Ultrazvuková výroba vysoko purifikovaných beta-glukánov schizofylánu

Schizofylán je hubový β-glukán s imunomodulačnými vlastnosťami. Na dosiahnutie vysoko účinných liečivých účinkov musí mať schizofylán nízku molekulovú hmotnosť, aby vykazoval lepšiu biologickú dostupnosť. Preukázalo sa, že pôsobenie ultrazvuku znižuje molekulovú hmotnosť schizofylánu. Sonikáciu možno ako spoľahlivú a účinnú metódu jednoducho použiť na výrobu schizofylánu s nízkou molekulovou hmotnosťou.

Huby rodu Schizophyllum a ultrazvuková extrakcia beta-glukánov

Druhy húb rodu Schizophyllum rastú v prírode na rozkladajúcich sa stromoch po obdobiach dažďov. Plodnice sa zbierajú v nasledujúcom období sucha. Druhy rodu Schizophyllum sú bohaté na biochemické zlúčeniny, ako sú glukány, a preto sa najmä v tropických krajinách konzumujú ako potrava a liečivo. Schizophyllum commune, známa aj ako klanolístka obyčajná, vzbudila vďaka svojim imunomodulačným, antimykotickým, antineoplastickým a antivírusovým vlastnostiam záujem biotechnologických a farmaceutických spoločností.
Polysacharid schizofylán, známy aj ako sizofiran, sonifilan alebo sizofilan, je hlavným β-glukánom nachádzajúcim sa v hubách rodu Schizophyllum, ktoré poskytujú vysoko účinný bioaktívny β-glukán schizofylán.
Huby Schizophyllum commune rastú v prírode na stromoch, pričom mycélium možno kultivovať aj vo fermentačnom médiu. Na farmaceutické a kozmetické použitie je schizofylán s nízkou molekulovou hmotnosťou oveľa účinnejší než schizofylán s vysokou molekulovou hmotnosťou. Je to spôsobené tým, že schizofylán s nízkou molekulovou hmotnosťou vykazuje výrazne lepšiu biologickú dostupnosť a mieru absorpcie. Schizofylán s vysokou molekulovou hmotnosťou je navyše pri použití často problematický, pretože spôsobuje vysokú viskozitu svojich vodných roztokov.
Ultrazvukové zmenšovanie veľkosti je vysoko účinná a spoľahlivá technika na znižovanie molekulovej hmotnosti schizofylánu, čím sa zvyšuje kvalita molekuly β-glukánu.

Protokol na výrobu schizofylánu s nízkou molekulovou hmotnosťou

Keďže schizofylán s nízkou molekulovou hmotnosťou vykazuje výrazne lepšiu biologickú dostupnosť a aplikačné vlastnosti, výskumný tím Smirnou skúmal pôsobenie ultrazvuku na štiepenie a zmenšovanie veľkosti molekuly β-glukánu schizofylánu.

Pôsobenie ultrazvuku na schizofylán

β-1.3(1.6)-glukán schizofylán (SPG) sa vyrábal submerznou kultiváciou huby S. commune v bioreaktore s použitím sacharózy ako substrátu.
Po ukončení kultivácie sa kultivačné médium zriedilo demineralizovanou vodou na koncentráciu schizofylánu 2 g/L a ošetrilo sa ultrazvukom pomocou ultrazvukového procesora UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Nemecko) v recirkulačnom režime pri nasledujúcich parametroch a podmienkach: prietok média 50 mL/s, frekvencia 20 kHz, výstupný výkon 2000 W, sonotróda typu BS2d22, zosilňovač amplitúdy typu B2-1.4 a amplitúda 100%. Teplota kultivačného média na začiatku sonikácie bola 25°C. Kultivačné médium ošetrené ultrazvukom (špecifický energetický vstup 100 Ws/mL) sa filtrovalo cez hĺbkový filter Seitz HS800 pri tlaku 1,5 bar a teplote 40°C. Schizofylán ošetrený ultrazvukom (uSPG) určený na chemickú charakterizáciu sa vyzrážal z filtrátu trojnásobným množstvom izopropylalkoholu pri laboratórnej teplote a sušil sa pri 60°C počas 12h. Roztoky uSPG na imunologické štúdie sa pripravili takto: (1) filtrát kultivačného média ošetreného ultrazvukom sa diafiltroval cez kazetu Pall Centramate T-series PES s plochou 0,1m2 (medzná molekulová hmotnosť 100 kDa) pri tlaku 0,8 bar a diafiltrácia pokračovala, kým vodivosť retentátu nedosiahla 20 μS/cm; (2) roztok sa zahustil diafiltráciou na koncentráciu uSPG 1 g/L a sterilizoval sa autoklávovaním pri 120°C/20 min. Denaturovaný uSPG sa pripravil podobným spôsobom s tým rozdielom, že do filtrátu kultivačného média sa pridal NaOH v koncentrácii 0,2 M a alkalizovaný roztok sa pred diafiltráciou inkuboval 30 min pri laboratórnej teplote.

Analytické metódy

Výťažok mycélia sa stanovil gravimetricky: kultivačný bujón sa zriedil vodou v pomere 1:4 a centrifugoval pri 10 000 × g a 25°C počas 20 min, zrazenina sa premyla trojnásobným množstvom vody, vysušila pri 60°C a odvážila. Schizofylán sa vyzrážal zo supernatantu trojnásobným množstvom izopropylalkoholu, vysušil pri 60°C počas 24h a jeho výťažok sa stanovil gravimetricky. pO2 v kultivačnom bujóne sa meral optickou sondou Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Švajčiarsko).
Dynamická viskozita kultivačného bujónu sa merala na prístroji HAAKE Visco Tester 6L s vretenami 1L a 2L pri 4°C a rýchlosti otáčania 30 rpm. Rýchlosť filtrácie sa vypočítala z času filtrácie 500 mL kultivačného bujónu cez hĺbkový filter Seitz HS800 (Pall, USA) s rozmermi 200 × 200 mm pri tlaku 1,5 bar a teplote 40°C.
Molekulová hmotnosť uSPG sa merala metódou SEC-MALLS na systéme HPLC Alliance (Waters) so sériovo zapojenými kolónami PL aquagel OH60 a PL aquagel OH40 a detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) sa zahustil diafiltráciou na koncentráciu uSPG 1 g/L a sterilizoval autoklávovaním pri 120°C/20 min. Denaturovaný uSPG sa pripravil podobným spôsobom s tým rozdielom, že do filtrátu kultivačného bujónu sa pridal NaOH v koncentrácii 0,2 M a alkalizovaný roztok sa pred diafiltráciou inkuboval 30 min pri laboratórnej teplote.

Výsledky:
Ultrazvukové ošetrenie sa aplikovalo priamo na kultivačný bujón S. commune s mycéliom po 144-h kultivácii, aby sa uľahčilo následné spracovanie SPG.
 
Charakteristiky sonikovaného schizofylánu: Ultrazvukom ošetrený schizofylán (uSPG) sa vyzrážal alkoholom z filtrátu kultivačného bujónu a charakterizoval. Metódou SEC-MALLS sa odhadla Mw uSPG na približne 1 MDa. Priemerná molekulová hmotnosť schizofylánu z kvapalnej fermentácie je približne 5 MDa, zatiaľ čo pri kultivácii na pevnom substráte môže dosiahnuť až 10 MDa. Pri porovnaní molekulovej hmotnosti ultrazvukom ošetreného schizofylánu s molekulovými hmotnosťami natívneho neošetreného schizofylánu možno pozorovať 5- až 10-násobné zníženie molekulovej hmotnosti v dôsledku pôsobenia ultrazvuku.
Sonikovaný polysacharid uSPG obsahoval 0,7%w/w bielkovín a 1,0%w/w zvyšku po žíhaní. Hydrolyzát uSPG pozostával z viac ako 99% glukózy. Analytické výsledky naznačujú, že sonikácia náhodne štiepi hlavný reťazec β-glukánu a bočné vetvy zostávajú neporušené, čím sa znižuje veľkosť a molekulová hmotnosť schizofylánu. Imunologické štúdie uSPG prakticky bez bielkovín a endotoxínov ukázali, že ultrazvukom ošetrený schizofylán s nízkou Mw má výraznú imunomodulačnú aktivitu.

 
Znížená viskozita: Pôsobenie ultrazvuku viedlo k výraznému zníženiu viskozity kultivačného bujónu. Počas pôsobenia ultrazvuku sa viskozita kultivačného bujónu menila nelineárne: pokles viskozity bol na začiatku sonikácie rýchly, neskôr sa však spomalil. Merný energetický vstup 100 Ws/mL postačoval na takmer 7-násobné zníženie viskozity kultivačného bujónu.

Zlepšená filtrácia: Kultivačný bujón ošetrený ultrazvukom pretekal cez filter rýchlejšie než neošetrený kultivačný bujón (špecifický energetický vstup 0 Ws/mL) s vysokomolekulovým SPG. Ultrazvukové ošetrenie navyše výrazne znížilo straty produktu počas filtrácie. Filtrát neošetreného kultivačného bujónu s vysokomolekulovým SPG (špecifický energetický vstup 0 Ws/mL) obsahoval 0,3 ± 0,07 g/L SPG, zatiaľ čo koncentrácia SPG pred hĺbkovou filtráciou bola 2 g/L. Naproti tomu filtrát kultivačného bujónu ošetreného ultrazvukom pri špecifickom energetickom vstupe 100 Ws/mL obsahoval SPG v koncentrácii 2,2 ± 0,2 g/L, čo zodpovedá takmer nulovým stratám produktu.

Záver: Výskumný tím vo svojom závere sumarizuje, že ultrazvukové spracovanie je účinná technológia na výrobu nízkomolekulového schizofylánu, ktorý sa následne môže používať v kozmetike a medicíne. Ultrazvukové ošetrenie celého kultivačného bujónu s mycéliom prináša pri výrobe schizofylánu určité výhody. Znižuje straty produktu počas následného spracovania a vďaka efektívnemu využitiu ultrafiltrácie umožňuje výrobu vysoko purifikovaného polysacharidu.
Výskumníci navyše zistili, že ultrazvukové spracovanie schizofylánu sa dá ľahko preniesť do väčšej mierky. Jedna jednotka poloprevádzkového ultrazvukového dezintegrátora UIP2000hdT spracovala 1 liter kultivačného bujónu za 110 s v prietokovom režime. Produktivitu systému možno ľahko zvýšiť sériovým zapojením ďalších ultrazvukových jednotiek.

 
Prečítajte si viac o jednoduchom prenose extrakcie z húb do väčšej mierky!
 

Vysokovýkonné ultrazvukové zariadenia na spracovanie hubových glukánov

Fragmentáciu polysacharidov, ako sú glukány, ako aj ďalších bioaktívnych zlúčenín, ako sú chitín a chitozán, možno spoľahlivo vykonávať pomocou vysokovýkonných ultrazvukových zariadení Hielscher. Naše ultrazvukové prístroje dokážu dosahovať vysoké amplitúdy, umožňujú presné riadenie procesných parametrov a možno ich prevádzkovať 24/7 pri veľkom zaťažení a v náročných prostrediach. Sortiment zariadení Hielscher Ultrasonics tieto požiadavky spoľahlivo spĺňa. Okrem vynikajúceho ultrazvukového výkonu sa ultrazvukové prístroje Hielscher vyznačujú vysokou energetickou účinnosťou, čo predstavuje významnú ekonomickú výhodu – najmä pri použití v komerčnej veľkovýrobe.
Ultrazvukové prístroje Hielscher sú vysokovýkonné systémy, ktoré možno vybaviť príslušenstvom, ako sú sonotródy, zosilňovače amplitúdy, reaktory alebo prietokové cely, aby optimálne vyhovovali potrebám vášho procesu.
Digitálny farebný displej, možnosť prednastavenia sonikačných cyklov, automatické zaznamenávanie údajov na integrovanú SD kartu, diaľkové ovládanie cez prehliadač a mnohé ďalšie funkcie zabezpečujú najvyššiu úroveň riadenia procesu a používateľskej prívetivosti. V spojení s robustnosťou a schopnosťou znášať veľké zaťaženie sú ultrazvukové systémy Hielscher vaším spoľahlivým pracantom vo výrobe.
Znižovanie molekulovej hmotnosti β-glukánov, ako je schizofylán, si vyžaduje výkonný ultrazvuk na dosiahnutie cieleného štiepenia a vysokokvalitného konečného produktu zo schizofylánu, ktorý možno použiť na farmaceutické aplikácie.
 
Viac informácií o ultrazvukovej extrakcii beta-glukánov z húb vrátane podrobného návodu nájdete tu!
 
Nasledujúca tabuľka poskytuje prehľad o približnej kapacite spracovania našich ultrazvukových zariadení: