Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) je efikasan metod za zaražavanje biljnih ćelija stranim genima koristeći Agrobakterijum kao transporter. Ultrazvučna kavitacija izaziva sonoporaciju, koja se može opisati kao ciljano mikro-ranjavanje biljnog tkiva. Putem ovih ultrazvučnih stvara mikro rane, DNK i DNK vektori se mogu efikasno transportovati u matricu ćelija.

sonoporacija – Ultrasonično poboljšana transformacija ćelija

Kada se niskofrekventni ultrazvuk (oko 20kHz) primeni na obustavu ćelija, efekti akustične kavitacije izazivaju prolaznu membranu permeabilizacije na ćelijskim tkivima. Ovaj ultrazvučni efekat poznat je kao sonoporacija i koristi se za prenos gena u ćelije ili tkiva.
Prednosti ultrazvučnosti zasnivaju se na njegovom ne-termalnom mehaničkom radnom principu, što sonikaciju čini često raznovrsnijom i manje zavisnom od tipova ćelija. Svestrana primena sonoporacije otvara mogućnost korišćenja transgenećih biljaka, koje imaju značajan potencijal u bioprodukciji složenih ljudskih terapeutskih proteina. Takvim bioreaktorima biljnog porekla može se lako genetski manipulisati, sprečiti potencijalnu kontaminaciju ljudskim patogenima, ne oštećuju transformaciju posredujući bakterijama (npr. Agrobakterijum), i jeftina su, efikasnosti metoda bio-sinteze.

Transformacija ćelija uz pomoć ultrazvuka

Sonication je tehnika koja primenjuje niskofrekventne ultrazvučne talase za agitovanje čestica u rastvoru, za mešanje rastvora, čime se povećava stopa masovnog prenosa i raspleta. Istovremeno, sonicija može da ukloni rastvorljive gasove iz tečnosti. U biljnoj transformaciji, sonicija će prouzrokovati formiranje mikrovundova na biljnom tkivu i poboljšati isporuku gole DNK u biljni protoplast.

Za genetsku transformaciju, Transformacija uz posredovanje Sonication-Assisted Agrobacterium (SAAT) je poželjna metoda i ima znatno veću efikasnost od sonikacije koja se koristi za prenos golih DNK i DNK vektora direktno u protoplast. Brojne studije su pokazale da sonication asistiranu transformaciju (SAAT) uz posredovanje Agrobacterium-a može da se koristi za izazivanje mehaničkog poremećaja i formiranje rana na biljnim ćelijama ultrazvučnim talasima i rezultujućom akustičnom kavitacijom. Kratak ultrazvučni tretman stvara mikro rane na površini objašnjenja. Kako će ranjene ćelije dozvoliti prodor Agrobakterijuma u dublji deo biljnih tkiva, čime će se povećati verovatnoća da se biljne ćelije zaraze. Pored toga, lučena fenolna jedinjenja pospešuju transformaciju. Ultrazvučno generisane mikro rane čine prodor objašnjenja bakterijama takođe izvodljivijim. SAAT je uspešno korišćen za genetsku transformaciju kod biljnih vrsta koje se posebno smatraju otpornim na Agrobakterijum.
Biti veoma jednostavan i jeftin metod, kao i značajno poboljšanje prenosa gena u kojima posreduje Agrobacterium su glavne prednosti SAAT-a. Osim uspešne primene SAAT-a u transformaciji Chenopodium rubruma L. i Beta vulgaris L., ovaj pristup je primenjen i u proizvodnji rekombinantnih Escherichia coli divljeg tipa toplotno-laboratorijskog holotoksina i Escherichia coli mutant LT vakcine adjuvants u Nikotiana tabacumu, u kojoj su otkriveni najviši sistemski LT-B specifični IgG titresi.
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

Opšta procedura prenosa gena putem sonoporacije u biljnim ćelijama

1. Priprema genetskog materijala: Počnite tako što ćete pripremiti genetski materijal koji želite da uvedete u biljne ćelije. Ovo bi mogla biti plasmidna DNK, RNK ili druge nukleiиne kiseline.
2. Izolacija biljnih ćelija: Izolujte biljne ćelije koje želite da gađate. U zavisnosti od vašeg eksperimenta, ove ćelije mogu biti izolovane od biljnih tkiva ili kultura.
3. Obustavljanje ćelije: Obustavite biljne ćelije u odgovarajućem medijumu ili baferu. Ovo je od suštinskog značaja da bi se osiguralo da ćelije budu zdrave i u stanju koje pogoduje uzdizačima gena.
4. Podesite Sonicator: Pripremite sononikator tipa sonication po parametrima pre podešavanja sonication, kao što su amplitude, vreme, energija i temperatura. Uronite ultrazvučnu sondu u ćelijsku suspenziju.
5. Soniranost: Započni proceduru sonikacije. Brze oscilacije vrha sonde generišu mehuriće kavitacije u tečnosti. Ovi mehurići se šire i urušavaju zbog ultrazvučnih talasa, stvarajući mehaničke sile i mikrostreaming u ogibljenju.
6. Sonoporacija: Mehaničke sile i mikrostreaming generisani kavitacijom stvaraju privremeno pore i rupe u membranama biljnih ćelija. Genetski materijal prisutan u suspenziji može da uđe u biljne ćelije kroz ove pore.
7. Inkubacije: Nakon tretmana sonoporacije, inkubirajte biljne ćelije kako biste im omogućili da se oporave i stabilizuju membrane. Ovo je ključni korak da se osigura opstanak ćelija i uspešan prenos gena.

Prenos gena preko agrobakterijuma ili liposoma

Postoje dva uobičajena oblika za transfektivnu biljnu ćeliju. Koriste ili agrobakterijum, rod Gram-negativnih bakterija, ili liposome kao nosioca genetskog materijala.

• Agrobacterium-Mediated Sonoporation: Agrobakterijum tumefaciens je bakterija koja se obično koristi u biljnom genetskom inženjeringu. Ovom metodom, plazmidni DNK koji sadrži željeni gen uvodi se u Agrobakterijum, koji se zatim meša sa biljnim ćelijama. Suspenzija ćelije je podvrgnuta sonoporaciji pomoću sononika tipa sononika. Ultrazvučna energija pospešuje prenos genetskog materijala iz Agrobakterijuma u biljne ćelije. Ova metoda se široko koristi za genetsku modifikaciju biljaka.
• Liposome-Mediated Sonoporation: Liposomi su vesnici na bazi lipida koji mogu da nose genetski materijal. Ovom metodom, liposomi natovareni plazmidnom DNK ili drugim nukleinskim kiselinama mešaju se sa biljnim ćelijama. Sonoporacija pomoću sonda tipa sononikator je upotrebljena da olakša uspon liposoma od strane biljnih ćelija. Ultrazvuk remeti lipidne bilije liposoma, oslobađajući genetski materijal u biljne ćelije. Ovaj pristup je koristan za prolazne studije izražavanja gena u biljnim ćelijama.

Scientifically Proven Benefits of Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT)

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) primenjen je na brojne biljne vrste. Kratak i relativno blag ultrazvučni tretman kultura biljnih ćelija izaziva sonoporaciju, što naknadno omogućava duboku penetraciju Agrobakterijuma kao transportera gena. U nastavku možete pročitati primerne studije koje pokazuju blagotvorne efekte SAAT-a.

Ultrasonično potpomognute transformacije Ašvagandhe

U cilju poboljšanja efikasnosti transformacije u W. somniferi (poznatoj kao ashwagandha ili zimska trešnja), Dehdashti i kolege (2016) istraživali su upotrebu acetosyringona (AS) i sonication.
Acetosyringone (AS) je dodat u tri faze: Agrobacterium tečna kultura, Agrobacterium infekcija i ko-kultura objašnjenja sa Agrobakterijumom. Utvrđeno je da je dodatak od 75 μM AS agrobacterium tečnoj kulturi optimalan za indukciju vir gena.
Dodatna primena sonication (SAAT) rezultirala je najvišim genističnim izražavanjem. Utvrđeno je da je izraz gena GUSA u dlakavim korenima najbolji kada su listovi i saveti za pucanje bili sonični za 10, odnosno 20 godina. Efikasnost transformacije unapređenog protokola zabeležena je 66,5 odnosno 59,5 odsto u slučaju objašnjenja lista i vrhova. U poređenju sa drugim protokolima utvrđeno je da je efikasnost transformacije ovog unapređenog protokola 2,5 puta veća za lišće i 3,7 presavijanje više za savete za snimanje. Južne blot analize potvrdile su 1–2 primerka transgene gusA u redovima W1-W4, dok su 1–4 transgene kopije otkrivene u liniji W5 generisanoj poboljšanim protokolom.

Effect of the duration of sonication-assisted Agrobacterium- mediated transformation (SAAT) on transformation frequency of W. somnifera leaf (a) and shoot tip (b) explants
(study and graphic: © Dehdashti et al., 2016)

Ultrasonično potpomognute transformacije pamuka

Hussain et al. (2007) demonstrira blagotvorne efekte sonikacije uz pomoć pamučne transformacije. Akustična kavitacija izazvana niskofrekventnim ultrazvukom stvara mikro-rane na i ispod površine biljnog tkiva (sonoporacija) i omogućava Agrobakterijumu da putuje dublje i u potpunosti kroz biljno tkivo. Ova ranjavanje moda povećava verovatnoću da se zaraze biljne ćelije koje leže dublje u tkivu. U cilju procene efikasnosti transformacije SAAT-a, izmeren je GUS genski izraz. Sistem reportera GUS-a je genski sistem reportera, posebno koristan u biljnoj molekularnoj biologiji i mikrobiologiji. Podešavajući različite SAAT parametre, GUS prolazni izraz u pamuku koristeći zrele embrione kao objašnjenje je značajno poboljšan. GUS je prvi put otkriven 24h nakon inkubacije objašnjenja i do 48h, GUS izraz je bio veoma intenzivan što je poslužilo kao koristan pokazatelj uspešne transformacije pamučnog objašnjenja nakon sonication asistirane Agrobacterium posmijene transformacije (SAAT). Poređenje različitih tehnika transformacije (tačnije biolistike, Agro, BAAT, SAAT), transformacije uz pomoć sonication-assisted Agrobacterium-a (SAAT) pokazalo je daleko najbolje rezultate transformacije.

Izbor procedure transformacije na osnovu prolaznog izražavanja GUS-a. Transformacija uz posredovanje Sonication-assisted Agrobacterium (SAAT) pokazuje znatno veći prolazni izraz.
(study and graphic: © Hussain et al., 2007)

Ultrazvučna rešenja visokih performansi za sonoporaciju i SAAT

Hielscher Ultrasonics je dugogodišnji doskusan u razvoju i proizvodnji ultrazvučnika visokih performansi za laboratorije, istraživačke objekte, kao i industrijsku proizvodnju sa veoma visokim protokom. Za mikrobiologiju i životnu nauku, Hielscher nudi različita rešenja za smeštaj različitih zahteva neophodnih za specifična tkiva i njihove tretmane. Za istovremenu ultrazvuku brojnih uzoraka Hielscher nudi UIP400MTP za viševelične ploče, VialTweeter za soniciju do 10 bočica (npr. Eppendorf cevi) ili ultrazvučni CupHorn. Ultrazvučnici tipa sonde dostupni su od 50 do 400 vati kao laboratorijski homogenizatori, dok industrijski sistemi pokrivaju domet snage od 500 vati do 16kW.
Molimo vas da nas kontaktirajete i obavestite nas o vašoj primeni i zahtevima procesa. Naše dobro iskusno osoblje će rado preporučiti najpogodniji ultrazvučni za Vaš biološki proces.
Табела испод показује приближни капацитет обраде наших ултразвучних уређаја: