврстој фази, али у течној фази:

• После сваког спајања или уклањања заштитних група, пептид везан за TAG издваја се у чврстом стању једноставном филтрацијом или таложењем у поларним/антирастварачким срединама, док се растворљиве нечистоће и споредни производи уклањају испирањем.
• Пошто пептид остаје везан за линкер, колонска хроматографија и потпуна карактеризација сваког интермедијера углавном се изостављају, чиме се знатно штеде време и људски рад.
• Реакције се могу изводити у раствору, уз далеко мању потрошњу аминокиселина него код SPPS, а крајњи производ се ослобађа одвајањем TAG групе пред крај синтезе.

 
За липобактин су у ретросинтези коришћена три фрагмента – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH и липидни фрагмент C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH – спојена стратегијом кондензације фрагмената ради добијања дугог пептида уз веома високе приносе. (уп. Ramya et al., 2025)

Потпуна синтеза пептида липобактина уз помоћ TAG убрзава се соникацијом.
(Студија: Ramya et al., 2025)

Како соникација побољшава синтезу пептида у раствору

Ултразвучна обрада се користи за интензивирање и скраћивање кључних корака у раствору. У синтези липобактина коју су описали Ramya et al. (2025), соникација се примењује за:

Пошто TAG хемија већ даје интермедијере у облику чврстих материја које се могу филтрирати, ултразвучна обрада и TAGGING се допуњују: ултразвук убрзава пренос масе, мешање и кинетику реакције, док сидрена група одржава пептид у чврстом облику који се може издвојити, омогућавајући чист поступак са малом потребом за хроматографијом.

Једноставно повећање обима производње пептида високе чистоће уз соникацију

Чест изазов при преношењу процеса производње пептида и пептидних лекова са лабораторијског стола у производњу јесте очување сонохемијског ефекта при већим запреминама и континуираном протоку. Hielscher то решава континуираним распоном ултразвучних процесора од лабораторијског до пуног индустријског обима, који обезбеђују валидирану, репродуктивну снагу и документовану контролу процеса.
 

Индустријски соникатор UIP4000hdT (4000W, 20kHz) за синтезу пептида побољшану ултразвуком

Литература / Референце

• M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
• Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
• Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
• M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.