Sonikacija za lizo celic: razgradnja celic in ekstrakcija
Ultrazvočna liza celic je pogosto uporabljena tehnika priprave vzorcev v sodobnih biotehnoloških laboratorijih. Njen glavni namen je razgraditi celične membrane ali celotne celice, da se sprostijo znotrajcelične sestavine, kot so beljakovine, nukleinske kisline ali organeli. Pri vsakdanjem laboratorijskem delu to pomeni, da je sonikacija standardna metoda za nadzorovano razgradnjo celic in učinkovito ekstrakcijo biomolekul. Ključna prednost sonikatorjev je njihova zmožnost natančnega uravnavanja ključnih procesnih parametrov, vključno z intenzivnostjo ultrazvoka, pulziranjem in nadzorom temperature. Ta nadzor raziskovalcem omogoča zanesljivo lizo ob čim manjših toplotnih ali mehanskih poškodbah občutljivih biomolekul, kar zagotavlja blag, a zelo učinkovit postopek ekstrakcije.
Liza celic s sonikatorji
Ultrazvočna liza celic uporablja akustično kavitacijo za razgradnjo celičnih membran in sproščanje znotrajceličnih molekul. Hielscher Ultrasonics ponuja klasični sonikator s sondo in sonikatorje za več vzorcev za sterilno obdelavo: VialTweeter za več epruvet in vial ter sonikator za plošče s 96 vdolbinicami UIP400MTP za standardne mikroplošče.
Hielscher Ultrasonics dobavlja zmogljive brezkontaktne sonikatorje za pripravo vzorcev in klinične analize. Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn in pretočni sonikator GDmini2 obdelujejo vzorce v sterilnih pogojih.
Ultrazvočna homogenizatorja UP100H (100 vatov) in UP400St (400 vatov): sonikacija za lizo celic in ekstrakcijo.
Ultrazvočni homogenizatorji za lizo celic in ekstrakcijo
| Vrsta ultrazvočne naprave | Glavno področje uporabe | Prostornina vzorca | Tipičen primer uporabe | Prednosti | Primeri modelov |
|---|---|---|---|---|---|
| Sonikatorji s sondo | Sonikacija posameznega vzorca | 0,1 mL do ~1000 mL | Liza celic, ekstrakcija beljakovin, fragmentacija DNA/RNA | Natančen nadzor energije; različne sonotrode; optimalni za majhne do srednje velike vzorce | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Vzporedna obdelava več zaprtih vial | 8–10 vial (~1–20 mL vsaka) | Standardizirana liza več celičnih suspenzij | Enakomerna sonikacija; preprečuje navzkrižno kontaminacijo; ponovljivi rezultati | VialTweeter, CupHorn |
| Sonikator za plošče s 96 vdolbinicami | Sonikacija plošč z več vdolbinicami in mikrotitrskih plošč | Format mikroplošče | Presejanje z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev, proteomika, celični testi | Sočasna, enakomerna sonikacija v vseh vdolbinicah; idealen za delovne postopke z več vzorci | UIP400MTP |
| Reaktorji s pretočno celico | Neprekinjena sonikacija za večje prostornine | >1 L, možnost povečanja obsega | Razgradnja celic v industrijskem obsegu, proizvodnja ekstraktov | Neprekinjena obdelava; možnost povečanja obsega; popoln nadzor procesa (amplituda, tlak, temperatura) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + pretočna celica |
| Sistemi za sterilno / posredno sonikacijo | Obdelava vzorcev brez kontaminacije | Odvisno od viale/epruvete/mikroplošče | Občutljivi vzorci, sterilna okolja, okolja z regulativnimi zahtevami | Brez stika s sondo; preprečuje prenos ostankov med vzorci; minimalno čiščenje | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Prednosti uporabe sonikacije za lizo celic
V primerjavi z drugimi metodami lize celic in ekstrakcije ima ultrazvočna liza celic več prednosti:
- Hitrost: Ultrazvočna liza celic in ekstrakcija je hitra metoda, ki lahko celice razgradi v nekaj sekundah. To je veliko hitreje kot druge metode, kot so homogenizacija, zamrzovanje in odtajanje ali mletje s kroglicami.
- Učinkovitost: Ultrazvočna liza celic in ekstrakcija se lahko uporablja za obdelavo majhnih, velikih ali več vzorcev hkrati, zato je učinkovitejša od drugih metod, ki zahtevajo posamično obdelavo majhnih vzorcev.
- Brez kemikalij: Ultrazvočna liza celic in ekstrakcija je neinvazivna metoda, ki ne zahteva uporabe agresivnih kemikalij ali encimov. Zato je idealna za uporabo, pri kateri je treba ohraniti neokrnjenost celične vsebine. Neželeni kontaminaciji vzorcev se je mogoče izogniti.
- Visok izkoristek: Ultrazvočna liza celic in ekstrakcija omogoča ekstrakcijo celične vsebine z visokim izkoristkom, vključno z DNA, RNA in beljakovinami. To je zato, ker visokofrekvenčni zvočni valovi razgradijo celične stene in sprostijo vsebino v okoliško raztopino.
- Nadzor temperature: Napredni ultrazvočni procesorji omogočajo natančen nadzor temperature vzorca. Digitalni sonikatorji Hielscher so opremljeni s priključljivim temperaturnim tipalom in programsko opremo za spremljanje temperature.
- Ponovljivost: Protokole za ultrazvočno lizo celic je mogoče preprosto ponoviti in jih s preprostim linearnim povečanjem obsega celo prilagoditi različnim večjim ali manjšim prostorninam vzorcev.
- Vsestranskost: Ultrazvočna liza celic in ekstrakcija se lahko uporablja za ekstrakcijo številnih vrst celic, vključno z bakterijami, kvasovkami, glivami ter rastlinskimi celicami in celicami sesalcev. Uporablja se lahko tudi za ekstrakcijo različnih vrst molekul, vključno z beljakovinami, DNA, RNA in lipidi.
- Sočasna priprava številnih vzorcev: Hielscher Ultrasonics ponuja več rešitev za priročno obdelavo številnih vzorcev v povsem enakih procesnih pogojih. Zato je korak priprave vzorcev z lizo in ekstrakcijo zelo učinkovit in prihrani čas.
- Preprosta uporaba: Oprema za ultrazvočno lizo celic in ekstrakcijo je preprosta za uporabo in zahteva minimalno usposabljanje. Oprema je tudi ekonomična, saj gre za enkratno naložbo brez potrebe po ponovnem nakupu potrošnega materiala za enkratno uporabo. Zato je privlačna za širok krog raziskovalcev in laboratorijev.
Na splošno je ultrazvočna liza celic in ekstrakcija hitra, učinkovita, natančno nadzorljiva in vsestranska metoda za ekstrakcijo celične vsebine. Zaradi prednosti pred alternativnimi metodami je privlačna izbira za številne raziskovalne in industrijske uporabe.
Načelo delovanja ultrazvočne lize celic
Ultrazvočna liza celic in ekstrakcija uporablja visokofrekvenčne zvočne valove za razgradnjo celic in ekstrakcijo njihove vsebine. Zvočni valovi povzročajo spremembe tlaka v okoliški tekočini, zaradi česar nastajajo in se sesedajo majhni mehurčki v procesu, imenovanem kavitacija. Ti mehurčki ustvarjajo lokalizirane zelo intenzivne mehanske sile, ki lahko razgradijo celice in sprostijo njihovo vsebino v okoliško raztopino.
Liza celic z ultrazvočnim procesorjem običajno vključuje naslednje korake:
- Vzorec se namesti v epruveto ali posodo s tekočim pufrom.
- V vzorec se vstavi ultrazvočna sonda in uporabijo se visokofrekvenčni zvočni valovi s frekvenco približno 20–30 kHz.
- Ultrazvočni valovi povzročajo nihanje in kavitacijo v okoliški tekočini ter ustvarjajo lokalizirane sile, ki razgradijo celice in sprostijo njihovo vsebino.
- Vzorec se centrifugira ali filtrira, da se odstranijo vsi celični ostanki, ekstrahirana vsebina pa se zbere za nadaljnjo analizo.
Slabosti običajnih metod lize
Pri delu v laboratorijih ste morda že izkusili težave pri lizi celic z uporabo tradicionalnih protokolov mehanske ali kemične lize.
- Mehanska liza: Metode mehanske lize, kot so drobljenje v terilnici s pestilom ali homogenizacija s francosko stiskalnico, mlinom s kroglicami ali rotorsko-statorskim sistemom, pogosto nimajo možnosti natančnega nadzora in prilagajanja. To pomeni, da lahko mletje in drobljenje hitro ustvarita toploto in strižne sile, ki lahko poškodujejo vzorec in denaturirajo beljakovine. Te metode so lahko tudi zamudne in zahtevajo velike količine izhodnega materiala.
- Kemična liza: Metode kemične lize, kot je liza z detergenti, lahko poškodujejo vzorec z razgradnjo lipidnega dvosloja in denaturacijo beljakovin. Zahtevajo lahko tudi več korakov in lahko puščajo ostanke kontaminantov, ki motijo nadaljnje postopke. Določitev optimalnega odmerka detergenta je dodaten izziv.
- Cikli zamrzovanja in odtajanja: Cikli zamrzovanja in odtajanja lahko povzročijo pretrganje celičnih membran, vendar lahko ponavljajoči se cikli povzročijo tudi denaturacijo in razgradnjo beljakovin. Ta metoda lahko zahteva tudi več ciklov, kar je lahko zamudno in pogosto vodi do nižjih izkoristkov.
- Encimska liza: Metode encimske lize so lahko specifične za določene vrste celic in zahtevajo več korakov, zato so zamudne. Ustvarjajo tudi odpadke in zahtevajo skrbno optimizacijo, da se prepreči razgradnja vzorca. Kompleti za encimsko lizo so pogosto dragi. Če vaš trenutni postopek encimske lize daje nezadostne rezultate, lahko sonikacijo uporabite kot sinergistično metodo za intenziviranje razgradnje celic.
V primerjavi s konvencionalnimi metodami mehanske in kemične lize celic je sonikacija zelo učinkovito in zanesljivo orodje za razgradnjo celic, ki omogoča popoln nadzor nad parametri sonikacije. To zagotavlja visoko selektivnost sproščanja snovi in čistost izdelka. [prim. Balasundaram et al., 2009]
Primerna je za vse vrste celic in jo je preprosto uporabljati v majhnem in velikem obsegu – vedno v nadzorovanih pogojih. Ultrazvočne procesorje je preprosto čistiti. Ultrazvočni homogenizator ima vedno funkciji čiščenja na mestu (CIP) in sterilizacije na mestu (SIP). Sonotropa je sestavljena iz masivnega titanovega telesa, ki ga je mogoče obrisati ali izprati z vodo ali topilom (odvisno od delovnega medija). Vzdrževanje ultrazvočnih procesorjev je zaradi njihove robustnosti skoraj zanemarljivo.
Ultrazvočna liza in razgradnja celic
Na splošno liza vzorcev v laboratoriju traja od 15 sekund do 2 minut. Ker je intenzivnost sonikacije zelo preprosto prilagoditi z nastavitvijo amplitude in časa sonikacije ter z izbiro ustrezne opreme, je mogoče celične membrane razgraditi zelo blago ali zelo sunkovito, odvisno od celične strukture in namena lize (npr. ekstrakcija DNA zahteva blažjo sonikacijo, popolna ekstrakcija beljakovin iz bakterij pa intenzivnejšo ultrazvočno obdelavo). Temperaturo med procesom je mogoče spremljati z vgrajenim temperaturnim tipalom in jo preprosto nadzorovati s hlajenjem (ledena kopel ali pretočne celice s hladilnimi plašči) ali s sonikacijo v pulznem načinu. Pri sonikaciji v pulznem načinu kratki cikli sonikacijskih sunkov, ki trajajo 1–15 sekund, omogočajo odvajanje toplote in hlajenje med daljšimi vmesnimi premori.
Vsi procesi, ki jih poganja ultrazvok, so popolnoma ponovljivi in omogočajo linearno prilagajanje obsega.
VialTweeter je ultrazvočni homogenizator za sočasno, enakomerno in hitro sterilno pripravo številnih vzorcev.
- Priprava celične suspenzije: celične pelete je treba s homogenizacijo popolnoma suspendirati v pufrski raztopini (izberite pufrsko raztopino, ki je združljiva z nadaljnjo analizo, npr. s specifično kromatografsko metodo). Po potrebi dodajte lizocime in/ali druge dodatke (tudi ti morajo biti združljivi s sredstvi za ločevanje/čiščenje). Raztopino nežno mešajte/homogenizirajte z blago sonikacijo, dokler ne dosežete popolnega suspendiranja.
Preberite več o sinergijah lizocimov v kombinaciji s sonikacijo! - Ultrazvočna liza: vzorec postavite v ledeno kopel. Za razgradnjo celic suspenzijo sonikirajte v 60–90 sekund dolgih sunkih (s pulznim načinom sonikatorja).
- Ločevanje: centrifugirajte lizat (npr. 10 min. pri 10.000 x g; pri 4degC). Supernatant previdno ločite od celičnega peleta. Supernatant je celotni celični lizat. Po filtraciji supernatanta dobite bistro tekočino s topnimi celičnimi beljakovinami.
Najpogostejše uporabe ultrazvočnih procesorjev v biologiji in biotehnologiji so:
- Priprava celičnega ekstrakta
- Razgradnja kvasovk, bakterij, rastlinskih celic, mehkega ali trdega celičnega tkiva, nukleinskega materiala
- Ekstrakcija beljakovin
- Priprava in izolacija encimov
- Proizvodnja antigenov
- Ekstrakcija DNA in/ali ciljna fragmentacija
- Priprava liposomov
Razgradnja celic z ultrazvočnim procesorjem s sondo je učinkovita metoda priprave vzorcev.
Raznovrstne uporabe ultrazvoka segajo na področja biotehnologije, bioinženirstva, mikrobiologije, molekularne biologije, biokemije, imunologije, bakteriologije, virologije, proteomike, genetike, fiziologije, celične biologije, hematologije in botanike.
Liza: razgradnja celičnih struktur
Celice ščiti polprepustna plazemska membrana, ki jo sestavlja fosfolipidni dvosloj (tudi beljakovinsko-lipidni dvosloj; tvorijo ga hidrofobni lipidi in hidrofilne molekule fosforja z vgrajenimi beljakovinskimi molekulami) in ustvarja pregrado med notranjostjo celice (citoplazmo) in zunajceličnim okoljem. Rastlinske in prokariontske celice obdaja celična stena. Zaradi več plasti debele celične stene iz celuloze je rastlinske celice težje lizirati kot živalske. Notranjost celice, kot so organeli, jedro in mitohondrij, stabilizira citoskelet.
Namen lize celic je ekstrakcija in ločevanje organelov, beljakovin, DNA, mRNA ali drugih biomolekul.
Konvencionalne metode lize celic in njihove slabosti
Obstaja več metod lize celic, ki jih je mogoče razdeliti na mehanske in kemične metode ter vključujejo uporabo detergentov ali topil, uporabo visokega tlaka ali uporabo mlina s kroglicami ali francoske stiskalnice. Najbolj problematična slabost teh metod je težaven nadzor in prilagajanje procesnih parametrov ter s tem njihovega učinka.
Spodnja tabela prikazuje glavne slabosti običajnih metod lize:
Tabela: konvencionalne metode lize celic imajo velike slabosti
Postopek lize
Liza je občutljiv proces. Med lizo se uniči zaščita celične membrane, vendar je treba preprečiti inaktivacijo, denaturacijo in razgradnjo ekstrahiranih beljakovin zaradi nefiziološkega okolja (odstopanja od vrednosti pH). Zato se liza praviloma izvaja v pufrski raztopini. Večina težav nastane zaradi nenadzorovane razgradnje celic, ki povzroči neciljno sproščanje vsega znotrajceličnega materiala in/ali denaturacijo ciljnega izdelka.
Pogosta vprašanja o sonikaciji in lizi celic
- Ali lahko celice liziramo s sonikacijo? Da, sonikacija učinkovito lizira celice z visokofrekvenčnimi ultrazvočnimi valovi, ki povzročajo kavitacijo, pojav, pri katerem v celični suspenziji nastajajo drobni parni mehurčki in se silovito sesedajo. Nastale mehanske sile razgradijo celične membrane in omogočajo sproščanje znotrajceličnih sestavin v tekočino.
- Kako uporabiti sonikator za lizo celic? Uporaba sonikatorja za lizo celic vključuje potopitev sonde sonikatorja v celično suspenzijo in prilagoditev parametrov, kot sta amplituda in trajanje pulza. Proces je treba skrbno spremljati, da se optimizira razgradnja celic ob čim manjši denaturaciji beljakovin in inaktivaciji encimov.
- Kakšno je načelo sonikacije za lizo celic? Sonikacija deluje po načelu akustične kavitacije. Ultrazvočna energija se prenaša v tekoči medij, kjer povzroča hitra nihanja tlaka, ki vodijo do nastanka in implozije mikromehurčkov. Te implozije ustvarjajo intenzivne strižne sile in lokalizirane visoke temperature, razgrajujejo celične strukture ter izboljšujejo homogenost lizata.
- Kako dolgo traja sonikacija za lizo celic? Trajanje sonikacije za lizo celic se lahko precej razlikuje glede na dejavnike, kot so vrsta celic, gostota celic, moč sonikatorja in uporabljeni specifični protokol. Tipični postopki lahko trajajo od več sekund do nekaj minut in se pogosto izvajajo v ciklih, da se uravnava nastajanje toplote in zagotovi enakomerna razgradnja celic.
- Kakšen je namen sonikacije pri ekstrakciji beljakovin? Pri ekstrakciji beljakovin sonikacija služi učinkovitemu pretrganju celičnih membran in solubilizaciji beljakovin. Ta metoda je posebej uporabna za sproščanje beljakovin iz celičnih predelkov, zato je bistvena za pripravo lizatov, iz katerih se bodo beljakovine prečiščevale ali analizirale.
- Zakaj se sonikacija uporablja za ekstrakcijo? Sonikacija je priljubljena pri ekstrakciji zaradi hitrega delovanja in zmožnosti ciljnega dovajanja energije, s katero razgrajuje celične strukture in sprošča bioaktivne molekule brez uporabe agresivnih kemičnih obdelav ter tako ohranja funkcionalno neokrnjenost ekstrahiranih spojin.
- Ali sonikacija prekine interakcije med beljakovinami? Čeprav lahko sonikacija učinkovito razgradi celične membrane, lahko prekine tudi interakcije med beljakovinami. Stopnja prekinitve je odvisna od intenzivnosti sonikacije in trajanja izpostavljenosti, kar lahko povzroči denaturacijo ali disociacijo beljakovinskih kompleksov ter bi lahko vplivalo na nadaljnje analitične ali funkcionalne študije.
- Ali se lahko sonikacija uporablja za lizo E. coli? Sonikatorji Hielscher so posebej učinkoviti za lizo bakterijskih celic, kot je E. coli, ki imajo trdne celične stene. Tehnika omogoča fizikalno metodo strižne razgradnje celične stene in membrane, zato je prednostna metoda za pripravo bakterijskih lizatov v laboratorijih za molekularno biologijo in biokemijo.
- Kateri nadaljnji postopki sledijo koraku sonikacije?
Nadaljnji koraki po ultrazvočni lizi običajno vključujejo frakcioniranje lizata, ciljno izolacijo organelov in nadaljnjo ekstrakcijo ali čiščenje beljakovin.
Obdelani lizat se nato loči in pripravi za analitične ali funkcionalne uporabe, kot so proteomika z visoko ločljivostjo, transkriptomika ali študije vezave na receptorje.
Literatura/viri
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.