Tvorba amyloidných fibríl pomocou UIP400MTP Microplate Sonicator

Amyloidné fibrily, podobne ako kryštály, vznikajú procesom nukleácie a následného rastu. Avšak kvôli vysokej bariére nukleácie voľnej energie dochádza k spontánnej tvorbe amyloidných fibríl až po dlhšej oneskorenej fáze. Ultrazvuk sa ukázal ako silný nástroj na indukciu nukleácie amyloidu, čím sa výrazne urýchľuje tvorba fibríl. V kombinácii s čítačkou mikroplatničiek využívajúcou fluorescenciu tioflavínu T (ThT) umožňuje ultrazvuk vysokovýkonnú detekciu amyloidných fibríl vo viacerých vzorkách súčasne.

Ultrazvukom indukovaná tvorba amyloidných fibríl pomocou sonikátora UIP400MTP mikrodoštičiek

S UIP400MTP viacjamkovým doštičkovým sonikátorom je možné na výskumné účely rýchlo syntetizovať amyloidné fibrily rovnakej kvality vo veľkých množstvách. Tento efektívny prístup umožňuje študovať amyloidogenitu proteínov. Táto technika uľahčuje rýchlu a reprodukovateľnú fibriláciu amyloidov, ako sa demonštruje u β2-mikroglobulínu (β2-m), amyloidogénneho proteínu spojeného s amyloidózou súvisiacou s dialýzou.

Jednoduchý experimentálny prístup: Ultrazvukom indukovaná amyloidná fibrilácia

Na vyvolanie tvorby fibríl bola do stredu UIP400MTP viacjamkového doštičky umiestnená 96-jamková mikroplatnička, ktorá zaisťuje rovnomernú ultrazvukovú expozíciu vo všetkých jamkách. Experimentálne podmienky boli nasledovné:

1. Každá jamka obsahovala 0,2 ml roztoku β2-mikroglobulínu (0,3 mg/ml, pH 2,5) doplneného o 5 μM ThT.
2. Doštička bola podrobená ultrazvukovým cyklom, ako je 1-minútová ultrazvuková infekcia, po ktorej nasledovala 9-minútová pauza.
3. Po sonikácii bola fluorescencia ThT meraná pomocou čítačky mikrodoštičiek.

(porovnaj So a kol., 2011)

Porovnanie s konvenčným miešaním

V porovnaní s tradičnými metódami miešania ultrazvuk drasticky znížil oneskorenú fázu tvorby fibríl. V bežných podmienkach trasenia mikroplatničiek iba 1 z 10 jamiek vykazovala zvýšenú fluorescenciu ThT po 20 hodinách. Naproti tomu pri použití cyklovanej ultrazvukovej terapie (15 minútová sonikacia nasledovaná 5-minútovým pokojom) sa bezprostredne po prvej sonikačnej liečbe zistilo významné zvýšenie fluorescencie ThT.

Rýchle zrýchlenie kinetiky fibrilácie

Výsledky získané od So et al. (2011) preukázali, že spontánna tvorba fibríl β2-mikroglobulínu pri pH 2,5 sa dá ultrazvukom urýchliť z niekoľkých hodín na iba 10–15 minút.
Snímky mikroskopie atómových síl (AFM) potvrdili, že fibrily generované 10-minútovou ultrazvukovou ultrazvukom každých 15 minút boli morfologicky nerozoznateľné od tých, ktoré vznikli pomocou 1-minútovej ultrazvukovej ultrasonizácie každých 10 minút. To zdôrazňuje reprodukovateľnosť a robustnosť ultrazvukom indukovanej amyloidnej fibrilácie.

AFM snímky amyloidných fibríl produkované 1-minútovou ultrazvukovou ultrazvukom každých 10 minút (i), 10-minútovou sonikáciou každých 15 minút (ii) a výsevnou reakciou bez ultrazvuku (iii). Biely pruh stupnice predstavuje 1 μm.
Štúdia a obrázky: ©So et al., 2011

Fibrilácia pri neutrálnych podmienkach pH

Dokonca aj za neutrálnych podmienok pH sa tvorba fibríl dosiahla po oneskorení 1,5 hodiny, čo dokazuje, že ultrazvuk významne znižuje energetickú bariéru nukleácie a rastu. To ďalej podporuje hypotézu, že amyloidná fibrilácia je primárne fyzikálna reakcia, do značnej miery obmedzená nukleačnou energetickou bariérou, ktorú ultrazvuk účinne znižuje.

Vplyv na výskum chorôb súvisiacich s amyloidom

Jednoduchá a spoľahlivá tvorba amyloidných fibríl pomocou sonikátora mikrodoštičiek UIP400MTP má významné dôsledky pre výskum Alzheimerovej choroby (AD) a iných porúch súvisiacich s amyloidmi, ako je Parkinsonova choroba, cukrovka typu II a systémové amyloidózy. Pri AD je agregácia amyloid-β (Aβ) kľúčovým patologickým znakom, ale štúdium jeho fibrilačnej kinetiky zostáva náročné kvôli dlhým oneskoreným fázam a variabilite konvenčných metód. Tvorba fibríl riadená ultrazvukom urýchľuje nukleáciu, zaisťuje vysokú reprodukovateľnosť a zníženú variabilitu, čo je rozhodujúce pre skríning potenciálnych inhibítorov a pochopenie amyloidogénnych mechanizmov. Okrem toho vysokovýkonná schopnosť UIP400MTP umožňuje rozsiahle skúmanie nesprávneho skladania a agregácie proteínov, čo uľahčuje objavovanie terapeutických látok, ktoré môžu modulovať tvorbu fibríl a potenciálne zmierniť neurodegeneratívnu progresiu.

Táto štúdia zavádza ultrazvuk pomocou UIP400MTP viacjamkového doštičkového sonikátora ako vysoko účinnú metódu na urýchlenie tvorby amyloidných fibríl. Medzi hlavné výhody tohto prístupu patria:

• Dramatické skrátenie oneskorenia fibrilácie.
• Rovnomerná ultrazvuková expozícia vo všetkých jamkách, čo umožňuje reprodukovateľnú tvorbu fibríl.
• Schopnosť vysokovýkonného skríningu, vďaka čomu je vhodný na vyhľadávanie amyloidogenity proteínu v celom genóme.

Integráciou ultrazvuku s fluorescenčnou detekciou ThT poskytuje táto metóda rýchlu, škálovateľnú a spoľahlivú platformu na štúdium fibrilácie amyloidov. Vzhľadom na svoju účinnosť a vysokovýkonný potenciál môže tento prístup uľahčiť jednoduchú syntézu amyloidných fibríl pre biofyzikálny a farmaceutický výskum a ponúknuť sľubný nástroj pre štúdie súvisiace s amyloidmi a skríning liekov.