Ultrazvučnost je visoko efikasna metoda oslobađanja čitina i čitosana iz gljivičnih izvora kao što su pečurke. Chitin i chitosan moraju biti deacetilizovani u obradi toka da bi se dobio visokokvalitetni biopolimer. Ultrasonično potpomognuta deacetilacija je veoma efikasnost, jednostavna i brza tehnika, koja rezultira visokokvalitetnim čitosanima sa visokom molekularnom težinom i superiornom bioavabilnošću.

Chitin i Chitosan iz Pečurki

Jestive i lekovite pečurke kao što su Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi ili reishi), Inonotus obliquus (chaga), Agaricus bisporus (dugmiće pečurke), Hericium erinaceus (lavlja griva), Cordyceps sinensis (gusenica gljivica), Grifola frondosa (hen-of-the-wood), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, ćuretin) i mnoge druge vrste gljivica se široko koriste kao hrana i za vađenje bioaktivnih jedinjenja. Ove pečurke kao i za preradu zadužih pečuraka (otpad od pečuraka) mogu se koristiti za proizvodnju čitosana. Ultrazvučnost ne samo da promoviše oslobađanje čitina iz strukture zidova gljivičnih ćelija, već pokreće i pretvaranje čitosana u vredan čitosan putem ultrazvučne depolimerizacije.

Deacetilacija "chitin" u "chitosan" promovisana je sonacija

chitin, koji je N-acetylglucosamine polimer (poli-(β-(1–4)-N-acetyl-D-glukozamin), je prirodni polisakharid koji se naširoko nalazi u egzoskeletu invertebrata kao što su krstaški i insekti, unutrašnji skelet lignje i sipa kao i ćelijske zidove gljivica. Ugrađen u strukturu zidova ćelija pečuraka, čitin je odgovoran za oblik i krutost gljivičnog ćelijskog zida. Za mnoge aplikacije, chitin se pretvara u svoj deacetylated derivative, poznat kao chitosan putem procesa depolymerizacije.
chitosan je najčešći i najvredniji derivat čitina. To je polisakharid visoke molekularne težine povezan b-1,4 glikoside, sastavljen od N-acetyl-glukozamina i glukozamina.
Čitosan se može proisteći kroz hemijski ili enzimatski N- Deacetylation. U hemijski vođenom procesu deacetilacije, acetilna grupa (R-NHCOCH₃) je odsečen jakim alkalima na visokim temperaturama. Alternativno, čitosan se može sintetizovati enzimskom deacetilnošću. Međutim, na skali industrijske proizvodnje hemijska deacetilacija je poželjna tehnika, s obzirom da je enzimska deacetilacija znatno manje efikasna zbog visoke cene enzima deacetilaze i niskih prinosa čitosana koji se dobijaju. Ultrazvučnost se koristi za intenziviranje hemijske degradacije (1→4)-/β-linka (depolymerization) i efekat deacetilacije čitina radi dobijanja visokokvalitetnog čitosana. Kada se sonication primenjuje kao pred-tretman za enzimatsku deacetilaciju, prinos chitosana i kvalitet se takođe poboljšavaju.

Industrijska proizvodnja čitosana od pečuraka sa ultrazvukom

Komercijalna proizvodnja čitina i čitosana uglavnom se zasniva na otpadu morske industrije (npr. ribolovu, žetvi školjki i sl.). Različiti izvori sirovina rezultiraju različitim kvalitetima čitina i čitosana, što rezultira proizvodnjom i kvalitetnim oscilacijama zbog sezonskih varijacija ribolova. Pored toga, čitosan izveden iz gljivičnih izvora nudi navodno superiorna svojstva kao što su homogena polimerna dužina i veća rastvorljivost u poređenju sa čitosanom iz morskih izvora. (cf. Ghormade et al., 2017) U cilju snabdevanja ujednačenim čitosanom, vađenje čitina iz gljivičnih vrsta postalo je stabilna alternativna proizvodnja. Proizvodnja čitina i citiozana od gljivičnih gljivi može se lako i pouzdano postići korišćenjem ultrazvučnog vađenja i tehnologije deacetilacije. Intenzivna sonicija remeti ćelijske strukture da oslobode čitin i promoviše masovni prenos u aqueous rastvaračima za superiorne prinose čitina i efikasnost ekstrakcije. Naknadna ultrazvučna deacetilacija pretvara čitin u vredan čitosan. I jedno i drugo, ultrazvučno vađenje čitina i deacetilacija na chitosan mogu se linearno popeti na bilo koji nivo komercijalne proizvodnje.

Sonicija intenzivira proizvodnju gljivičnog čitosana i čini proizvodnju efikasnijom i ekonomičnijom.
(slika i studija: © Zhu et al., 2019)

Highly Efficient Chitosan Synthesis via Sonication

U cilju prevazilaženja mana (ili,niske efikasnosti, visokih troškova energije, dugog vremena obrade, toksičnih rastvarača) tradicionalne hemijske i enzimske deakcije čitin, ultrazvuk visokog intenziteta integrisan je u obradu čitina i čitosana. Sonicija visokog intenziteta i posledica akustične kavitacije dovode do brzog sajsija polimerskih lanaca i smanjuju polidisperziju, čime se promoviše sinteza čitosana. Pored toga, ultrazvučne čaršije intenziviraju masovni prenos u rastvoru tako da se pojača hemijska, hidrolitička ili enzimska reakcija.

Ultrasonično potpomognute hemijske deacetilacije i depolimerizacije

Pošto je chitin nereaktivni i nerešivi biopolimer, mora da prođe kroz procesne korake demineralizacije, deproteinizacije i dezolimerizacije / deacetilizacije da bi dobio rastvorljiv i bioacesivan čitosan. Ovi procesni koraci uključuju tretmane jakim kiselinama kao što su HCL i jake baze kao što su NAOH i KOH. Kako su ovi konvencionalni procesni koraci neefikasni, spori i zahtevaju visoku energiju, intenziju procesa sonikacijom značajno poboljšava proizvodnju čitosana. Primena power-ultrazvuka povećava prinose i kvalitet čitosana, smanjuje proces sa dana na nekoliko sati, omogućava blaže rastvarače i čini ceo proces energetski efikasnijim.

Ultrasonično poboljšana deproteinizacija Čitina

Vallejo-Domingez et al. (2021) je u svojoj istrazi o deproteinizaciji čitina utvrdio da je "primena ultrazvuka za proizvodnju biopolimera smanjila sadržaj proteina kao i veličinu čestica čitina. Chitosan visokog stepena deacetilacije i srednje molekularne težine proizveden je kroz ultrazvučnu pomoć.

Ultrazvučna hidroliza za čitinsku depolimerizaciju

Za hemijsku hidrolizu koriste se kiseline ili alkalnosti za deacetilaciju čitina, međutim alkalna deacetilacija (npr. natrijum hidroksid NaOH) se šire koristi. Kisela hidroliza je metod alternative tradicionalnoj hemijskoj deacetilizaciji, gde se koriste rastređivanja organske kiseline za dezolimerizaciju čitina i čitosana. Metoda hidrolize kiseline se uglavnom koristi kada molekularna težina čitina i čitosana mora da bude homogena. Ovaj konvencionalni proces hidrolize poznat je kao spor i energetski i skup. Zahtevi jakih kiselina, visokih temperatura i pritisaka su faktori koji hidrolitički proces čitosana pretvaraju u veoma skupu i vremenski zahtevnu proceduru. Kiseline koje se koriste zahtevaju nizvodne procese kao što su neutralisanje i desalting.
Sa integracijom ultrazvuka visoke snage u proces hidrolize, zahtevi temperature i pritiska za hidrolitički dekolte čitina i čitosana mogu se značajno spustiti. Osim toga, sonicija omogućava nižu koncentraciju kiseline ili upotrebu blažih kiselina. To čini proces održivijim, efikasnijim, isplativijim i ekološki prihvatljivijim.

Ultrasonično potpomognute hemijske deacetilacije

Hemijska dezintegracija i deaktejlacija čitina i čitosana uglavnom se postiže lečenjem čitina ili čitosana mineralnim kiselinama (npr. hidrohlornom kiselinom HCl), natrijum nitritom (NaNO)₂), ili vodonik peroksid (H₂O₂). Ultrazvuk poboljšava stopu deacetilacije i time skraćuje vreme reakcije potrebno za dobijanje ciljanog stepena deacetilacije. To znači da sonication snizi potrebno vreme obrade za 12-24 sata na nekoliko sati. Pored toga, sonication omogućava znatno niže hemijske koncentracije, na primer 40% (w/w) natrijum hidroksida koji koristi sonication dok je 65% (w/w) potrebno bez upotrebe ultrazvuka.

Ultrazvučno-enzimatska deacetilacija

Dok je enzimska deacetilacija blagi, ekološki dobroćudni oblik obrade, njegova efikasnost i troškovi su neekonomski. Zbog složene, radne intenzivne i skupe nizvodne izolacije i pročišćavanja enzima iz krajnjeg proizvoda, enzimska chitin deacetylation se ne primenjuje u komercijalnoj proizvodnji, već se koristi samo u naučnoistraživačke laboratorije.
Ultrazvučni pred-tretman pre enzimske deakvitacije fragmenti molekula čitina time uvećavaju površinsku površinu i čine više površine dostupnom za enzime. Sonicija visokih performansi pomaže da se poboljša enzimska deacetilacija i čini proces ekonomskijim.

Rezultati istraživanja za ultrazvučni Chitin i Chitosan Deacetylation

Zhu et al. (2018) zaključuju u svojoj studiji da se ultrazvučna deacetilacija pokazala kao presudan pomak, pretvarajući β-čitin u čitosan sa 83–94% deacetilacije na smanjenim temperaturama reakcije. Na slici levo prikazana je SEM slika ultrazvučno deacetylated chitosan (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (slika i studija: © Zhu et al., 2018)
U svom protokolu, NaOH rešenje (20 w/v %) je pripremljeno rastvaranjem NaOH pahuljica u DI vodi. Alkalno rešenje je potom dodato u GLSP talog (0,5 g) u odnosu čvrste tečnosti od 1:20 (g: mL) u centrifuge cevi. Chitosan je dodat u NaCl (40 mL, 0,2 M) i acetičnu kiselinu (0,1 M) u odnosu jačine 1:1 rastvora. Suspenzija je potom bila podvrgnuta ultrazvuku na blagoj temperaturi od 25°C za 60 min koristeći ultrazvučni tip sonde (250W, 20kHz). (cf Zhu et al., 2018)
Pandit et al. (2021) je ustanovio da stopa degradacije za chitosan rastvore retko utiče na koncentracije kiseline koja se koristi za rastvaranje polimera i u velikoj meri zavisi od temperature, intenziteta ultrazvučnih talasa i ionske jačine medija koji se koriste za rastvaranje polimera. (cf. Pandit et al., 2021)

U drugoj studiji, Zhu et al. (2019) je koristio Ganoderma lucidum spore pudere kao gljivičnu sirovinu i istraživao ultrasonično‐asistiranu deacetilaciju i efekte obrade parametara kao što su vreme sonicije, solid‐to‐tečni odnos, Koncentracija NaOH i snaga iradiacije na stepenu deacetylation (DD) Najveća DD vrednost dobijena je po sledećim ultrazvučnim parametrima: 20 min sonication na 80W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Površinska morfologija, hemijske grupe, toplotna stabilnost i kristalnost ultrazvučno dobijenog čitosana ispitani su pomoću SEM- a, FTIR-a, TG-a i XRD-a. Istraživački tim izveštava o značajnom poboljšanju stepena deacetilacije (DD), dinamične viskoznosti ([η]) i molekularne težine (Mv ̄) ultrazvučno proizvedenog čitosana. Rezultati su podvukli ultrazvučnu tehniku deacetilacije gljivice veoma moćnu metodu proizvodnje za čitosan, koja je pogodna za biomedicinske primene. (cf. Zhu et al., 2019)

SEM slike čitina i čitosana iz dve vrste pečuraka: a) Čitin iz L. veljereusa; b) Čitin iz P. ribisa; c) Chitosan iz L.vellereus; d) chitosan iz P. ribis.
picture and study: © Erdoan et al., 2017

Superior Chitosan Quality with Ultrasonic Deacetylation

Ultrasonično vođeni procesi vađenja čitina / čitosana i depolimerizacije su precizno kontrolni i ultrazvučni parametri procesa mogu da se prilagode sirovinama i ciljanom kvalitetu krajnjeg proizvoda (npr. molekularna težina, stepen deacetilacije). To omogućava prilagođavanje ultrazvučnog procesa spoljnim faktorima i postavljanje optimalnih parametara za superiorni ishod i efikasnost.
Ultrasonično deacetilni čitosan pokazuje odličnu bioavailnost i biokompatibilnost. Kada se ultrasonično pripremljeni chitosan biopolimeri porede sa termički izvedenim chitosanom u vezi sa biomedicinskim svojstvima, ultrasonično proizvedeni chitosan eksponati značajno poboljšavaju fibroblast (L929 ćeliju) isplativost i poboljšanu antibakterijsku aktivnost i za Ešerihiju koli (E. coli) i stafilokokus aureus (S.
(cf. Zhu et al., 2018)

Kako funkcioniše ultrazvučno vađenje i deacetilacija Čitina?

Kada su energetski ultrazvučni talasi parovi u tečnost ili mulj (npr. suspenzija koja se sastoji od čitina u rastvaraču), ultrazvučni talasi putuju kroz tečnost uzrokujući naizmenični ciklus visokog pritiska / niskog pritiska. Tokom ciklusa niskog pritiska stvaraju se minuti vakuumskih mehurića (takozvani mehurići kavitacije) koji rastu tokom nekoliko ciklusa pritiska. U određenoj veličini, kada mehurići ne mogu da apsorbuju više energije, oni nasilno imploduju tokom ciklusa visokog pritiska. Imploziju mehurića karakterišu intenzivne kavitacione (ili sonomehaničke) sile. Ovi sonomehanički uslovi javljaju se lokalno u kavitacionom žarištu i karakterišu ih veoma visoke temperature i pritisci do 4000K odnosno 1000atm; kao i odgovarajuće visoke temperaturne i pod pritiskom. Furtehrmore, mikro turbulencije i tečni tokovi sa brzinom do 100m/s se generišu. Ultrazvučno vađenje čitina i čitosana iz gljivice i krstaša kao i čitin depolimerizacija i deacetilacija uglavnom su uzrokovani sonomehaničkim efektima: agitacije i turbulencije remete ćelije i promovišu masovni prenos a takođe mogu da preseku polimerne lance u kombinaciji sa kiselim ili alkalnim rastvaračima.
Radni princip vađenja čitina putem ultrazvučnosti: Ultrazvučno vađenje efikasno razbija ćelijsku strukturu pečuraka i oslobađa intracelularna jedinjenja iz ćelijskog zida i unutrašnjosti ćelija (ili, polisakharida kao što su čitin i čitosan i druge bioaktivne fitohemičarije) u rastvarač. Ultrazvučno vađenje se zasniva na radnom principu akustične kavitacije. Efekti ultrazvučne / akustične kavitacije su visoke sile, turbulencije i intenzivni razlikujeci pritiska. Ove sonomehaničke sile razbijaju ćelijske strukture kao što su zidovi ćelija sa pečurkama, promovišu masovni prenos između gljivičnih biomaterijala i rastvaraca i rezultiraju veoma visokim prinosima ekstrakta u okviru brzog procesa. Pored toga, sonicija promoviše sterilizaciju ekstrakata ubijanjem bakterija i mikroba. Mikrobiološka inaktivacija sonikacijom je rezultat destruktivnih kavitacionih sila ćelijske membrane, proizvodnje slobodnih radikala i lokalizovanog grejanja.
Radni princip depolimerizacije i deacetilacije putem ultrazvučnosti: Polimerni lanci su uhvaćeni u polju šlajma oko mehura i lančani segmenti polimernog namotaja blizu urušene šupljine kretaće se većom brzinom od onih dalje. Stresovi se zatim proizvode na polimernom lancu zbog relativnog kretanja polimernih segmenata i rastvarača i to je dovoljno da izazovu dekolte. Proces je stoga sličan drugim efektima šeringa u polimerna rešenja ~2° i daje veoma slične rezultate. (cf. Price et al., 1994)

Ultrazvučna oprema visokih performansi za gljivičnu čitin i čitosansku obradu

Skeniranje Electron mikroskopije (SEM) slika na uveličanje 100 × a) gladijus, b) ultrazvucen gladijus, c) β-chitin, d)-tretirani β-chitin, i e) chitosan (izvor: preto et Al. 2017)

Fragmentacija čitina i obmanjivanje čitina do čitosana zahtevaju moćnu i pouzdanu ultrazvučnu opremu koja može da isporuči visoke amplitude, nudi preciznu kontrolu nad parametrima procesa i može se raditi non-stop pod velikim opterećenjem i u zahtevnim okruženjima. Proizvodni asortiman Hielscher Ultrasonics-a pouzdano ispunjava ove zahteve. Pored izvanrednih ultrazvučnih performansi, Hielscher ultrazvučni se mogu pohvaliti i visokom energetskom neefikasnošću, što je značajna ekonomična prednost – naročito kada se zapošljava na komercijalnoj velikoj proizvodnji.
Hielscher ultrazvučni uređaji su sistemi visokih performansi koji mogu biti opremljeni dodatnom opremom kao što su sonotrodi, pojačivači, reaktori ili ćelije toka kako bi se vaše procesne potrebe uskladile na optimalan način. Uz digitalni prikaz boja, osigurana je opcija unapred određenog sonifika, automatskog snimanja podataka na integrisanoj SD kartici, daljinskog upravljača pregledača i još mnogo funkcija, najviše kontrole procesa i user-friendlinessa. Upareni sa robustnošću i velikim kapacitetom nosivosti tereta, Hielscher ultrazvučni sistemi su vaš pouzdani radni konj u proizvodnji. 
Čitinska fragmentacija i deacetilacija zahtevaju snažan ultrazvuk za dobijanje ciljane konverzije i konačni chitosan proizvod visokog kvaliteta. Naročito za fragmentaciju čitinskih pahuljica i depolimerizaciju / deacetilacione korake, visoke amplitude i povišen pritisak su ključni. Industrijski ultrazvučni procesori Hielscher Ultrasonics-a lako isporučuju veoma visoke amplitude. Amplitude do 200μm se mogu neprekidno pokrenuti u 24/7 operaciji. Za još veće amplitude dostupni su prilagođeni ultrazvučni sonotrodi. Kapacitet snage Hielscher ultrazvučnih sistema omogućava efikasnu i brzu deacetilaciju u bezbednom i korisnom procesu.
Табела испод показује приближни капацитет обраде наших ултразвучних уређаја: