Производња хитина и хитозана из печурака

Ултразвучна обрада је веома ефикасна метода за ослобађање хитина и хитозана из гљивичних извора као што су печурке. Хитин и хитозан морају се деполимеризовати и деацетиловати у накнадној обради како би се добио висококвалитетан биополимер. Деполимеризација и деацетилација потпомогнуте ултразвуком представљају веома делотворну, једноставну и брзу технику којом се добијају висококвалитетни хитозани велике молекулске масе и изузетне биорасположивости.

Добијање хитина и хитозана из печурака ултразвучном обрадом

Јестиве и лековите печурке као што су Lentinus edodes (шитаке), Ganoderma lucidum (лингџи или реиши), Inonotus obliquus (чага), Agaricus bisporus (шампињони), Hericium erinaceus (лавља грива), Cordyceps sinensis (гусеничарска гљива), Grifola frondosa (шумска кокошка), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, ћурећи реп) и многе друге врсте гљива широко се користе као храна и за екстракцију биоактивних једињења. Ове печурке, као и остаци од прераде (отпад од печурака), могу се користити за производњу хитозана. Ултразвучна обрада не само да подстиче ослобађање хитина из структуре ћелијског зида гљива већ и покреће претварање хитина у драгоцени хитозан путем деполимеризације и деацетилације потпомогнутих ултразвуком.

Соникација подстиче деполимеризацију и деацетилацију хитина у хитозан

Интензивна ултразвучна обрада помоћу ултразвучног система са сондом представља технику која се користи за подстицање деполимеризације и деацетилације хитина, што доводи до стварања хитозана. Хитин је природни полисахарид који се налази у егзоскелетима ракова и инсеката, као и у ћелијским зидовима одређених гљива. Хитозан се добија из хитина уклањањем ацетилних група из молекула хитина.

Ултразвучни поступак за претварање хитина из гљива у хитозан

Када се интензивна ултразвучна обрада примењује за производњу хитозана из хитина, суспензија хитина се подвргава соникацији ултразвучним таласима високог интензитета и ниске фреквенције, обично у опсегу од 20 kHz до 30 kHz. Овај процес ствара интензивну акустичку кавитацију, која подразумева настанак, раст и колапс микроскопских вакуумских мехурића у течности. Кавитација локално ствара изузетно велике смицајне силе, високе температуре (до неколико хиљада степени Целзијуса) и притиске (до неколико стотина атмосфера) у течности која окружује кавитационе мехуриће. Ови екстремни услови доприносе разградњи хитинског полимера и накнадној деацетилацији.
 

SEM снимци хитина и хитозана из две врсте печурака: a) хитин из L. vellereus; b) хитин из P. ribis; c) хитозан из L.vellereus; d) хитозан из P. ribis.
слика и студија: © Erdoğan et al., 2017

Ултразвучна деполимеризација хитина

Деполимеризација хитина одвија се комбинованим дејством механичких сила, као што су микрострујање и стварање течних млазева, као и хемијским реакцијама иницираним ултразвуком које изазивају слободни радикали и друге реактивне врсте настале током кавитације. Таласи високог притиска који настају током кавитације излажу хитинске ланце смицајном напону, што доводи до цепања полимера на мање фрагменте.

Ултразвучна деацетилација хитина

Поред деполимеризације, интензивна ултразвучна обрада подстиче и деацетилацију хитина. Деацетилација подразумева уклањање ацетилних група из молекула хитина, што доводи до настанка хитозана. Интензивна ултразвучна енергија, нарочито високе температуре и притисци настали током кавитације, убрзавају реакцију деацетилације. Реактивни услови створени кавитацијом помажу у раскидању веза ацетилних група у хитину, што доводи до ослобађања сирћетне киселине и претварања хитина у хитозан.
У целини, интензивна ултразвучна обрада побољшава и деполимеризацију и деацетилацију обезбеђивањем неопходне механичке и хемијске енергије за разградњу полимера хитина и олакшавање његовог претварања у хитозан. Ова техника пружа брзу и ефикасну методу за производњу хитозана из хитина, са бројним применама у различитим областима, укључујући фармацеутску индустрију, пољопривреду и биомедицинско инжењерство.

Индустријска производња хитозана из печурака помоћу ултразвука велике снаге

Комерцијална производња хитина и хитозана углавном се заснива на отпаду из привредних делатности везаних за море (тј. риболова, сакупљања шкољки итд.). Различити извори сировина дају хитин и хитозан различитог квалитета, што доводи до осцилација у производњи и квалитету услед сезонских варијација у риболову. Осим тога, према наводима, хитозан добијен из гљива има супериорна својства, као што су уједначена дужина полимерних ланаца и већа растворљивост, у поређењу са хитозаном из морских извора. (уп. Ghormade et al., 2017) Да би се обезбедио хитозан уједначених својстава, екстракција хитина из гљивичних врста постала је стабилан алтернативни начин производње. Производња хитина и хитозана из гљива може се лако и поуздано остварити применом технологије ултразвучне екстракције и деацетилације. Интензивна соникација разара ћелијске структуре ради ослобађања хитина и подстиче пренос масе у воденим растварачима, чиме се постижу супериорни приноси хитина и ефикасност екстракције. Накнадна ултразвучна деацетилација претвара хитин у вредни хитозан. И ултразвучна екстракција хитина и деацетилација у хитозан могу се линеарно скалирати до било ког обима комерцијалне производње.

Соникација интензивира производњу хитозана из гљива и чини је ефикаснијом и економичнијом.
(слика и студија: © Zhu et al., 2019)

Резултати истраживања ултразвучне деацетилације хитина и хитозана

Zhu et al. (2018) у својој студији закључују да се ултразвучна деацетилација показала као кључни напредак, омогућавајући претварање β-хитина у хитозан са степеном деацетилације од 83–94% при сниженим температурама реакције. Слика лево приказује снимак ултразвучно деацетилованог хитозана добијен скенирајућом електронском микроскопијом (SEM) (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (слика и студија: © Zhu et al., 2018)
У њиховом протоколу, раствор NaOH (20 w/v %) припремљен је растварањем љуспица NaOH у дејонизованој води. Алкални раствор је затим додат талогу GLSP (0,5 g) у епрувети за центрифугирање, при односу чврсте и течне фазе од 1:20 (g: mL). Хитозан је додат у NaCl (40 mL, 0,2 M) и сирћетну киселину (0,1 M), при запреминском односу раствора од 1:1. Суспензија је затим подвргнута ултразвуку на умереној температури од 25°C током 60 min помоћу ултразвучног уређаја са сондом (250W, 20kHz). (уп. Zhu et al., 2018)
 
Pandit et al. (2021) утврдили су да концентрације киселине коришћене за растварање полимера ретко утичу на брзину разградње у растворима хитозана и да она у великој мери зависи од температуре, интензитета ултразвучних таласа и јонске јачине средине коришћене за растварање полимера. (уп. Pandit et al., 2021)
 
У другој студији, Zhu et al. (2019) користили су прах спора Ganoderma lucidum као гљивичну сировину и истраживали деацетилацију потпомогнуту ултразвуком и утицаје параметара обраде, као што су време соникације, однос чврсте и течне фазе, концентрација NaOH и снага озрачивања, на степен деацетилације (DD) хитозана. Највиша вредност DD добијена је при следећим ултразвучним параметрима: соникација током 20 min при 80W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Морфологија површине, хемијске групе, термичка стабилност и кристалност хитозана добијеног ултразвуком испитане су помоћу SEM, FTIR, TG и XRD. Истраживачки тим извештава о значајном повећању степена деацетилације (DD), динамичке вискозности ([η]) и молекулске масе (Mv¯) хитозана произведеног ултразвуком. Резултати су истакли технику ултразвучне деацетилације гљивичног материјала као веома делотворну методу производње хитозана, погодног за биомедицинске примене. (уп. Zhu et al., 2019)

Врхунски квалитет хитозана уз ултразвучну деполимеризацију и деацетилацију

Процеси екстракције и деполимеризације хитина / хитозана који се одвијају под дејством ултразвука могу се прецизно контролисати, а параметри ултразвучног процеса могу се прилагодити сировинама и циљаном квалитету крајњег производа (нпр. молекулској маси, степену деацетилације). То омогућава прилагођавање ултразвучног процеса спољним факторима и подешавање оптималних параметара за врхунске резултате и ефикасност.
Ултразвучно деацетилован хитозан показује одличну биорасположивост и биокомпатибилност. Када се биополимери хитозана припремљени ултразвуком упореде са термички добијеним хитозаном у погледу биомедицинских својстава, хитозан произведен ултразвуком показује значајно побољшану вијабилност фибробласта (ћелија L929) и појачану антибактеријску активност према бактеријама Escherichia coli (E. coli) и Staphylococcus aureus (S. aureus).
(уп. Zhu et al., 2018)
 

Снимци скенирајуће електронске микроскопије (SEM) при увећању од 100×: a) гладијус, b) гладијус третиран ултразвуком, c) β-хитин, d) β-хитин третиран ултразвуком и e) хитозан (извор: Preto et al. 2017)

Ултразвучна опрема високих перформанси за обраду хитина и хитозана

Фрагментација хитина и деацетилација хитина у хитозан захтевају снажну и поуздану ултразвучну опрему која може да обезбеди високе амплитуде, омогућава прецизну контролу параметара процеса и може да ради 24/7 под великим оптерећењем и у захтевним окружењима. Асортиман производа компаније Hielscher Ultrasonics поуздано испуњава ове захтеве. Поред изванредних ултразвучних перформанси, Hielscher ултразвучни уређаји одликују се високом енергетском ефикасношћу, што представља значајну економску предност – посебно када се користе у комерцијалној производњи великог обима.
Hielscher ултразвучни уређаји су системи високих перформанси који се могу опремити додатном опремом као што су сонотроде, појачивачи амплитуде, реактори или проточне ћелије како би се оптимално прилагодили потребама вашег процеса.
 Захваљујући дигиталном екрану у боји, могућности унапред подешавања циклуса соникације, аутоматском бележењу података на уграђеној SD картици, даљинском управљању преко прегледача и многим другим функцијама, Hielscher ултразвучни уређаји обезбеђују највиши степен контроле процеса и једноставности употребе. Уз робусност и способност рада под великим оптерећењем, Hielscher ултразвучни системи представљају ваш поуздан ослонац у производњи. 
Фрагментација и деацетилација хитина захтевају снажан ултразвук како би се постигла циљана конверзија и добио висококвалитетан крајњи производ од хитозана. Високе амплитуде и повишени притисци пресудни су посебно за фрагментацију љуспица хитина и кораке деполимеризације / деацетилације. Индустријски ултразвучни процесори компаније Hielscher Ultrasonics лако обезбеђују веома високе амплитуде. Амплитуде до 200µm могу се непрекидно одржавати при раду 24/7. За још више амплитуде доступне су ултразвучне сонотроде израђене по мери. Расположива снага Hielscher ултразвучних система омогућава ефикасну и брзу деполимеризацију и деацетилацију у безбедном процесу једноставном за руковање.
 

Синергистички третман хитина унапређен ултразвучном обрадом

Да би се превазишли недостаци (тј. ниска ефикасност, високи трошкови енергије, дуго време обраде, токсични растварачи) традиционалне хемијске и ензимске деацетилације хитина, ултразвук високог интензитета интегрисан је у обраду хитина и хитозана. Соникација високог интензитета и ефекти акустичне кавитације који настају услед ње доводе до брзог раскидања полимерних ланаца и смањују полидисперзност, чиме подстичу синтезу хитозана. Поред тога, ултразвучне силе смицања интензивирају пренос масе у раствору, чиме се убрзавају хемијске, хидролитичке или ензимске реакције. Ултразвучни третман хитина може се комбиновати са већ постојећим техникама обраде хитина, као што су хемијске методе, хидролиза или ензимски поступци.

Хемијска деацетилација и деполимеризација уз помоћ ултразвука

Пошто је хитин нереактиван и нерастворљив биополимер, мора проћи кроз процесне кораке деминерализације, депротеинизације и деполимеризације / деацетилације како би се добио растворљив и биоприступачан хитозан. Ови процесни кораци обухватају третмане јаким киселинама као што је HCl и јаким базама као што су NaOH и KOH. Пошто су ови конвенционални процесни кораци неефикасни, спори и захтевају велике количине енергије, интензивирање процеса соникацијом значајно унапређује производњу хитозана. Примена ултразвука велике снаге повећава принос и квалитет хитозана, скраћује трајање процеса са више дана на неколико сати, омогућава употребу блажих растварача и чини цео процес енергетски ефикаснијим.

Депротеинизација хитина унапређена ултразвуком

Vallejo-Dominguez et al. (2021) су у свом истраживању депротеинизације хитина утврдили да је „примена ултразвука за производњу биополимера смањила садржај протеина, као и величину честица хитина. Уз помоћ ултразвука произведен је хитозан високог степена деацетилације и средње молекулске масе.“

Ултразвучна хидролиза за деполимеризацију хитина

За хемијску хидролизу користе се киселине или алкалије ради деацетилације хитина, али је алкална деацетилација (нпр. натријум-хидроксидом NaOH) у широј употреби. Кисела хидролиза је алтернативна метода традиционалној хемијској деацетилацији, при којој се раствори органских киселина користе за деполимеризацију хитина и хитозана. Метода киселе хидролизе углавном се користи када молекулска маса хитина и хитозана мора бити уједначена. Овај конвенционални поступак хидролизе познат је као спор поступак који захтева много енергије и велике трошкове. Потреба за јаким киселинама, високим температурама и притисцима представља факторе који хидролитички поступак добијања хитозана чине веома скупим и дуготрајним. Употребљене киселине захтевају накнадне поступке као што су неутрализација и одсољавање.
Укључивањем ултразвука велике снаге у поступак хидролизе могу се знатно снизити температура и притисак потребни за хидролитичко цепање хитина и хитозана. Осим тога, соникација омогућава употребу нижих концентрација киселина или блажих киселина. Тиме поступак постаје одрживији, ефикаснији, исплативији и повољнији за животну средину.

Хемијска деацетилација потпомогнута ултразвуком

Хемијска разградња и деацетилација хитина и хитозана углавном се постижу третирањем хитина или хитозана минералним киселинама (нпр. хлороводоничном киселином HCl), натријум-нитритом (NaNO₂), или водоник-пероксидом (H₂O₂). Ултразвук повећава брзину деацетилације и тиме скраћује време реакције потребно за постизање циљаног степена деацетилације. То значи да соникација скраћује потребно време обраде са 12–24 сата на неколико сати. Осим тога, соникација омогућава употребу знатно нижих концентрација хемикалија, на пример 40% (w/w) натријум-хидроксида уз соникацију, док је без употребе ултразвука потребно 65% (w/w).

Ултразвучно-ензимска деацетилација

Иако је ензимска деацетилација благ поступак обраде нешкодљив за животну средину, њена ефикасност и трошкови чине је неисплативом. Због сложеног и скупог накнадног издвајања и пречишћавања ензима из крајњег производа, које захтева много рада, ензимска деацетилација хитина не примењује се у комерцијалној производњи, већ се користи само у научноистраживачким лабораторијама.
Ултразвучни предтретман пре ензимске деацетилације фрагментише молекуле хитина, чиме повећава њихову површину и чини већу површину доступном ензимима. Соникација високих перформанси помаже да се побољша ензимска деацетилација и чини поступак економичнијим.