Синтеза пептида на чврстој фази – ефикаснија уз соникацију
Синтеза пептида на чврстој фази (SPPS) уобичајена је метода синтезе пептида. Ултразвучна обрада је поуздано средство за интензивирање синтезе пептида на чврстој фази, што доводи до већих приноса, побољшане чистоће, одсуства рацемизације и значајно веће брзине реакције. Hielscher Ultrasonics нуди различита ултразвучна решења за синтезу, одвајање и растварање пептида.
Ултразвучна синтеза пептида на чврстој фази
Ултразвучна обрада се већ широко примењује као метода интензивирања у органској синтези и добро је позната по својим предностима, као што су драстично скраћено време реакције, већи приноси, мање споредних производа, покретање реакционих путева који се не могу остварити на друге начине и/или боља селективност. Велике користи могу се постићи и увођењем соникације у реакције синтезе пептида. Резултати истраживања показали су да синтеза пептида потпомогнута ултразвуком омогућава оптимизован принос пептида високе чистоће, без рацемизације, за кратко време реакције.
- Високи приноси пептида
- Значајно бржа синтеза
- Већа чистоћа пептида
- Без рацемизације
- Паралелна синтеза различитих пептида
- Могућност скалирања на било коју запремину
Чашасти ултразвучни рог за равномерну соникацију више реакционих посуда ради побољшања синтезе пептида.
Графички приказ Мерифилдове синтезе пептида на чврстој фази. Ултразвучна обрада се користи за подстицање и побољшање реакције синтезе, као и за одвајање синтетисаних пептида од смоле.
Графички приказ: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Студија | Испитивани пептид(и) | Време реакције (класична синтеза у поређењу са US-SPPS) | Чистоћа сировог производа (класична синтеза у поређењу са US-SPPS) | Рацемизација и споредне реакције | Кључни закључци |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Мет-енкефалин, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-ендорфин | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Нису уочене за Cys/His, чак ни на 70°C | ~7–12 пута бржа синтеза; знатна побољшања чистоће, нарочито код секвенци склоних агрегацији, као што је TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-мер), Pep2 (9-мер), Pep3 (25-мер) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (само уз ултразвук) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Није испитивано; забележено је благо смањење чистоће Pep2 | 14 пута краће време за Pep1; приноси сировог производа значајно су повећани. |
| Merlino et al. (2019) | Моделни пентапептиди, пептиди до 44-мера, „тешке секвенце“ (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (модел) | 84% → 93% (модел); значајно већа него при термичком загревању (~45°C) | Нема значајног повећања удела енантиомера Cys/His | Веома ефикасна за тешке секвенце и секвенце склоне агрегацији; омогућава смањење вишка реагенаса уз одржавање високе чистоће. |
Синтеза пептида на чврстој фази побољшана ултразвуком
Синтеза пептида на чврстој фази (SPPS) је хемијска реакција која омогућава изградњу пептидног ланца узастопним реакцијама деривата аминокиселина на нерастворљивом порозном носачу. Међутим, традиционална синтеза пептида на чврстој фази је релативно неефикасан и спор процес. Зато је ултразвучно интензивирање синтезе пептида високо цењено средство за ефикаснију и бржу синтезу пептида.
Silva et al. (2021) упоредили су „класичну“ синтезу пептида на чврстој фази (SPPS) уз употребу флуоренилметоксикарбонилне (Fmoc) групе са SPPS потпомогнутом ултразвуком (US), на основу припреме три пептида: пептида Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2), специфичног за рецептор фактора раста фибробласта 3 (FGFR3), и нових пептида Pep2 (RQMATADEA-NH2) и Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS потпомогнута ултразвуком довела је до 14 пута краћег времена изградње пептида Pep1 и 4 пута краћег времена изградње пептида Pep2 у поређењу са „класичном“ методом. Занимљиво је да је SPPS потпомогнута ултразвуком дала Pep1 веће чистоће (82%) него „класична“ SPPS (73%). Значајно скраћење времена, у комбинацији са постигнутом високом чистоћом сировог пептида, подстакло је истраживачки тим да примени SPPS потпомогнуту ултразвуком на велики пептид Pep3, који садржи велики број хидрофобних аминокиселина и хомоолигомерних секвенци. Посебно је значајно што је синтеза овог 25-мерног пептида остварена за мање од 6 сати (347 min), уз умерену чистоћу (приближно 49%).
Бржа синтеза пептида на чврстој фази уз ултразвучно мешање.
(Студија и анализа: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) такође су спровели свеобухватну студију утицаја ултразвука на синтезу пептида на чврстој фази засновану на Fmoc стратегији, која је омогућила синтезу различитих биолошки активних пептида (до 44-мера), уз знатну уштеду материјала и скраћење времена реакције. Показали су да ултразвучни третман није појачао главне споредне реакције и да је побољшао синтезу пептида са „тешким секвенцама“, чиме се синтеза пептида на чврстој фази подстакнута ултразвуком (US-SPPS) сврстава међу савремене високоефикасне стратегије синтезе пептида.
Доступност система високих перформанси за ултразвучну (соничну) синтезу пептида омогућава значајно повећање брзине синтезе и чистоће сирових производа. (уп. Wołczański et al., 2019)
Испитивање рацемизације. Поређење релевантних 1H NMR спектара моделних пептида синтетисаних ручно класичним поступком на собној температури и ултразвучном методом на повишеној температури. Хемијски помаци α-протона His и Cys и метиленске групе Acm (леви панели), као и ɣ-метил протона Val (десни панели), показују да ултразвучни третман на 70°C не изазива рацемизацију.
(Студија и анализа: Wołczański et al., 2019)
Ултразвучно одвајање пептида
После синтезе пептида на чврстој фази (SPPS), синтетисани пептиди морају се одвојити од полимерних смола. Овај корак је познат и као уклањање заштитних група. Када се упореде уобичајено протресање и ултразвучни третман за одвајање пептида од смоле, метода протресања захтева приближно 1 сат, док се ултразвучно одвајање може обавити за 15 до 20 min. Ултразвучно одвајање пептида може се применити на одвајање заштићених аминокиселина и пептида везаних за полистиренске смоле преко бензилних естарских веза.
Ултразвучно одвајање пептида од полистиренске смоле даје високе приносе пептида високе чистоће, без рацемизације, у брзом поступку.
(студија и графички приказ: ©Anuradha и Ravindranath, 1995)
Реактор са ултразвучним мешањем за побољшану и убрзану синтезу пептида. На слици је приказан ултразвучни уређај UP200St у стакленом реактору са мешалицом.
Ултразвучни уређаји високих перформанси за синтезу пептида
Hielscher Ultrasonics нуди различита ултразвучна решења за директну и индиректну соникацију. Снажни ултразвучни процесори којима се може прецизно управљати доводе тачно одговарајућу количину ултразвучне енергије у реакциону посуду. Без обзира на то да ли као посуде за синтезу користите шприцеве, епрувете, плоче са више бунарчића или стаклене реакторе, Hielscher Ultrasonics нуди најпогоднији ултразвучни уређај за вашу примену у области пептида.
- пептида по мери
- производњу пептида у великим размерама
- библиотеке пептида
Многе синтезе пептида изводе се у шприцевима (нпр. у шприц-реакторима са фритом). Ултразвучни уређај Hielscher за мешање садржаја шприцева соницира раствор пептида преносећи ултразвучне таласе кроз зид шприца у течност. Ултразвучни уређај за мешање садржаја шприцева једно је од најпопуларнијих ултразвучних решења за синтезу пептида потпомогнуту ултразвуком.
Чашасти ултразвучни рог погодан је за соникацију до 5 реакторских посуда, док VialTweeter може да прими до десет реакционих епрувета и додатно пет већих посуда помоћу прибора за причвршћивање стезаљкама.
За друге типове реактора, као што су реактори Merrifield или Kamysz за синтезу на чврстој фази, као и за друге полипропиленске или боросиликатне посуде и реакторе, Hielscher нуди ултразвучне уређаје за индиректну и директну соникацију са прилагођеним причвршћивањем стезаљкама или прирубницом.
Наравно, већи стаклени реактори са мешањем, нпр. за синтезу у раствору, могу се лако опремити ултразвучним сондама (познатим и као сонотроде или ултразвучни рогови) било које величине.
- различити типови ултразвучних уређаја
- директна и индиректна соникација
- прецизна контрола интензитета
- прецизна контрола температуре
- континуирани или пулсни ултразвук
- паметне функције, програмабилни уређаји
- доступни за било коју запремину
- линеарна скалабилност
За синтезу пептида на чврстој фази у плочама са више бунарчића/микротитарским плочама, UIP400MTP је идеалан уређај. Ултразвучна кавитација се индиректно и равномерно преноси у бројне бунарчиће са узорцима ради постизања врхунског преноса масе и реакције синтезе. Погледајте видео испод да бисте видели ултразвучни уређај за микроплоче UIP400MTP у раду!
Контактирајте нас! / Питајте нас!
Hielscher Ultrasonics производи ултразвучне хомогенизаторе високих перформанси за мешање, дисперговање, емулговање и екстракцију у лабораторијским, пилотским и индустријским размерама.
Корисне чињенице о ултразвучној синтези пептида
Шта су пептиди?
Пептиди су једињења у којима је више аминокиселина повезано амидним везама, такозваним пептидним везама. Када су повезани у сложене структуре – које се обично састоје од 50 или више аминокиселина – ове велике пептидне структуре називају се протеинима. Пептиди су основни градивни елементи живота и обављају бројне функције у организму.
Како се одвија синтеза пептида?
У органској хемији, молекуларној биологији и наукама о животу, синтеза пептида је процес добијања пептида. Пептиди се хемијски синтетишу реакцијом кондензације карбоксилне групе једне аминокиселине са амино-групом друге аминокиселине. Обично се примењују стратегије са заштитним групама како би се избегле нежељене споредне реакције са различитим бочним ланцима аминокиселина.
Хемијска (in vitro) синтеза пептида најчешће почиње спајањем карбоксилне групе долазеће аминокиселине (C-терминуса) са N-терминусом растућег пептидног ланца. За разлику од ове синтезе у смеру од C ка N, природна биосинтеза протеина у облику дугих пептида у живим организмима одвија се у супротном смеру. То значи да се у биосинтези N-терминус долазеће аминокиселине повезује са C-терминусом протеинског ланца (од N ка C).
Већина истраживачких и развојних протокола за синтезу пептида заснива се на методама на чврстој фази, док се методе синтезе у раствору примењују у индустријској производњи пептида у великим размерама.
Који је тренутни највиши ниво развоја синтезе пептида?
SUS-SPPS (одржива синтеза пептида на чврстој фази потпомогнута ултразвуком) доказано своди процес на само два корака по циклусу (комбиновано спајање/блокирање/уклањање заштитних група + једно испирање), чиме се значајно смањују потрошња растварача и потребно време. (уп. Mottola et al., 2025)
TAPS уз помоћ ултразвука је комбинација у развоју са доказаним успехом у тоталним синтезама (нпр. липобактина), коју организације за уговорни развој и производњу (CDMO) испитују за производњу активних фармацеутских супстанци (API).
Откријте предности синтезе пептида методом TAGGING уз помоћ ултразвука!
Континуална обрада се испитује као додатно унапређење – описане су платформе за континуалну синтезу у једном реакционом суду уз помоћ силилованих ознака.
Ова област се креће ка принципима зелене хемије, при чему и ултразвук и TAPS доприносе смањеној употреби растварача, мањим количинама реагенаса и побољшаној одрживости.
Литература / Референце
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics производи ултразвучне хомогенизаторе високих перформанси од лабораторијских до индустријских димензија.