Ultrazvuková výroba vysoko purifikovaných beta-glukánov schizofyllánu

Schizophyallan je plesňový β-glukán s imunomodulačnými vlastnosťami. Pre vysoko aktívne liečivé účinky musí mať schizofylán nízku molekulovú hmotnosť, aby preukázal lepšiu biologickú dostupnosť. Ultrazvuk preukázateľne znižuje molekulovú hmotnosť schizofylánu. Ako spoľahlivú a účinnú metódu možno sonikáciu ľahko použiť na výrobu schizofylánu s nízkou molekulovou hmotnosťou.

Huby Schizophyllum a ultrazvuková extrakcia beta-glukánu

Druhy huby Schizophyllum rastú v prírode na rozpadajúcich sa stromoch po období dažďov. Ovocné telieska sa zbierajú v nasledujúcom období sucha. Druhy Schizophyllum sú bohaté na biochemické zlúčeniny, ako sú glukány, a preto sa konzumujú najmä v tropických krajinách ako potraviny a lieky. Vďaka svojim imunomodulačným, protiplesňovým, antineoplastickým a antivírusovým vlastnostiam Schizophyllum commune, známa aj ako huba Splitgill, prilákala biotechnologické a farmaceutické spoločnosti.
Polysacharid schizofylán, tiež známy ako sizofiran, sonifilan alebo sizofilan, je hlavným β-glukánom nachádzajúcim sa v hubách Schizophyllum, ktoré ponúkajú vysoko účinný bioaktívny β-glukánový schizofyllan.
Huby Schizophyllum commune rastú v prírode na stromoch, mycelium sa dá kultivovať aj vo fermentačnom vývare. Pre farmaceutické a kozmetické aplikácie je schizofylán s nízkou molekulovou hmotnosťou oveľa účinnejší ako schizofylan s vysokou molekulovou hmotnosťou. Je to spôsobené tým, že schizofylán s nízkou molekulovou hmotnosťou vykazuje výrazne lepšiu biologickú dostupnosť a mieru absorpcie. Okrem toho je schizofylán s vysokou molekulovou hmotnosťou často problematický v aplikáciách, pretože má za následok vysokú viskozitu jeho vodných roztokov.
Ultrazvukové zmenšovanie veľkosti je vysoko účinná a spoľahlivá technika na zníženie molekulovej hmotnosti schizofylánu, čím sa zvyšuje kvalita molekuly β-glukánu.

Protokol o výrobe nízkomolekulárneho schizofylánu

Keďže schizofylán s molekulovou hmotnosťou vykazuje drasticky lepšiu biologickú dostupnosť a aplikačné vlastnosti, výskumný tím Smirnou skúmal ultrazvuk na štiepenie a zmenšenie veľkosti molekuly β-glukánu schizofylánu.

Ultrazvuk schizofylanu

β-1.3(1.6)-Glukán schizofylán (SPG) bol vyrobený ponoreným pestovaním huby S. commune v bioreaktore s použitím sacharózy ako substrátu.
Po ukončení kultivácie sa kultivačný vývar zriedil demineralizovanou vodou na koncentráciu schizofylánu 2 g/l a ultrazvukom sa ultrazvukový procesor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Nemecko) v recyklačnom režime pri nasledujúcich parametroch a podmienkach: prietok média 50 ml/s, frekvencia 20 kHz, výkon 2000 W, sonotróda typu BS2d22, zosilňovač typu B2-1,4 a amplitúda 100%. Teplota kultivačného bujónu na začiatku sonikácie bola 25 °C. Ultrazvukový kultivačný vývar (špecifický energetický príkon 100 Ws/ml) bol filtrovaný cez hĺbkový filter Seitz HS800 pod tlakom 1,5 baru pri 40 °C. Ultrazvukový schizofylán (uSPG) na chemickú charakterizáciu sa vyzrážal z filtrátu trojitým množstvom izopropylalkoholu pri laboratórnej teplote a vysušil sa pri 60 °C na 12 hodín roztoky uSPG pre imunologické štúdie boli pripravené nasledovne: (1) ultrasonikovaný kultivačný vývarový filtrát bol diafiltrovaný cez 0,1 m2 Pall Centramate PES kazetu T-series (100 kDa cut-off) pri 0,8 baru a diafiltrácia pokračovala, kým vodivosť retentátu nebola 20 μS/cm; (2) roztok bol koncentrovaný diafiltráciou na koncentráciu uSPG 1 g/l a sterilizovaný autoklávovaním pri 120 °C/20 min. Denaturovaný uSPG bol pripravený podobným spôsobom, s tým rozdielom, že NaOH sa pridal do filtrátu kultivačného bujónu v koncentrácii 0,2 M a alkalizovaný roztok sa pred diafiltráciou inkuboval 30 minút pri laboratórnej teplote.

Analytické metódy

Výťažok mycélia bol odhadnutý gravimetricky: kultivačný vývar sa zriedil vodou v pomere 1:4, odstredil sa 10000 × g pri 25 °C po dobu 20 minút, zrazenina sa premyla trojnásobným množstvom vody, vysušila sa pri 60 °C a zvážila. Schizofylán bol vyzrážaný zo supernatantu trojitým množstvom izopropylalkoholu, sušený pri 60 °C po dobu 24 hodín a jeho výťažok bol stanovený gravimetricky. pO2 v kultivačnom bujóne bol meraný optickou sondou Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Švajčiarsko).
Dynamická viskozita kultivačného bujónu bola meraná na HAAKE Visco Tester 6L s vretenami 1L a 2L pri 4 °C a rýchlosťou otáčania 30 ot./min. Rýchlosť filtrácie bola vypočítaná z času filtrácie 500 ml kultivačného bujónu cez 200 × 200 mm hĺbkový filter Seitz HS800 (Pall, USA) pri tlaku 1,5 bar a 40 °C.
Molekulová hmotnosť uSPG bola meraná pomocou SEC-MALLS na HPLC systéme Alliance (Waters) so sériovo zapojenými kolónami PL aquagel OH60 a PL aquagel OH40 a detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) bol koncentrovaný diafiltráciou na koncentráciu uSPG 1 g/l a sterilizovaný autoklávovaním pri 120 °C/20 min. Denaturovaný uSPG bol pripravený podobným spôsobom, s tým rozdielom, že NaOH sa pridal do filtrátu kultivačného bujónu v koncentrácii 0,2 M a alkalizovaný roztok sa pred diafiltráciou inkuboval 30 minút pri laboratórnej teplote.

Výsledky:
Ultrazvuková liečba bola aplikovaná priamo na kultivačný vývar S. commune 144-h s mycéliom, aby sa uľahčilo následné spracovanie SPG.
 
Charakteristika sonikovaného schizofylánu: Ultrazvukový schizofylán (uSPG) bol vyzrážaný z filtrátu kultivačného bujónu alkoholom a charakterizovaný. SEC-MALLS odhadol Mw uSPG na približne 1 MDa. Priemerná molekulová hmotnosť schizofylanu z kvapalnej fermentácie je približne 5 MDa, zatiaľ čo pri kultivácii v pevnom stave môže dosiahnuť až 10 MDa. Pri porovnaní molekulovej hmotnosti ultrazvukového schizofylánu s molekulovými hmotnosťami natívneho neliečeného schizofylánu možno pozorovať 5- až 10-násobne zníženú molekulovú hmotnosť v dôsledku ultrazvuku.
Sonikovaný polysacharid uSPG obsahoval 0,7 % w/w bielkovín a 1,0 % w/w zvyškov po zapálení. hydrolyzát uSPG pozostával z glukózy s viac ako 99%. Analytické výsledky naznačujú, že sonikacia náhodne štiepi β-glukánovú chrbticu a bočné vetvy zostávajú neporušené, čím sa znižuje veľkosť a molekulová hmotnosť schizofylánu. Imunologické štúdie uSPG v podstate bez proteínov a endotoxínov ukázali, že ultrazvukový schizofylán s nízkym obsahom Mw má výraznú imunomodulačnú aktivitu.

 
Znížená viskozita: Ultrazvuk viedol k výraznému zníženiu viskozity kultivačného vývaru. Počas ultrazvuku sa viskozita kultivačného bujónu menila nelineárne: pokles viskozity bol na začiatku ultrazvuku rýchly, ale neskôr sa spomalil. Špecifický energetický príkon 100 Ws/ml bol dostatočný na takmer 7-násobné zníženie viskozity kultivačného bujónu.

Vylepšená filtrácia: Ultrazvukom ošetrený kultivačný vývar pretekal filtrom rýchlejšie ako neupravený kultivačný vývar (špecifický energetický príkon 0 Ws/ml) s vysokomolekulárnym SPG. Okrem toho ultrazvuk výrazne znížil stratu produktu počas filtrácie. Filtrát neupraveného kultivačného bujónu s vysokomolekulárnym SPG (špecifický energetický príkon 0 Ws/ml) obsahoval 0,3 ± 0,07 g/l SPG, zatiaľ čo koncentrácia SPG pred hĺbkovou filtráciou bola 2 g/l. Naproti tomu filtrát 100 Ws/ml ultrazvukovej kultúry obsahoval SPG v koncentrácii 2,2 ± 0,2 g/l, čo zodpovedá takmer nulovej strate produktu.

Záver: Vo svojom závere výskumný tím pokračuje, že ultrazvukové spracovanie je účinná technológia na výrobu nízkomolekulárneho schizofylánu, ktorý sa potom môže použiť v kozmetike a medicíne. Ultrazvuk, ak sa aplikuje na kompletný kultivačný vývar s mycéliom, prináša určité výhody pri výrobe schizofylánu. Znižuje straty produktu počas následného spracovania a umožňuje výrobu vysoko čisteného polysacharidu vďaka efektívnemu využitiu ultrafiltrácie.
Okrem toho vedci zistili, že ultrazvukové spracovanie schizofylanu je ľahko škálovateľné. Jedna jednotka ultrazvukového dezintegrátora pilotného závodu UIP2000hdT spracovala 1 liter kultivačného vývaru za 110 sekúnd v prietokovom režime. Produktivitu systému je možné ľahko zvýšiť postupným pripojením ďalších ultrazvukových jednotiek.

 
Prečítajte si viac o jednoduchom rozšírení ťažby húb!
 

Vysokovýkonné ultrazvukové zariadenie na spracovanie glukánu húb

Fragmentáciu polysacharidov, ako sú glukány, ako aj iných bioaktívnych zlúčenín, ako je chitín a chitosan, je možné spoľahlivo spracovať pomocou vysokovýkonného ultrazvukového zariadenia Hielscher. Naše ultrazvukové prístroje môžu poskytovať vysoké amplitúdy, ponúkajú presnú ovládateľnosť procesných parametrov a môžu byť prevádzkované 24 hodín denne, 7 dní v týždni pri veľkom zaťažení a v náročných prostrediach. Sortiment zariadení Hielscher Ultrasonics spoľahlivo spĺňa tieto požiadavky. Okrem vynikajúceho ultrazvukového výkonu sa ultrazvukové prístroje Hielscher môžu pochváliť vysokou energetickou účinnosťou, čo je významná ekonomická výhoda – najmä pri komerčnej veľkovýrobe.
Ultrazvukové prístroje Hielscher sú vysokovýkonné systémy, ktoré môžu byť vybavené príslušenstvom, ako sú sonotrody, zosilňovače, reaktory alebo prietokové články, aby optimálne vyhovovali potrebám vášho procesu. Vďaka digitálnemu farebnému displeju je zabezpečená možnosť prednastavenia sonikácie, automatické zaznamenávanie údajov na integrovanú SD kartu, diaľkové ovládanie prehliadača a mnoho ďalších funkcií, najvyššia kontrola procesu a užívateľská prívetivosť. V kombinácii s robustnosťou a veľkou nosnosťou sú ultrazvukové systémy Hielscher vaším spoľahlivým ťažným koňom vo výrobe. Zníženie molekulovej hmotnosti β-glukánov, ako je schizofylán, si vyžaduje výkonný ultrazvuk na získanie cieleného štiepenia a konečného vysokokvalitného schizofylanového produktu, ktorý možno použiť vo farmaceutických aplikáciách.
 
Viac informácií o ultrazvukovej extrakcii beta-glukánu z húb vrátane podrobných pokynov nájdete tu!
 
Nasledujúca tabuľka vám poskytuje približnú kapacitu spracovania našich ultrazvukových prístrojov: