Sonication za lizo celic: motnje in ekstrakcija celic
Ultrazvočna celična liza je v sodobnih biotehnoloških laboratorijih pogosto uporabljena tehnika za pripravo vzorcev. Njen glavni namen je prekiniti celične membrane ali celotne celice, da se sprostijo znotrajcelične sestavine, kot so beljakovine, nukleinske kisline ali organeli. Pri vsakdanjem laboratorijskem delu to pomeni, da je sonikacija standardna metoda za nadzorovano prekinitev celic in učinkovito ekstrakcijo biomolekul. Ključna prednost sonikatorjev je njihova sposobnost natančnega uravnavanja kritičnih parametrov procesa, vključno z intenzivnostjo ultrazvoka, pulziranjem in nadzorom temperature. Ta nadzor raziskovalcem omogoča, da dosežejo zanesljivo lizo in hkrati zmanjšajo toplotne ali mehanske poškodbe občutljivih biomolekul, kar omogoča nežen, a zelo učinkovit postopek ekstrakcije.
Liza celic z uporabo sonikatorjev
Pri ultrazvočni celični lizi se uporablja akustična kavitacija, s katero se porušijo celične membrane in sprostijo znotrajcelične molekule. Hielscher Ultrasonics ponuja klasični sonikator tipa sonda kot tudi sonikatorje za več vzorcev za sterilno obdelavo: VialTweeter za več epruvet in viale ter sonikator 96-delčnih plošč UIP400MTP za standardne mikroplošče.
Hielscher Ultrasonics dobavlja zmogljive brezkontaktne zvočne aparate za pripravo vzorcev in klinično analizo. Zvočni zvočnik z več vdolbinicami UIP400MTP, The VialTweeter, CupHorn in pretočni sonikator GDmini2 vzorce obdelati pod sterilnimi pogoji.
Ultrazvočni homogenizatorji UP100H (100 vatov) in UP400St (400 vatov): Sonication za lizo celic in ekstrakcijo.
Ultrazvočni homogenizatorji za lizo in ekstrakcijo celic
| Vrsta ultrazvočne naprave | Osredotočenost na uporabo | Vzorčni volumen | Tipični primer uporabe | Prednosti | Primeri modelov |
|---|---|---|---|---|---|
| Sonicatorji tipa sonde | Sonikacija posameznega vzorca | 0.1 mL do ~1000 mL | Liza celic, ekstrakcija beljakovin, fragmentacija DNK/RNA | Natančen nadzor energije; različne sonotrode; optimalno za majhne do srednje velike vzorce | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Vzporedna obdelava več zapečatenih vial | 8-10 stekleničk (~1-20 ml vsaka) | Standardizirana liza več celičnih suspenzij | Enakomerna sonikacija; preprečevanje navzkrižne kontaminacije; ponovljivi rezultati | VialTweeter, Cuphorn |
| Sonikator za plošče s 96 vdolbinicami | Sonikacija večplastnih in mikrotitrskih plošč | Format mikroplošče | Visoko zmogljivo presejanje, proteomika, celični testi | Hkratna, enakomerna sonikacija v vseh vdolbinah; idealno za delovne postopke z več vzorci | UIP400MTP |
| reaktorji pretočnih celic | Neprekinjeno sonificiranje za večje količine | >1 L, razširljiv | Razbijanje celic v industrijskem obsegu, proizvodnja izvlečkov | Neprekinjena obdelava; možnost skaliranja; popoln nadzor procesa (amplituda, tlak, temperatura) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + pretočna celica |
| Sterilni / indirektni sistemi za sonikacijo | Obdelava vzorcev brez kontaminacije | Odvisno od stekleničke/cevke/mikroplošče | Občutljivi vzorci, sterilna okolja, regulativna okolja | Ni stika s sondo; preprečuje prenašanje; minimalno čiščenje | VialTweeter, Cuphorn, UIP400MTP |
Prednosti uporabe ultrazvočnega razbijanja za lizo celic
V primerjavi z drugimi metodami lize in ekstrakcije celic ima ultrazvočna liza celic več prednosti:
- Hitrost: Ultrazvočna liza in ekstrakcija celic je hitra metoda, ki lahko v nekaj sekundah razbije odprte celice. To je veliko hitrejše od drugih metod, kot so homogenizacija, zamrzovanje-odmrzovanje ali rezkanje kroglic.
