Генетичка трансформација биљних ћелија помоћу ултразвука

Трансформација посредована бактеријама рода Agrobacterium уз помоћ соникације (SAAT) ефикасна је метода за инфицирање биљних ћелија страним генима, при чему се Agrobacterium користи као преносилац. Ултразвучна кавитација изазива сонопорацију, која се може описати као циљано стварање микрорана на биљном ткиву. Кроз ове ултразвучно створене микроране, ДНК и ДНК вектори могу се ефикасно транспортовати у ћелијски матрикс.

Сонопорација – ултразвучно побољшана трансформација ћелија

Када се нискофреквентни ултразвук (приближно 20kHz) примени на ћелијске суспензије, ефекти акустичке кавитације изазивају пролазно повећање пропустљивости мембрана у ћелијским ткивима. Овај ултразвучни ефекат познат је као сонопорација и користи се за пренос гена у ћелије или ткива.
Предности ултразвучне обраде заснивају се на њеном нетермичком механичком принципу деловања, због чега је соникација често свестранија и мање зависна од типа ћелија. Разноврсна примена сонопорације отвара могућност коришћења трансгених биљака, које имају значајан потенцијал у биопроизводњи сложених хуманих терапијских протеина. Таквим биореакторима на бази биљака може се лако генетички манипулисати, они спречавају потенцијалну контаминацију хуманим патогенима, не оштећују бактерије које посредују у трансформацији (нпр. Agrobacterium) и представљају јефтину, ефикасну методу биосинтезе.

Трансформација ћелија уз помоћ ултразвука

Соникација је техника у којој се нискофреквентни ултразвучни таласи примењују за покретање честица у раствору и мешање раствора, чиме се повећавају брзина преноса масе и брзина растварања. Истовремено, соникацијом се могу уклонити растворени гасови из течности. При трансформацији биљака, соникација изазива стварање микрорана на биљном ткиву и побољшава унос огољене ДНК у биљни протопласт.

За генетичку трансформацију, трансформација посредована бактеријама рода Agrobacterium уз помоћ соникације (SAAT) пожељна је метода и има знатно већу ефикасност од соникације која се користи за пренос огољене ДНК и ДНК вектора директно у протопласт. Бројне студије показале су да се трансформација посредована бактеријама рода Agrobacterium уз помоћ соникације (SAAT) може користити за изазивање механичког нарушавања структуре и стварања рана на биљним ћелијама дејством ултразвучних таласа и настале акустичке кавитације. Кратка ултразвучна обрада ствара микроране на површини експлантата. Пошто оштећене ћелије омогућавају продирање бактерија рода Agrobacterium у дубље делове биљних ткива, повећава се вероватноћа инфицирања биљних ћелија. Поред тога, излучена фенолна једињења побољшавају трансформацију. Ултразвучно створене микроране такође олакшавају продирање бактерија у експлантате. SAAT је успешно коришћен за генетичку трансформацију биљних врста које се нарочито сматрају отпорним на Agrobacterium.
Главне предности методе SAAT јесу њена изузетна једноставност и ниска цена, као и значајно побољшање преноса гена посредованог бактеријама рода Agrobacterium. Поред успешне примене методе SAAT у трансформацији врста Chenopodium rubrum L. и Beta vulgaris L., овај приступ је примењен и у производњи рекомбинантног термолабилног холотоксина дивљег типа бактерије Escherichia coli и вакциналних адјуванаса на бази мутантног LT бактерије Escherichia coli у биљци Nicotiana tabacum, при чему су код птица детектовани највиши системски титри IgG специфичних за LT-B.
(уп. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

Општи поступак преноса гена сонопорацијом у биљним ћелијама

1. Припрема генетичког материјала: Почните припремом генетичког материјала који желите да унесете у биљне ћелије. То може бити плазмидна ДНК, РНК или друге нуклеинске киселине.
2. Изолација биљних ћелија: Изолујте биљне ћелије које желите да третирате. У зависности од експеримента, ове ћелије могу бити изоловане из биљних ткива или култура.
3. Ћелијска суспензија: Суспендујте биљне ћелије у одговарајућем медијуму или пуферу. Ово је неопходно како би ћелије биле здраве и у стању погодном за усвајање гена.
4. Подешавање соникатора: Припремите соникатор са сондом тако што ћете унапред подесити параметре соникације, као што су амплитуда, време, енергија и температура. Уроните ултразвучну сонду у ћелијску суспензију.
5. Соникација: Започните поступак соникације. Брзо осциловање врха сонде ствара кавитационе мехуриће у течности. Ови мехурићи се шире и колабирају услед дејства ултразвучних таласа, стварајући механичке силе и микрострујање у суспензији.
6. Сонопорација: Механичке силе и микрострујање настали услед кавитације стварају привремене поре и отворе у мембранама биљних ћелија. Генетички материјал присутан у суспензији може ући у биљне ћелије кроз ове поре.
7. Инкубација: Након третмана сонопорацијом, инкубирајте биљне ћелије како би се опоравиле и стабилизовале своје мембране. Ово је кључан корак за обезбеђивање преживљавања ћелија и успешног преноса гена.

Пренос гена посредством бактерија рода Agrobacterium или липозома

Постоје два уобичајена начина трансфекције биљних ћелија. Као носиоци генетичког материјала користе се или бактерије рода Agrobacterium, рода грам-негативних бактерија, или липозоми.

• Сонопорација посредована бактеријама рода Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens је бактерија која се често користи у генетичком инжењерству биљака. У овој методи, плазмидна ДНК која садржи жељени ген уноси се у бактерије рода Agrobacterium, које се затим мешају са биљним ћелијама. Ћелијска суспензија се подвргава сонопорацији помоћу соникатора са сондом. Ултразвучна енергија побољшава пренос генетичког материјала из бактерија рода Agrobacterium у биљне ћелије. Ова метода се широко користи за генетичку модификацију биљака.
• Сонопорација посредована липозомима: Липозоми су везикуле на бази липида које могу носити генетички материјал. У овој методи, липозоми напуњени плазмидном ДНК или другим нуклеинским киселинама мешају се са биљним ћелијама. Сонопорација помоћу соникатора са сондом примењује се како би се олакшало усвајање липозома у биљне ћелије. Ултразвук нарушава липидне двослојеве липозома, ослобађајући генетички материјал у биљне ћелије. Овај приступ је користан за проучавање пролазне експресије гена у биљним ћелијама.

Научно доказане предности трансформације посредоване бактеријама рода Agrobacterium уз помоћ соникације (SAAT)

Трансформација посредована бактеријама рода Agrobacterium уз помоћ соникације (SAAT) примењена је на бројне биљне врсте. Кратак и релативно благ ултразвучни третман култура биљних ћелија изазива сонопорацију, која затим омогућава дубоко продирање бактерија рода Agrobacterium као преносилаца гена. У наставку можете прочитати примере студија које показују корисне ефекте SAAT.

Трансформација ашваганде уз помоћ ултразвука

Да би побољшали ефикасност трансформације код W. somnifera (познате као ашваганда или зимска трешња), Dehdashti и сарадници (2016) испитивали су примену ацетосирингона (AS) и соникације.
Ацетосирингон (AS) додаван је у три фазе: у течну културу Agrobacterium, током инфекције бактеријом Agrobacterium и током заједничког култивисања експлантата са бактеријом Agrobacterium. Утврђено је да је додавање 75 μM AS у течну културу Agrobacterium оптимално за индукцију гена vir.
Додатна примена соникације (SAAT) довела је до највише експресије гена. Утврђено је да је експресија гена gusA у длакавим кореновима била најбоља када су листови соницирани 10s, а врхови изданака 20s. Забележена ефикасност трансформације побољшаним протоколом износила је 66,5 за експлантате листова и 59,5% за експлантате врхова изданака. У поређењу са другим протоколима, утврђено је да је ефикасност трансформације овим побољшаним протоколом била 2,5 пута већа за листове и 3,7 пута већа за врхове изданака. Анализе методом Саутерн блота потврдиле су 1–2 копије трансгена gusA у линијама W1-W4, док су у линији W5, добијеној побољшаним протоколом, откривене 1–4 копије трансгена.

Утицај трајања соникације при трансформацији посредованој бактеријом Agrobacterium уз помоћ соникације (SAAT) на учесталост трансформације експлантата листова (а) и врхова изданака (б) W. somnifera
(студија и графички приказ: © Dehdashti et al., 2016)

Трансформација памука уз помоћ ултразвука

Hussain и сарадници (2007) показују повољне ефекте трансформације памука уз помоћ соникације. Акустична кавитација изазвана нискофреквентним ултразвуком ствара микроповреде на површини и испод површине биљног ткива (сонопорација) и омогућава бактерији Agrobacterium да продре дубље и кроз цело биљно ткиво. Овакав начин повређивања повећава вероватноћу инфекције биљних ћелија које се налазе дубље у ткиву. Ради процене ефикасности трансформације методом SAAT, мерена је експресија гена GUS. Репортерски систем GUS је систем репортерског гена, посебно користан у молекуларној биологији биљака и микробиологији. Подешавањем различитих параметара методе SAAT значајно је повећана пролазна експресија гена GUS у памуку, при чему су зрели ембриони коришћени као експлантати. GUS је први пут откривен 24h након инкубације експлантата, а до 48h експресија гена GUS била је веома интензивна, што је послужило као користан показатељ успешне трансформације експлантата памука након трансформације посредоване бактеријом Agrobacterium уз помоћ соникације (SAAT). При поређењу различитих техника трансформације (и то биолистичке технике, Agro, BAAT и SAAT), трансформација посредована бактеријом Agrobacterium уз помоћ соникације (SAAT) показала је убедљиво најбоље резултате трансформације.

Избор поступка трансформације на основу пролазне експресије гена GUS. Трансформација посредована бактеријом Agrobacterium уз помоћ соникације (SAAT) показује значајно вишу пролазну експресију.
(студија и графички приказ: © Hussain et al., 2007)

Ултразвучна решења високих перформанси за сонопорацију и SAAT

Hielscher Ultrasonics има дугогодишње искуство у развоју и производњи ултразвучних уређаја високих перформанси за лабораторије, истраживачке установе, као и за индустријску производњу са веома великим капацитетом обраде. За микробиологију и науке о животу, Hielscher нуди различита решења која испуњавају различите захтеве специфичних ткива и њихових третмана. За истовремену ултразвучну обраду бројних узорака, Hielscher нуди UIP400MTP за плоче са више бунарчића, VialTweeter за соникацију до 10 бочица (нпр. Eppendorf епрувета) или ултразвучни CupHorn. Ултразвучни уређаји са сондом имају снагу од 50 до 400 вати за лабораторијске хомогенизаторе и од 500 вати до 16 kW за индустријске системе.
Контактирајте нас и обавестите нас о својој примени и захтевима процеса. Наше искусно особље ће вам радо препоручити најпогоднији ултразвучни уређај за ваш биолошки процес.
Табела у наставку даје преглед приближног капацитета обраде наших ултразвучних уређаја: