Производња хитина и хитозана из печурака

Ултразвук је веома ефикасан метод за ослобађање хитина и хитозана из гљивичних извора као што су печурке. Хитин и хитозан морају бити деполимеризовани и деацетиловани у низводној преради да би се добио биополимер високог квалитета. Ултразвучно потпомогнута деполимеризација и деацетилација је веома ефикасна, једноставна и брза техника, која резултира висококвалитетним хитозанима са високом молекулском тежином и супериорном биодоступношћу.

Хитин и хитозан добијени из гљива путем ултразвука

Јестиве и лековите печурке као што су Лентинус едодес (шитаке), Ганодерма луцидум (Лингзхи или реисхи), Инонотус обликуус (чага), Агарицус биспорус (печурке), Херициум еринацеус (лавова грива), Цордицепс синенсис (гусеница грива фолија) кокош од дрвета), Траметес версицолор (Цориолус версицолор, Полипорус версицолор, ћурећа репа) и многе друге врсте гљива се широко користе као храна и за екстракцију биоактивних једињења. Ове печурке, као и остаци прераде (отпад од печурака) могу се користити за производњу хитозана. Ултразвучна обрада не само да промовише ослобађање хитина из структуре ћелијског зида гљивице, већ такође покреће конверзију хитина у вредан хитозан путем деполимеризације и деацетилације уз помоћ ултразвука.

Деполимеризација и деацетилација хитина у хитозан се промовише ултразвуком

Интензивна ултразвучна обрада помоћу ултразвучног система типа сонде је техника која се користи за промовисање деполимеризације и деацетилације хитина, што доводи до стварања хитозана. Хитин је природни полисахарид који се налази у егзоскелетима ракова, инсеката и ћелијским зидовима одређених гљива. Хитозан се добија из хитина уклањањем ацетил група из молекула хитина.

Ултразвучна процедура за гљивичну конверзију хитина у хитозан

Када се примењује интензивна ултразвучна обрада за производњу хитозана из хитина, суспензија хитина се обрађује ултразвучним таласима високог интензитета, ниске фреквенције, обично у опсегу од 20 кХз до 30 кХз. Процес генерише интензивну акустичну кавитацију, која се односи на формирање, раст и колапс микроскопских вакуумских мехурића у течности. Кавитација генерише локализоване екстремно велике силе смицања, високе температуре (до неколико хиљада степени Целзијуса) и притиске (до неколико стотина атмосфера) у течности која окружује кавитационе мехуриће. Ови екстремни услови доприносе разградњи хитин полимера и накнадној деацетилацији.
 

СЕМ слике хитина и хитозана из две врсте гљива: а) Хитин из Л. веллереус; б) хитин из П. рибис; ц) Хитозан из Л.веллереус; г) хитозан из П. рибис.слика и студија: © Ердоган ет ал., 2017

Ултразвучна деполимеризација хитина

Деполимеризација хитина се дешава комбинованим ефектима механичких сила, као што су микрострујање и млаз течности, као и ултразвучно покренутим хемијским реакцијама изазваним слободним радикалима и другим реактивним врстама које настају током кавитације. Таласи високог притиска који се стварају током кавитације узрокују да хитински ланци буду подвргнути напрезању смицања, што доводи до цепања полимера на мање фрагменте.

Ултразвучна деацетилација хитина

Поред деполимеризације, интензивна ултразвучна обрада такође промовише деацетилацију хитина. Деацетилација укључује уклањање ацетилних група из молекула хитина, што доводи до стварања хитозана. Интензивна ултразвучна енергија, посебно високе температуре и притисци настали током кавитације, убрзавају реакцију деацетилације. Реактивни услови створени кавитацијом помажу у разбијању ацетилних веза у хитину, што резултира ослобађањем сирћетне киселине и конверзијом хитина у хитозан.
Све у свему, интензивна ултразвучна обрада побољшава и процесе деполимеризације и деацетилације обезбеђујући неопходну механичку и хемијску енергију за разбијање хитинског полимера и олакшавање конверзије у хитозан. Ова техника нуди брзу и ефикасну методу за производњу хитозана из хитина, са бројним применама у различитим индустријама, укључујући фармацеутске производе, пољопривреду и биомедицинско инжењерство.

Индустријска производња хитозана из гљива уз помоћ ултразвука

Комерцијална производња хитина и хитозана углавном се заснива на отпаду морске индустрије (тј. риболов, улов шкољки итд.). Различити извори сировина резултирају различитим квалитетима хитина и хитозана, што резултира флуктуацијама производње и квалитета услед сезонских варијација у риболову. Штавише, хитозан добијен из гљивичних извора нуди наводно супериорна својства као што је хомогена дужина полимера и већа растворљивост у поређењу са хитозаном из морских извора. (уп. Гхормаде ет ал., 2017) Да би се обезбедио униформан хитозан, екстракција хитина из гљивичних врста постала је стабилна алтернативна производња. Производња хитина и цитиосана из гљива може се лако и поуздано постићи коришћењем технологије ултразвучне екстракције и деацетилације. Интензивна соникација ремети ћелијске структуре да би ослободила хитин и промовише пренос масе у воденим растварачима за супериорне приносе хитина и ефикасност екстракције. Накнадна ултразвучна деацетилација претвара хитин у вредан хитозан. И ултразвучна екстракција хитина и деацетилација у хитозан могу се линеарно скалирати на било који ниво комерцијалне производње.

Соникација интензивира производњу гљивичног хитозана и чини производњу ефикаснијом и економичнијом.(слика и студија: © Жу и др., 2019)

Резултати истраживања за ултразвучну деацетилацију хитина и хитозана

Зху ет ал. (2018) закључују у својој студији да се ултразвучна деацетилација показала као кључни пробој, претварајући β-хитин у хитозан са 83–94% деацетилације на сниженим реакционим температурама. Слика лево приказује СЕМ слику ултразвучно деацетилованог хитозана (90 В, 15 мин, 20 в/в% НаОХ, 1:15 (г: мЛ) (слика и студија: © Жу и др., 2018)
У њиховом протоколу, раствор НаОХ (20 в/в %) је припремљен растварањем НаОХ пахуљица у ДИ води. Алкални раствор је затим додат у ГЛСП седимент (0,5 г) у односу чврста материја-течност од 1:20 (г: мЛ) у епрувету за центрифугирање. Хитозан је додат у НаЦл (40 мЛ, 0,2 М) и сирћетну киселину (0,1 М) у запреминском односу раствора 1:1. Суспензија је затим подвргнута ултразвуку на благој температури од 25°Ц током 60 минута коришћењем ултразвучног апарата типа сонде (250В, 20кХз). (уп. Зху ет ал., 2018)
 
Пандит и др. (2021) су открили да на брзину разградње за растворе хитозана ретко утичу концентрације киселине која се користи за растворљивост полимера и у великој мери зависи од температуре, интензитета ултразвучних таласа и јонске снаге медија који се користи за растварање полимера. (уп. Пандит ет ал., 2021)
 
У другој студији, Зху ет ал. (2019) користили су прахове спора Ганодерма луцидум као гљивичну сировину и истраживали ултразвучно потпомогнуту деацетилацију и ефекте параметара обраде као што су време соникације, однос чврстог и течног, концентрација НаОХ и моћ зрачења на степен деацетилације (ДД) хитозана. Највећа вредност ДД добијена је при следећим ултразвучним параметрима: 20 мин ултразвучне обраде при 80В, 10% (г:мл) НаОХ, 1:25 (г:мл). Морфологија површине, хемијске групе, термичка стабилност и кристалност ултразвучно добијеног хитозана испитани су помоћу СЕМ, ФТИР, ТГ и КСРД. Истраживачки тим извештава о значајном побољшању степена деацетилације (ДД), динамичког вискозитета ([η]) и молекулске тежине (Мв¯) ултразвучно произведеног хитозана. Резултати су подвукли ултразвучну технику деацетилације гљива као веома моћну методу производње хитозана, која је погодна за биомедицинску примену. (уп. Зху ет ал., 2019)

Врхунски квалитет хитозана са ултразвучном деполимеризацијом и деацетилацијом

Ултразвучно вођени процеси екстракције и деполимеризације хитина/хитозана се могу прецизно контролисати и ултразвучни параметри процеса се могу прилагодити сировинама и циљаном квалитету крајњег производа (нпр. молекулска тежина, степен деацетилације). Ово омогућава прилагођавање процеса ултразвука спољним факторима и постављање оптималних параметара за супериоран исход и ефикасност.
Ултразвучно деацетиловани хитозан показује одличну биорасположивост и биокомпатибилност. Када се ултразвучно припремљени биополимери хитозана упореде са термички добијеним хитозаном у погледу биомедицинских својстава, ултразвучно произведен хитозан показује значајно побољшану одрживост фибробласта (Л929 ћелија) и побољшану антибактеријску активност за Есцхерицхиа цоли (Е. цоли) и Стапхилоцоццус ауреус (С. цоли).
(уп. Зху ет ал., 2018)
 

Слике скенирајуће електронске микроскопије (СЕМ) у увећању од 100× а) гладијуса, б) гладијуса третираног ултразвуком, ц) β-хитина, д) β-хитина третираног ултразвуком и е) хитозана (извор: Прето ет ал. 2017)

Ултразвучна опрема високих перформанси за обраду хитина и хитозана

Фрагментација хитина и децетилација хитина у хитозан захтева моћну и поуздану ултразвучну опрему која може да испоручи високе амплитуде, нуди прецизну контролу над параметрима процеса и може да ради 24/7 под великим оптерећењем и у захтевним окружењима. Хиелсцхер Ултрасоницс асортиман производа поуздано испуњава ове захтеве. Поред изванредних ултразвучних перформанси, Хиелсцхер ултрасоникатори се могу похвалити високом енергетском ефикасношћу, што је значајна економска предност – посебно када се користе у комерцијалној производњи великих размера.
Хиелсцхер ултрасоникатори су системи високих перформанси који могу бити опремљени додацима као што су сонотроде, појачивачи, реактори или проточне ћелије како би на оптималан начин одговарали вашим потребама процеса. Са дигиталним дисплејом у боји, опцијом за унапред подешене соникације, аутоматским снимањем података на интегрисану СД картицу, даљинском контролом претраживача и многим другим функцијама, Хиелсцхер ултрасоникатори обезбеђују највећу контролу процеса и једноставност за корисника. Упарени са робусношћу и великим капацитетом носивости, Хиелсцхер ултразвучни системи су ваш поуздан радни коњ у производњи. Фрагментација и деацетилација хитина захтева снажан ултразвук да би се добила циљана конверзија и финални хитозан производ високог квалитета. Посебно за фрагментацију хитинских пахуљица и кораке деполимеризације/деацетилације, велике амплитуде и повишени притисци су кључни. Индустријски ултразвучни процесори Хиелсцхер Ултрасоницс лако испоручују веома високе амплитуде. Амплитуде до 200 µм могу се континуирано покретати у раду 24/7. За још веће амплитуде, доступне су прилагођене ултразвучне сонотроде. Капацитет снаге Хиелсцхер ултразвучних система омогућава ефикасну и брзу деполимеризацију и деацетилацију у безбедном и кориснику прилагођеном процесу.
 

Синергистички третман хитином побољшан ултразвуком

Да би се превазишли недостаци (тј. ниска ефикасност, висока цена енергије, дуго време обраде, токсични растварачи) традиционалне хемијске и ензимске деацелитације хитина, ултразвук високог интензитета је интегрисан у обраду хитина и хитозана. Соникација високог интензитета и резултујући ефекти акустичне кавитације доводе до брзог цепања полимерних ланаца и смањују полидисперзност, чиме се промовише синтеза хитозана. Штавише, ултразвучне силе смицања интензивирају пренос масе у раствору тако да се појачавају хемијска, хидролитичка или ензимска реакција. Ултразвучни третман хитином се може комбиновати са већ постојећим техникама обраде хитином као што су хемијске методе, хидролиза или ензимске процедуре.

Ултразвучно потпомогнута хемијска деацетилација и деполимеризација

Пошто је хитин нереактиван и нерастворљив биополимер, он мора да прође процесне кораке деминерализације, депротеинизације и деполимеризације/деацетилације да би се добио растворљив и биоприступачан хитозан. Ови кораци процеса укључују третмане јаким киселинама као што је ХЦл и јаким базама као што су НаОХ и КОХ. Како су ови конвенционални процесни кораци неефикасни, спори и захтевају велику енергију, интензивирање процеса ултразвуком значајно побољшава производњу хитозана. Примена моћног ултразвука повећава приносе и квалитет хитозана, скраћује процес са дана на неколико сати, омогућава блаже раствараче и чини цео процес енергетски ефикаснијим.

Ултразвучно побољшана депротеинизација хитина

Ваљехо-Домингез и др. (2021) открили су у свом истраживању депротеинизације хитина да “примена ултразвука за производњу биополимера смањила је садржај протеина као и величину честица хитина. Хитозан високог степена деацетилације и средње молекуларне тежине произведен је ултразвучном асистенцијом.”

Ултразвучна хидролиза за деполимеризацију хитина

За хемијску хидролизу, или киселине или алкалије се користе за деацетилацију хитина, међутим алкална деацетилација (нпр. натријум хидроксид НаОХ) се више користи. Кисела хидролиза је алтернативни метод традиционалној хемијској деацетилацији, где се раствори органске киселине користе за деполимеризацију хитина и хитозана. Метода киселе хидролизе се углавном користи када молекулска маса хитина и хитозана мора бити хомогена. Овај конвенционални процес хидролизе познат је као спор и енергетски и трошковно интензиван. Потреба за јаким киселинама, високим температурама и притисцима су фактори који претварају процес хидролитичког хитозана у веома скупу и дуготрајну процедуру. Коришћене киселине захтевају низводне процесе као што су неутрализација и одсољавање.
Интеграцијом ултразвука велике снаге у процес хидролизе, захтеви за температуром и притиском за хидролитичко цепање хитина и хитозана могу се значајно смањити. Штавише, соникација омогућава ниже концентрације киселина или употребу блажих киселина. Ово чини процес одрживијим, ефикаснијим, исплативијим и еколошки прихватљивијим.

Ултразвучно потпомогнута хемијска деацетилација

Хемијска дезинтеграција и деактеилација хитина и хитозана углавном се постиже третирањем хитина или хитозана минералним киселинама (нпр. хлороводоничном киселином ХЦл), натријум нитритом (НаНО₂), или водоник пероксид (Х₂О₂). Ултразвук побољшава брзину деацетилације и на тај начин скраћује време реакције потребно за постизање циљаног степена деацетилације. То значи да ултразвук смањује потребно време обраде од 12-24 сата на неколико сати. Штавише, соникација омогућава знатно ниже хемијске концентрације, на пример 40% (в/в) натријум хидроксида коришћењем ултразвука, док је 65% (в/в) потребно без употребе ултразвука.

Ултразвучно-ензимска деацетилација

Док је ензимска деацетилација благ, еколошки бенигни облик обраде, његова ефикасност и трошкови су неекономични. Због сложене, радно интензивне и скупе низводне изолације и пречишћавања ензима из крајњег производа, ензимска деацетилација хитина се не примењује у комерцијалној производњи, већ се користи само у научноистраживачкој лабораторији.
Ултразвучни предтретман пре ензимске деацелитације фрагментира молекуле хитина чиме се повећава површина и чини више површине доступном за ензиме. Соникација високих перформанси помаже да се побољша ензимска деацетилација и чини процес економичнијим.