- Učinkovitost: Ultrazvočna liza in ekstrakcija celic se lahko uporablja za obdelavo majhnih, velikih ali več vzorcev hkrati, zaradi česar je učinkovitejša od drugih metod, ki zahtevajo individualno obdelavo majhnih vzorcev.
- Brez kemikalij: Ultrazvočna liza in ekstrakcija celic je neinvazivna metoda, ki ne zahteva uporabe ostrih kemikalij ali encimov. Zaradi tega je idealen za aplikacije, kjer je treba ohraniti celovitost vsebine celic. Neželeni kontaminaciji vzorcev se je mogoče izogniti.
- Visok donos: Ultrazvočna liza in ekstrakcija celic lahko izvleče visok donos celične vsebine, vključno z DNK, RNA in beljakovinami. To je zato, ker visokofrekvenčni zvočni valovi odprejo celične stene in sprostijo vsebino v okoliško raztopino.
- Nadzor temperature: Sofisticirani ultrazvočniki omogočajo natančen nadzor temperature vzorca. Hielscher digitalni sonicatorji so opremljeni s priključnim temperaturnim senzorjem in programsko opremo za spremljanje temperature.
- Ponovljivo: Protokole za ultrazvočno lizo celic je mogoče enostavno reproducirati in celo uskladiti z različnimi večjimi ali manjšimi volumni vzorcev s preprostim linearnim povečanjem.
- Vsestranski: Ultrazvočna liza in ekstrakcija celic se lahko uporablja za ekstrakcijo širokega spektra vrst celic, vključno z bakterijami, kvasovkami, glivami, rastlinskimi in sesalskimi celicami. Uporablja se lahko tudi za ekstrakcijo različnih vrst molekul, vključno z beljakovinami, DNK, RNA in lipidi.
- Hkratna priprava številnih vzorcev: Hielscher Ultrasonics ponuja več rešitev za udobno obdelavo številnih vzorcev v popolnoma enakih procesnih pogojih. Zaradi tega je faza priprave vzorca lize in ekstrakcije zelo učinkovita in prihrani čas.
- Enostavna uporaba: Ultrazvočna oprema za lizo in ekstrakcijo celic je enostavna za uporabo in zahteva minimalno usposabljanje. Oprema je tudi ekonomična, saj gre za enkratno naložbo brez potrebe po ponovnem odkupu odtujitev. Zaradi tega je privlačen za širok krog raziskovalcev in laboratorijev.
Na splošno je ultrazvočna liza in ekstrakcija celic hitra, učinkovita, natančno nadzorovana in vsestranska metoda za ekstrakcijo celične vsebine. Zaradi svojih prednosti pred alternativnimi metodami je privlačna izbira za široko paleto raziskav in industrijskih aplikacij.
Načelo delovanja ultrazvočne lize celic
Ultrazvočna liza in ekstrakcija celic uporablja visokofrekvenčne zvočne valove za motnje celic in pridobivanje njihove vsebine. Zvočni valovi ustvarjajo spremembe tlaka v okoliški tekočini, kar povzroča nastanek majhnih mehurčkov in propad v procesu, znanem kot kavitacija. Ti mehurčki ustvarjajo lokalizirane zelo intenzivne mehanske sile, ki lahko razbijejo celice in sprostijo njihovo vsebino v okoliško raztopino.
Liza celic z ultrazvočnim aparatom običajno vključuje naslednje korake:
- Vzorec se postavi v epruveto ali posodo s tekočim puferom.
- V vzorec se vstavi ultrazvočna sonda in uporabijo se visokofrekvenčni zvočni valovi s približno 20-30 kHz.
- Ultrazvočni valovi povzročajo nihanje in kavitacijo v okoliški tekočini, kar ustvarja lokalizirane sile, ki razbijejo odprte celice in sproščajo njihovo vsebino.
- Vzorec se centrifugira ali filtrira, da se odstranijo vsi celični ostanki, ekstrahirana vsebina pa se zbere za nadaljnjo analizo.
Slabosti običajnih metod lize
Med delom v laboratorijih ste morda že doživeli težave z lizo celic z uporabo tradicionalnih mehanskih ali kemijskih protokolov lize.
- Mehanska liza: Metode mehanske lize, kot so mletje z malto in pestilom ali homogenizacija s francosko stiskalnico, mlinom za kroglice ali sistemom rotor-stator, pogosto nimajo natančnega nadzora in možnosti nastavitve. To pomeni, da lahko uporaba mletja in mletja hitro ustvari toplotne in strižne sile, ki lahko poškodujejo vzorec in denaturirajo beljakovine. Lahko so tudi zamudne in zahtevajo velike količine vhodnega materiala.
- Kemična liza: Metode kemične lize, kot je liza na osnovi detergenta, lahko poškodujejo vzorec z motnjami lipidnega dvosloja in denaturacijskimi beljakovinami. Zahtevajo lahko tudi več korakov in lahko pustijo preostale onesnaževalce, ki motijo nadaljnjo uporabo. Iskanje optimalnega odmerka detergenta je dodaten izziv.
- Cikli zamrzovanja in odmrzovanja: Cikli zamrzovanja in odmrzovanja lahko povzročijo razpok celičnih membran, ponavljajoči se cikli pa lahko povzročijo tudi denaturacijo in razgradnjo beljakovin. Ta metoda lahko zahteva tudi več ciklov, kar je lahko zamudno in pogosto povzroči nižje donose.
- Encimska liza: Metode encimske lize so lahko specifične za določene vrste celic in zahtevajo več korakov, zaradi česar so zamudne. Prav tako ustvarjajo odpadke in zahtevajo skrbno optimizacijo, da se prepreči razgradnja vzorca. Kompleti za encimsko lizo so pogosto dragi. Če vaš trenutni postopek encimske lize ne daje zadostnih rezultatov, lahko ultrazvočno razbijanje kot sinergistično metodo uporabite za intenziviranje celičnih motenj.
V nasprotju z običajnimi mehanskimi in kemičnimi metodami lize celic je ultrazvočno razbijanje zelo učinkovito in zanesljivo orodje za razpad celic, ki omogoča popoln nadzor nad parametri ultrazvočne obdelave. To zagotavlja visoko selektivnost pri sproščanju materialov in čistosti izdelka. [prim. Balasundaram et al., 2009]
Primerna je za vse vrste celic in enostavno uporabna v majhnem in velikem obsegu – vedno v nadzorovanih pogojih. Ultrazvočni aparati so enostavni za čiščenje. Ultrazvočni homogenizator ima vedno funkcijo čiščenja na mestu (CIP) in sterilizacije na mestu (SIP). Sonotroda je sestavljena iz masivnega titanovega roga, ki ga lahko obrišete ali sperete z vodo ali topilom (odvisno od delovnega medija). Vzdrževanje ultrazvočnih aparatov je zaradi njihove robustnosti skoraj zanemarljivo.
Ultrazvočna liza in motnje celic
Na splošno bo liza vzorcev v laboratoriju trajala od 15 sekund do 2 minuti. Ker je intenzivnost ultrazvočne obdelave zelo enostavno prilagoditi z nastavitvijo amplitude in časom ultrazvočne razbijanja in izbiro prave opreme, je mogoče zelo nežno ali zelo nenadoma motiti celične membrane, odvisno od celične strukture in namena lize (npr. ekstrakcija DNA zahteva mehkejšo ultrazvočno razbijanje, popolna ekstrakcija beljakovin bakterij zahteva intenzivnejšo ultrazvočno obdelavo). Temperaturo med postopkom je mogoče spremljati z vgrajenim temperaturnim senzorjem in jo je mogoče enostavno nadzorovati s hlajenjem (ledena kopel ali pretočne celice s hladilnimi plašči) ali z ultrazvočnim razbijanjem v impulznem načinu. Med ultrazvočnim načinom impulznega načina kratki cikli ultrazvočnega razbijanja v trajanju 1-15 sekund omogočajo odvajanje toplote in hlajenje v daljših občasnih obdobjih.
Vsi procesi, ki jih poganja ultrazvok, so popolnoma ponovljivi in linearno razširljivi.
The VialTweeter je ultrazvočni homogenizator za hkratno, enakomerno in hitro sterilno pripravo številnih vzorcev.
- Priprava celične suspenzije: Celične pelete je treba popolnoma suspendirati v puferski raztopini s homogenizacijo (izberite pufersko raztopino, ki je združljiva z naslednjo analizo, npr. specifično kromatografsko metodo). Po potrebi dodamo lizocime in/ali druge dodatke (prav tako morajo biti združljivi s sredstvi za ločevanje/čiščenje). Raztopino nežno premešamo/homogeniziramo z blago ultrazvočno razbijanjem, dokler ne dosežemo popolne suspenzije.
- Ultrazvočna liza: Vzorec postavite v ledeno kopel. Za motnje celic sonikirajte suspenzijo pri 60-90 sekundnih izbruhih (z uporabo impulznega načina zvočnega zvočnika).
- Ločevanje: Lizat centrifugiramo (npr. 10 min pri 10.000 x g; pri 4 °C). Previdno ločite supernatant od celične pelete. Supernatant je celotni celični lizat. Po filtraciji supernatanta dobite prečiščeno tekočino topnega celičnega proteina.
Najpogostejše aplikacije ultrazvočnih aparatov v biologiji in biotehnologiji so:
- Priprava celičnega izvlečka
- Motnje kvasovk, bakterij, rastlinskih celic, mehkih ali trdih celičnih tkiv, nukleinskega materiala
- ekstrakcija beljakovin
- Priprava in izolacija encimov
- Proizvodnja antigenov
- Ekstrakcija DNK in/ali ciljna fragmentacija
- Priprava liposoma
Motnje celic z ultrazvočnim sondom so učinkovita metoda priprave vzorca.
Različne aplikacije ultrazvoka se razvejajo v sektorjih biotehnologije, bioinženiringa, mikrobiologije, molekularne biologije, biokemije, imunologije, bakteriologije, virologije, proteomike, genetike, fiziologije, celične biologije, hematologije in botanike.
Liza: razbijanje celičnih struktur
Celice so zaščitene s polprepustno plazemsko membrano, ki je sestavljena iz fosfo-lipidnega dvosloja (tudi proteinsko-lipidnega dvosloja; tvorijo ga hidrofobni lipidi in hidrofilne molekule fosforja z vgrajenimi proteinskimi molekulami) in ustvarja pregrado med notranjostjo celic (citoplazma) in zunajceličnim okoljem. Rastlinske celice in prokariontske celice so obdane s celično steno. Zaradi večplastne debele celične stene celuloze je rastlinske celice težje lizirati kot živalske celice. Celična notranjost, kot so organele, jedro, mitohondrij, je stabilizirana s citoskeletom.
Z lizo celic je namenjen ekstrakciji in ločevanju organelov, beljakovin, DNA, mRNA ali drugih biomolekul.
Konvencionalne metode lize celic in njihove pomanjkljivosti
Obstaja več metod za lizacijo celic, ki jih lahko razdelimo na mehanske in kemične metode, ki vključujejo uporabo detergentov ali topil, uporabo visokega tlaka ali uporabo mlina za kroglice ali francoske stiskalnice. Najbolj problematična pomanjkljivost teh metod je težaven nadzor in prilagajanje procesnih parametrov in s tem vpliv.
V spodnji tabeli so prikazane glavne pomanjkljivosti običajnih metod lize:
Tabela: Konvencionalne metode lize celic imajo velike pomanjkljivosti
Postopek lize
Liza je občutljiv proces. Med lizo se uniči zaščita celične membrane, vendar je treba preprečiti inaktivacijo, denaturacijo in razgradnjo ekstrahiranih beljakovin zaradi nefiziološkega okolja (odstopanje od pH-vrednosti). Zato se na splošno liza izvaja v puferski raztopini. Večina težav nastane zaradi nenadzorovanih motenj celic, ki imajo za posledico neciljno sproščanje vsega znotrajceličnega materiala ali / in denaturacijo ciljnega produkta.
Pogosto zastavljena vprašanja o ultrazvočnem razbijanju in lizi celic
- Ali lahko celice lizirate s ultrazvočnim razbijanjem? Da, ultrazvočno razbijanje učinkovito lizira celice z uporabo visokofrekvenčnih ultrazvočnih valov, ki povzročajo kavitacijo, pojav, pri katerem se drobni parni mehurčki oblikujejo in nasilno zrušijo v celični suspenziji. Nastale mehanske sile motijo celične membrane in olajšajo sproščanje znotrajceličnih komponent v tekočino.
- Kako uporabljati sonikator za lizo celic? Uporaba sonikatorja za lizo celic vključuje potopitev sonde sonikatorja v celično suspenzijo in prilagoditev parametrov, kot so amplituda in trajanje impulza. Postopek je treba skrbno spremljati, da bi optimizirali motnje celic, hkrati pa zmanjšali denaturacijo beljakovin in inaktivacijo encimov.
- Kakšno je načelo ultrazvočne razbijanje za lizo celic? Sonication deluje na principu akustične kavitacije. Ultrazvočna energija se prenaša v tekoči medij, kar povzroča hitra nihanja tlaka, ki vodijo do nastanka in implozije mikromehurčkov. Te implozije ustvarjajo intenzivne strižne sile in lokalizirane visoke temperature, ki motijo celične strukture in povečujejo homogenost lizata.
- Kako dolgo traja ultrazvočna liza celic? Trajanje ultrazvočne razbijanje za lizo celic se lahko bistveno razlikuje glede na dejavnike, kot so vrsta celice, gostota celic, moč zvočnika in poseben uporabljeni protokol. Tipični postopki se lahko gibljejo od nekaj sekund do nekaj minut, pogosto se izvajajo v ciklih za upravljanje proizvodnje toplote in zagotavljanje enakomerne motnje celic.
- Kakšen je namen ultrazvočne ekstrakcije pri ekstrakciji beljakovin? Pri ekstrakciji beljakovin ultrazvočna obdelava služi za učinkovito razpokanje celičnih membran in raztapljanje beljakovin. Ta metoda je še posebej uporabna za sproščanje beljakovin iz celičnih predelkov, zaradi česar je bistvenega pomena za pripravo lizatov, iz katerih je treba beljakovine očistiti ali analizirati.
- Zakaj se ultrazvočno razbijanje uporablja za ekstrakcijo? Sonication je naklonjen ekstrakciji zaradi hitrega delovanja in sposobnosti uporabe ciljne energije, razgradnje celičnih struktur za sproščanje bioaktivnih molekul brez uporabe ostrih kemičnih obdelav, s čimer se ohrani funkcionalna celovitost ekstrahiranih spojin.
- Ali ultrazvočna razbijanja moti interakcije beljakovin-protein? Medtem ko lahko ultrazvočna razbijanje učinkovito moti celične membrane, lahko moti tudi interakcije beljakovin-protein. Stopnja motenj je odvisna od intenzivnosti ultrazvočnega razbijanja in trajanja izpostavljenosti, kar lahko povzroči denaturacijo ali disociacijo proteinskih kompleksov, kar lahko vpliva na nadaljnje analitične ali funkcionalne študije.
- Ali se lahko ultrazvočno razbijanje uporablja za lizo E. coli? Hielscher sonicatorji so še posebej učinkoviti za lizo bakterijskih celic, kot je E. coli, ki imajo robustne celične stene. Tehnika zagotavlja fizikalno metodo za striženje celične stene in membrane, zaradi česar je prednostna metoda za pripravo bakterijskih lizatov v laboratorijih za molekularno biologijo in biokemijo.
- Kateri so nadaljnji postopki, ki sledijo sonifikaciji?
Nadaljnji koraki po ultrazvočni lizi običajno vključujejo frakcioniranje lizata, ciljno izolacijo organelov in nadaljnjo ekstrakcijo ali čiščenje beljakovin.
Obdelani lizat se nato loči in pripravi za analitične ali funkcionalne aplikacije, kot so proteomika visoke ločljivosti, transkriptomika ali študije vezave receptorjev.
Literatura/Reference
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.