Tvorba amyloidových fibríl pomocou sonikátora mikrotitračných platničiek UIP400MTP

Amyloidové fibrily vznikajú podobne ako kryštály procesom nukleácie a následného rastu. Vzhľadom na vysokú bariéru voľnej energie pri nukleácii však k spontánnej tvorbe amyloidových fibríl dochádza až po predĺženej lag fáze. Ultrazvukové spracovanie sa osvedčilo ako účinný nástroj na vyvolanie nukleácie amyloidu, čím výrazne urýchľuje tvorbu fibríl. V kombinácii s čítačkou mikrotitračných platničiek využívajúcou fluorescenciu tioflavínu T (ThT) umožňuje ultrazvukové spracovanie vysokokapacitnú detekciu amyloidových fibríl vo viacerých vzorkách súčasne.

Ultrazvukom indukovaná tvorba amyloidových fibríl pomocou sonikátora mikrotitračných platničiek UIP400MTP

Pomocou sonikátora viaczásobných jamkových platničiek UIP400MTP možno na výskumné účely rýchlo syntetizovať veľké množstvá amyloidových fibríl rovnakej kvality. Tento účinný prístup umožňuje skúmať amyloidogenicitu proteínov. Táto technika umožňuje rýchlu a reprodukovateľnú amyloidovú fibriláciu, ako sa preukázalo pri β2-mikroglobulíne (β2-m), amyloidogénnom proteíne spojenom s amyloidózou súvisiacou s dialýzou.

Jednoduchý experimentálny prístup: ultrazvukom indukovaná amyloidová fibrilácia

Na vyvolanie tvorby fibríl sa do stredu sonikátora viaczásobných jamkových platničiek UIP400MTP umiestnila 96-jamková mikrotitračná platnička, čím sa zabezpečilo rovnomerné pôsobenie ultrazvuku vo všetkých jamkách. Experimentálne podmienky boli nasledujúce:

1. Každá jamka obsahovala 0,2 ml roztoku β2-mikroglobulínu (0,3 mg/ml, pH 2,5) s prídavkom 5 μM ThT.
2. Platnička sa podrobila cyklom ultrazvukového spracovania, napríklad 1 minúte ultrazvukového spracovania, po ktorej nasledovala 9-minútová prestávka.
3. Po sonikácii sa fluorescencia ThT merala pomocou čítačky mikrotitračných platničiek.

(porov. So et al., 2011)

Porovnanie s konvenčným premiešavaním

V porovnaní s tradičnými metódami premiešavania ultrazvukové spracovanie výrazne skrátilo lag fázu tvorby fibríl. Pri konvenčnom pretrepávaní mikrotitračnej platničky sa po 20 hodinách prejavila zvýšená fluorescencia ThT iba v 1 z 10 jamiek. Naproti tomu pri cyklickom ultrazvukovom spracovaní (15 minút sonikácie, po ktorých nasledovalo 5 minút v pokoji) sa výrazné zvýšenie fluorescencie ThT zistilo ihneď po prvom sonikačnom spracovaní.

Výrazné zrýchlenie kinetiky fibrilácie

Výsledky štúdie So et al. (2011) preukázali, že spontánnu tvorbu fibríl β2-mikroglobulínu pri pH 2,5 možno pomocou ultrazvukového spracovania urýchliť z niekoľkých hodín na iba 10–15 minút.
Snímky z mikroskopie atómových síl (AFM) potvrdili, že fibrily vytvorené 10-minútovým ultrazvukovým spracovaním každých 15 minút boli morfologicky nerozoznateľné od fibríl vytvorených 1-minútovým ultrazvukovým spracovaním každých 10 minút. To poukazuje na reprodukovateľnosť a robustnosť ultrazvukom indukovanej amyloidovej fibrilácie.

AFM snímky amyloidových fibríl vytvorených 1-minútovým ultrazvukovým spracovaním každých 10 min (i), 10-minútovou sonikáciou každých 15 min (ii) a reakciou so zárodkami bez ultrazvukového spracovania (iii). Biela mierka predstavuje 1 μm.
Štúdia a snímky: ©So et al., 2011

Fibrilácia pri neutrálnom pH

Aj pri neutrálnom pH sa dosiahla tvorba fibríl po lag fáze trvajúcej 1,5 hodiny, čo preukazuje, že ultrazvukové spracovanie výrazne znižuje energetickú bariéru nukleácie a rastu. To ďalej podporuje hypotézu, že amyloidová fibrilácia je predovšetkým fyzikálnou reakciou, ktorú do veľkej miery obmedzuje energetická bariéra nukleácie, pričom ultrazvukové spracovanie túto bariéru účinne znižuje.

Vplyv na výskum ochorení súvisiacich s amyloidom

Jednoduchá a spoľahlivá tvorba amyloidových fibríl pomocou sonikátora mikrotitračných platničiek UIP400MTP má významné dôsledky pre výskum Alzheimerovej choroby (AD) a ďalších ochorení súvisiacich s amyloidom, ako sú Parkinsonova choroba, diabetes II. typu a systémové amyloidózy. Pri AD je agregácia amyloidu-β (Aβ) kľúčovým patologickým znakom, no skúmanie kinetiky jeho fibrilácie zostáva náročné pre dlhé lag fázy a variabilitu konvenčných metód. Tvorba fibríl vyvolaná ultrazvukovým spracovaním urýchľuje nukleáciu, čím zabezpečuje vysokú reprodukovateľnosť a zníženú variabilitu, čo je zásadné pre skríning potenciálnych inhibítorov a pochopenie amyloidogénnych mechanizmov. Vysokokapacitné spracovanie pomocou UIP400MTP navyše umožňuje rozsiahly výskum nesprávneho skladania a agregácie proteínov, čím uľahčuje objavovanie terapeutických látok, ktoré môžu modulovať tvorbu fibríl a potenciálne zmierňovať progresiu neurodegenerácie.

Táto štúdia potvrdzuje ultrazvukové spracovanie pomocou sonikátora viaczásobných jamkových platničiek UIP400MTP ako vysoko účinnú metódu na urýchlenie tvorby amyloidových fibríl. Medzi hlavné výhody tohto prístupu patria:

• Výrazné skrátenie lag fázy fibrilácie.
• Rovnomerné pôsobenie ultrazvuku vo všetkých jamkách, ktoré umožňuje reprodukovateľnú tvorbu fibríl.
• Možnosť vysokokapacitného skríningu, vďaka ktorej je tento prístup vhodný na celogenómové vyhľadávanie amyloidogenicity proteínov.

Spojením ultrazvukového spracovania s detekciou fluorescencie ThT poskytuje táto metóda rýchlu, škálovateľnú a spoľahlivú platformu na skúmanie amyloidovej fibrilácie. Vzhľadom na svoju účinnosť a potenciál vysokokapacitného spracovania môže tento prístup uľahčiť jednoduchú syntézu amyloidových fibríl pre biofyzikálny a farmaceutický výskum a ponúka sľubný nástroj na štúdie súvisiace s amyloidom a skríning liečiv.