Генетска трансформација у биљним ћелијама коришћењем ултразвука

Трансформација посредована агробактеријама уз помоћ ултразвука (СААТ) је ефикасан метод за инфицирање биљних ћелија страним генима користећи Агробацтериум као транспортер. Ултразвучна кавитација изазива сонопорацију, која се може описати као циљано микро-рањавање биљног ткива. Преко ових ултразвучних микро рана, ДНК и ДНК вектори се могу ефикасно транспортовати у ћелијски матрикс.

сонопорација – Ултразвучно побољшана ћелијска трансформација

Када се ултразвук ниске фреквенције (приближно 20 кХз) примени на ћелијске суспензије, ефекти акустичне кавитације изазивају пролазну пермеабилизацију мембране на ћелијским ткивима. Овај ултразвучни ефекат је познат као сонопорација и користи се за пренос гена у ћелије или ткива.
Предности ултразвучне обраде су засноване на његовом нетермичном механичком принципу рада, што чини соникацију често разноврснијом и мање зависном од типова ћелија. Разноврсна примена сонопорације отвара могућност за коришћење трансгених биљака, које имају значајан потенцијал у биопродукцији комплексних хуманих терапијских протеина. Такви биљни реактори могу се лако генетски манипулисати, спречавају потенцијалну контаминацију људским патогенима, не оштећују бактерије које посредују трансформацију (нпр. Агробацтериум), и представљају јефтин, ефикасан метод биосинтезе.

Трансформација ћелија уз помоћ ултразвука

Соникација је техника која примењује ултразвучне таласе ниске фреквенције за агитацију честица у раствору, за мешање раствора, чиме се повећава брзина преноса масе и растварања. Истовремено, соникација може уклонити растворене гасове из течности. У трансформацији биљака, соникација ће изазвати стварање микрорана на биљном ткиву и побољшати испоруку голе ДНК у биљни протопласт.

За генетску трансформацију, трансформација посредована агробактеријом уз помоћ ултразвука (СААТ) је пожељна метода и има знатно већу ефикасност од соникације која се користи за пренос голих ДНК и ДНК вектора директно у протопласт. Бројне студије су показале да се трансформација посредована Агробацтериум-ом (СААТ) уз помоћ ултразвука може користити за изазивање механичких поремећаја и формирања рана на биљним ћелијама ултразвучним таласима и резултирајућом акустичном кавитацијом. Кратак ултразвучни третман ствара микро-ране на површини експлантата. Пошто ће рањене ћелије омогућити продирање агробактерије у дубљи део биљних ткива, повећавајући тако вероватноћу инфицирања биљних ћелија. Поред тога, излучена фенолна једињења појачавају трансформацију. Ултразвучно генерисане микро-ране чине продирање бактерија у експлант такође изводљивијим. СААТ је успешно коришћен за генетску трансформацију биљних врста које се посебно сматрају отпорним на Агробацтериум.
То што је веома једноставан и јефтин метод, као и значајно побољшање преноса гена посредованог Агробацтериум, главне су предности СААТ-а. Осим успешне примене СААТ-а у трансформацији Цхеноподиум рубрум Л. и Бета вулгарис Л., овај приступ је такође примењен у производњи рекомбинантног топлотно лабилног холотоксин дивљег типа Есцхерицхиа цоли и адјуванса за Есцхерицхиа цоли мутант ЛТ вакцине у Ницотиана табацум. , у којој су највиши системски ЛТ-Б-специфични титри ИгГ детектовани код птица.
(уп. Лаере ет ал., 2016; М. Климек-Чодачка и Р. Барански, 2014)

Општа процедура за трансфер гена путем сонопорације у биљним ћелијама

1. Припрема генетског материјала: Почните тако што ћете припремити генетски материјал који желите да унесете у биљне ћелије. То може бити плазмидна ДНК, РНК или друге нуклеинске киселине.
2. Изолација биљних ћелија: Изолујте биљне ћелије које желите да циљате. У зависности од вашег експеримента, ове ћелије могу бити изоловане из биљних ткива или култура.
3. ћелијска суспензија: Суспендујте биљне ћелије у одговарајућем медијуму или пуферу. Ово је неопходно да би се осигурало да су ћелије здраве и у стању погодном за унос гена.
4. Подесите свој Соницатор: Припремите соникатор типа сонде тако што ћете унапред подесити параметре соникације као што су амплитуда, време, енергија и температура. Уроните ултразвучну сонду у ћелијску суспензију.
5. Соникација: Покрените процедуру соникације. Брза осцилација врха сонде ствара мехуриће кавитације у течности. Ови мехурићи се шире и колабирају услед ултразвучних таласа, стварајући механичке силе и микрострујање у суспензији.
6. сонопорација: Механичке силе и микротокови настали кавитацијом стварају привремено поре и рупе на мембранама биљних ћелија. Генетски материјал присутан у суспензији може ући у биљне ћелије кроз ове поре.
7. инкубација: Након третмана сонопорацијом, инкубирајте биљне ћелије како бисте им омогућили да се опораве и стабилизују своје мембране. Ово је кључни корак да се осигура опстанак ћелија и успешан трансфер гена.

Трансфер гена преко Агробацтериум или липосома

Постоје два уобичајена облика трансфекције биљне ћелије. Они користе или агробактерију, род грам-негативних бактерија, или липозоме као носиоце генетског материјала.

• Сонопорација посредована агробактеријама: Агробацтериум тумефациенс је бактерија која се обично користи у биљном генетском инжењерингу. У овој методи, плазмидна ДНК која садржи жељени ген се уводи у Агробацтериум, која се затим меша са биљним ћелијама. Суспензија ћелија је подвргнута сонопорацији коришћењем соникатора типа сонде. Ултразвучна енергија побољшава пренос генетског материјала из Агробацтериум у биљне ћелије. Ова метода се широко користи за генетску модификацију биљака.
• Сонопорација посредована липозомима: Липозоми су везикуле засноване на липидима које могу да носе генетски материјал. У овој методи, липозоми напуњени плазмидном ДНК или другим нуклеинским киселинама се мешају са биљним ћелијама. Сонопорација помоћу соникатора типа сонде се користи да би се олакшало узимање липозома од стране биљних ћелија. Ултразвук омета липидне двослојеве липосома, ослобађајући генетски материјал у биљне ћелије. Овај приступ је користан за студије пролазне експресије гена у биљним ћелијама.

Научно доказане предности трансформације посредоване агробактеријама уз помоћ ултразвука (СААТ)

Трансформација посредована агробактеријама (СААТ) примењена је на бројне биљне врсте. Кратак и релативно благ ултразвучни третман биљних ћелијских култура изазива сонопорацију, што накнадно омогућава дубоку пенетрацију Агробацтериум као преносиоца гена. У наставку можете прочитати огледне студије које показују корисне ефекте СААТ-а.

Ултразвучно потпомогнута трансформација Ашваганде

Да би побољшали ефикасност трансформације код В. сомнифера (познатог као асхвагандха или зимска трешња), Дехдасхти и колеге (2016) су истраживали употребу ацетосирингона (АС) и соникације.
Ацетосирингон (АС) је додат у три фазе: течна култура Агробацтериум, инфекција Агробацтериум и ко-култура експлантата са Агробацтериум. Утврђено је да је додавање 75 μМ АС течној култури Агробацтериум оптимално за индукцију вир гена.
Додатна примена соникације (СААТ) резултирала је највећом експресијом гена. Утврђено је да је експресија гена гусА у длакавом корену најбоља када су листови и врхови изданака обрађени соникацијом 10, односно 20 секунди. Ефикасност трансформације побољшаног протокола забележена је 66,5 и 59,5% у случају експлантата врхова листа и изданака. У поређењу са другим протоколима, утврђено је да је ефикасност трансформације овог побољшаног протокола 2,5 пута већа за листове и 3,7 пута већа за врхове изданака. Соутхерн блот анализе су потврдиле 1-2 копије гусА трансгена у линијама В1-В4, док су 1-4 трансгенске копије откривене у линији В5 генерисане побољшаним протоколом.

Утицај трајања трансформације посредоване Агробацтериум-ом (СААТ) уз помоћ ултразвука на учесталост трансформације експлантата листа В. сомнифера (а) и врха изданка (б)(студија и графика: © Дехдасхти ет ал., 2016)

Ултразвучно потпомогнута трансформација памука

Хуссаин ет ал. (2007) показују корисне ефекте трансформације памука уз помоћ ултразвука. Акустична кавитација изазвана ултразвуком ниске фреквенције ствара микро-ране на и испод површине биљног ткива (сонопорација) и омогућава Агробацтериум-у да путује дубље и потпуно кроз биљно ткиво. Овај начин рањавања повећава вероватноћу заразе биљних ћелија које леже дубље у ткиву. Да би се проценила ефикасност трансформације СААТ, мерена је експресија ГУС гена. ГУС репортер систем је систем репортерских гена, посебно користан у биљној молекуларној биологији и микробиологији. Подешавањем различитих СААТ параметара, ГУС пролазна експресија у памуку користећи зреле ембрионе као експлант је значајно побољшана. ГУС је први пут откривен 24х након инкубације експлантата, а до 48х експресија ГУС-а је била веома интензивна што је послужило као користан показатељ успешне трансформације памучног експлантата након трансформације посредоване Агробацтериумом (СААТ) уз помоћ ултразвука. Поређење различитих техника трансформације (наиме биолистична, Агро, БААТ, СААТ), трансформација посредована Агробацтериум-ом (СААТ) уз помоћ ултразвука, показала је далеко најбоље резултате трансформације.

Избор поступка трансформације на основу прелазног израза ГУС-а. Трансформација посредована Агробацтериум-ом (СААТ) уз помоћ ултразвука показује значајно већу пролазну експресију.(студија и графика: © Хуссаин ет ал., 2007)

Ултразвучна решења високих перформанси за сонопорацију и СААТ

Хиелсцхер Ултрасоницс има дугогодишње искуство у развоју и производњи ултрасоникатора високих перформанси за лабораторије, истраживачке установе као и индустријску производњу са веома великом пропусношћу. За микробиологију и науку о животу, Хиелсцхер нуди различита решења за прилагођавање различитих захтева неопходних за специфична ткива и њихове третмане. За истовремену ултразвучну обраду бројних узорака Хиелсцхер нуди УИП400МТП за плоче са више јажица, ВиалТвеетер за ултразвучну обраду до 10 бочица (нпр. Еппендорф епрувете) или ултразвучни ЦупХорн. Ултрасоникатори типа сонде су доступни од 50 до 400 вати као лабораторијски хомогенизатори, док индустријски системи покривају опсег снаге од 500 вати до 16 кВ.
Молимо вас да нас контактирате и обавестите нас о захтевима ваше пријаве и процеса. Наше искусно особље ће радо препоручити најпогоднији ултразвучни апарат за ваш биолошки процес.
Табела у наставку даје вам индикацију приближних капацитета обраде наших ултразвучних апарата: