Extrakcia beta-glukánov z húb pomocou ultrazvukom
Materiály a vybavenie
- Huby (napr. 100 g nasekaných alebo nakrájaných húb)
- Studená destilovaná voda (napr. 500 ml)
- Mixér alebo mlynček
- Sklenené kadičky alebo banky
- Filtračný papier alebo nastavenie vákuovej filtrácie
- Odstredivka (voliteľná)
- Alkohol (napr. etanol) na vyzrážanie
- Chladnička
- Sušiareň
Protokol extrakcie betaglukánu
- Mletie alebo drvenie húb (napr. Chaga alebo Lion’ hrivna) do hrubých častíc cca 1 až 3 milimetre. Napríklad použite 100 g sušených častíc húb.
- Potom pridajte častice húb do sklenenej kadičky alebo banky.
- Potom pridajte 500 ml destilovanej vody do kadičky obsahujúcej častice húb, ktoré sa majú extrahovať. Pomer vody k hubám sa môže líšiť v závislosti od konkrétneho typu huby a veľkosti častíc.
- Po premiešaní suspenzie sonikujte zmes pomocou ultrazvukového laboratórneho homogenizátora (napr. UP400St s 22mm sonotrode pri 100% amplitúde alebo UP200Ht so 14mm sonotrode pri 100% amplitúde) a udržujte teplotu pod 90 ° C. Nižšie teploty pomáhajú zachovať zlúčeniny citlivé na teplo, ako sú beta-glukány počas extrakcie. Sonikujte približne 5 až 10 minút pri použití UP400St a 10 až minút pri použití UP200Ht. Upozorňujeme, že teplota a čas extrakcie sa môžu líšiť v závislosti od použitého ultrazvukového výkonu. Samozrejme, väčšie objemy budú vyžadovať dlhšie časy ultrazvukom.
- Prefiltrujte sonikovanú zmes cez filtračný papier alebo použite vákuové filtračné nastavenie na oddelenie kvapaliny (obsahujúcej extrahované beta-glukány) od pevného zvyšku húb.
- Potom vyzrážajte betaglukány z kvapaliny pridaním alkoholu (napr. etanolu). Zvyčajne môžete použiť 2-3 objemy alkoholu na zrážanie.
- Potom zmes uchovávajte niekoľko hodín v chladničke, aby sa betaglukány mohli vyzrážať.
- Po vyzrážaní môžete kvapalinu opatrne dekantovať a zozbierať zrazeninu beta-glukánu.
- Nakoniec betaglukány sušte v peci pri nízkej teplote (napr. 40-50 ° C), kým sa neodstráni všetok alkohol a nezískate suchý prášok.
Huby vykazujú variácie vo svojich vlastnostiach. Preto sa proces extrakcie betaglukánom môže líšiť na základe faktorov, ako sú konkrétne druhy húb, stav húb (sušené alebo čerstvé), veľkosť častíc a teplota extrakcie. Ak chcete optimalizovať postup extrakcie, zvážte experimentovanie s rôznymi parametrami, vrátane zmeny pomerov tuhej látky k kvapaline, úpravy teplôt, skúmania rôznych rozpúšťadiel a testovania rôznych trvaní ultrazvukom a nastavení amplitúdy.
Rozpúšťadle asistovaná enzymatická extrakcia beta-glukánu
Rozpúšťadle asistovaná enzymatická extrakcia je metóda používaná na extrakciu beta-glukánov z húb pomocou kombinácie enzýmov a ultrazvukových vĺn. Tento proces zvyšuje účinnosť extrakcie tým, že rozkladá bunkové steny húb a uľahčuje uvoľňovanie beta-glukánov.
Rozšírenie extrakcie betaglukánu z húb
Po vytvorení protokolu extrakcie betaglukánu, ktorý spĺňa vaše požiadavky, môže byť rozšírenie procesu extrakcie jednoduchým úsilím.
Škálovanie dávkovej extrakcie
Ak plánujete škálovať pomocou metódy dávkovej extrakcie, odporúčame zvýšiť objem dávky pri zachovaní konštantného pomeru tuhej látky k kvapaline a všetkých ostatných parametrov. Ak budete pokračovať v používaní rovnakého ultrazvukového homogenizátora, nezabudnite úmerne zvýšiť čas ultrazvukom. V prípade dávok presahujúcich 1 liter možno budete chcieť zvážiť začlenenie pomalého miešadla na udržanie suspenzie častíc a zlepšenie rovnomernosti extrakcie. Obrázok nižšie ukazuje 8-litrové nastavenie dávkovej extrakcie pomocou ultrazvukového homogenizátora UP400St v kombinácii s laboratórnym miešadlom.
8L dávková hubová extrakcia s UP400St Sonicator
Vákuová filtrácia beta-glukánového extraktu po ultrazvukom
Inline extrakcia húb
Pre tých, ktorí majú záujem nepretržite extrahovať väčšie množstvá beta-glukánov z húb, Hielscher Ultrasonics ponúka reaktory s prietokovými článkami určené na extrakciu botanického materiálu. Ak sa vás to týka, odporúčame vám, aby ste sa so žiadosťou o ďalšie informácie obrátili priamo na nás. Náš technický tím vám rád pomôže určiť najvhodnejšie nastavenie pre vaše špecifické potreby. Avšak vykonanie vyššie uvedeného laboratórneho experimentu s vašimi konkrétnymi druhmi húb môže byť neoceniteľné pri pochopení presných požiadaviek procesu. Obrázok nižšie ukazuje veľký prietokový bunkový reaktor s ultrazvukovým homogenizátorom UIP4000hdT na extrakciu beta-glukánov pri približne 50 až 200 litroch suspenzie z hubového rozpúšťadla za hodinu.
UIP4000hdT ultrazvukový homogenizátor pre 50 až 200L suspenzie z hubového rozpúšťadla za hodinu
Empirická koncentrácia betaglukánu druhov húb
Nižšie nájdete zoznam empirickej koncentrácie betaglukánu, ktorá bola extrahovaná z rôznych druhov húb.
| Druhy húb | Obsah beta glukánu (% hmotnosti) |
|---|---|
| Termitomyces fuliginosus R. Heim | 1% |
| Hríb kolos R. Heim | 3% |
| Russula densifolia Secr. ex Gillet | 25% |
| Russula cyanoxantha (Schaeff.) Fr. | 29% |
| Russula alboareolata Hongo | 42% |
| Russula emetica (Schaeff.) Pers. | 10% |
| Russula delica Fr. | 38% |
| Pycnoporus cinnabarinus (Jacq.) P. Karst. | 35% |
| Amanita hemibapha (Berk. & Broome) Sacc. | 5% |
| Kútik Amanita princeps & Bas | 9% |
| Amanita caesarea (Scop.) Pers. | 4% |
| Heimiella retispora (Pat. & C.F. Baker) Boedijn | 19% |
| Cortinarius claricolor var. turmalis (Fr.) Quadr | 13% |
| Termitomyces tylerianus Otieno | 12% |
| Termitomyces microcarpus (Berk. & Broome) R. Heim | 8% |
| Termitomyces eurhizus (Berk.) R. Heim | 7% |
| Polyporellus varius (Pers.) P. Karst. | 2% |
| Pycnoporus coccineus (Fr.) Bondartsev & Spevák | 45% |
| Lentinus squarrosulus Mont. | 2% |
| Daedaleopsis confragosa (Bolton) J. Schröt | 3% |
| Pycnoporus sanguineus (L.) Fr. | 35% |
| Amanita hemibapha (Berk. & Broome) Sacc. | 5% |
| Amanita virgineoides Bas | 1% |
| Agaricus silvaticus Schaeff. | 3% |
| Chlorophyllum molybdites (G. Mey.) Massee | 3% |
| Ganoderma lucidum (Curtis) P. Kras. | 33% |
| Amauroderma rugosum (Blume & T. Nees) Torrend | 4% |
| Suillus bovinus var. bovinus (Pers.) Kuntze | 1% |
| Clitocybe suaveolens (Schumach.) P. Kumm. S | 9% |
| Cleroderma verrucosum (býk.) Pers. | 9% |
| Heimiella retispora (Pat. & C.F. Baker) | 19% |
| Lentinula edodes (Berk.) Pegler | 34% |
| Pycnoporus cinnabarinus (Jacq.) P. Karst. | 35% |
koncentrácia betaglukánu druhov divých húb, Zdroj: Boonyanuphap, Jaruntorn & Hansawasdi, Chanida. (2010). Priestorové rozloženie spoločenstiev divých húb obsahujúcich beta glukán v subtropickom suchom lese, Thajsko. Rozmanitosť húb. 46. 29-42. 10.1007/S13225-010-0067-8,
Kvantifikácia koncentrácie betaglukánového extraktu húb
Koncentráciu betaglukánu po extrakcii možno kvantifikovať rôznymi metódami v závislosti od typu betaglukánu a špecifických požiadaviek analýzy. Bežné metódy kvantifikácie koncentrácie betaglukánu sú uvedené nižšie. Výber metódy samozrejme závisí od faktorov, ako je požadovaná presnosť a dostupné vybavenie.
-
Gravimetrická metóda
- Princíp: Táto metóda je založená na vyzrážaní betaglukánov etanolom, po ktorom nasleduje vysušenie a váženie zrazeniny.
- Postup: Vzorka sa rozpustí vo vode, upraví sa etanolom, aby sa vyzrážali betaglukány, a potom sa zrazenina zhromaždí, vysuší a odváži.
- výhody: Jednoduché a široko používané.
- Obmedzenia: Menej presné v porovnaní s inými metódami.
-
Kolorimetrické metódy
- Princíp: Tieto metódy zahŕňajú farebné reakcie so špecifickými činidlami, ktoré spôsobujú zmenu farby úmernú koncentrácii beta-glukánu.
-
Príklady:
- Metóda fenol-kyselina sírová: Táto metóda zahŕňa spracovanie vzorky koncentrovanou kyselinou sírovou a fenolom, čím sa roztok zmení na oranžový. Intenzita farby je úmerná koncentrácii betaglukánu.
- Antrónová metóda: Antrónové činidlo reaguje s beta-glukánmi na vytvorenie modrozelenej farby a meria sa intenzita farby.
- Výhody: Citlivé a vhodné na analýzu s vysokou priepustnosťou.
- Obmedzenia: Interferencia iných zlúčenín a potreba špecifických činidiel.
-
Enzymatické testy
- Princíp: Enzymatické testy používajú enzýmy ako β-glukanáza na štiepenie beta-glukánov na jednoduchšie cukry a uvoľnené cukry sú kvantifikované.
- Výhody: Veľmi špecifické a presné.
- Obmedzenia: Vyžaduje špeciálne vybavenie a činidlá.
-
Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC)
- Princíp: HPLC separuje a kvantifikuje zlúčeniny na základe ich interakcií s chromatografickou kolónou.
- Postup: Betaglukány sa hydrolyzujú na monosacharidy a výsledné cukry sa separujú a kvantifikujú pomocou HPLC.
- Výhody: Vysoká presnosť a vhodné pre zložité vzorky.
- Obmedzenia: Vyžaduje špecializované vybavenie a odborné znalosti.
-
Špecifické imunotesty
- Princíp: Imunotesty používajú protilátky špecifické pre betaglukány na kvantifikáciu ich koncentrácie.
-
Príklady:
- ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): Pri tejto metóde enzýmovo viazaná protilátka spôsobuje zmenu farby, keď sa viaže na beta-glukány.
- Testy laterálneho prietoku: Ide o rýchle testy, ktoré poskytujú viditeľný výsledok na testovacom prúžku.
- Výhody: Vysoká špecifickosť a citlivosť.
- Obmedzenia: Vyžaduje špecifické protilátky a môže byť nákladnejšie.