PMCA na vysokovýkonnú detekciu priónov pomocou UIP400MTP Sonicator

Sonikátor UIP400MTP s viacjamkovými doštičkami ponúka výkonné riešenie pre vysokovýkonnú prípravu vzoriek pri cyklickej amplifikácii s chybným skladaním proteínov (PMCA). Vďaka rovnomernému rozloženiu energie vo viacerých vrtoch a udržiavaniu presných parametrov sonikácie umožňuje tento systém súčasné spracovanie mnohých vzoriek s výnimočnou reprodukovateľnosťou. Tieto schopnosti sú rozhodujúce pre optimalizáciu PMCA na detekciu priónov v nízkych koncentráciách v náročných biologických vzorkách, ako sú sliny, kde inhibítory testov môžu zakryť výsledky.

Priónové choroby, ako je chronické chradnutie (CWD) u jeleňovitých a Creutzfeldt-Jakobova choroba (CJD) u ľudí, sú neurodegeneratívne poruchy spôsobené nesprávne zloženými priónovými proteínmi (PrP^Sc). Tieto ochorenia často zahŕňajú nízke hladiny infekčných priónov v telesných tekutinách, ako sú sliny, krv a moč, čo komplikuje diagnostiku a výskum. Horizontálny prenos CWD prostredníctvom priónov vylučovaných v environmentálnych matriciach má obzvlášť významné dôsledky pre manažment voľne žijúcich živočíchov a ekologické zdravie. Podobne pri chorobách, ako je Creutzfeldt-Jakobova choroba, je spoľahlivá amplifikácia nesprávne zložených priónových proteínov z ľudských vzoriek rozhodujúca pre pokrok v diagnostike a pochopenie progresie ochorenia.

Aplikácia modifikovaného protokolu PMCA umožňuje obísť bežné inhibítory testu (napr. mucíny v slinách) a dosiahnuť vysokú citlivosť pri detekcii priónov, ktoré by inak boli nezistiteľné alebo nejednoznačné pomocou techník, ako je konverzia vyvolaná trasením v reálnom čase (RT-QuIC). Tieto pokroky zlepšujú detekciu priónov pre rôzne choroby, vďaka čomu je PMCA nepostrádateľným nástrojom pre výskum a diagnostiku priónov. Viacjamkový sonikátor UIP400MTP uľahčuje vysokovýkonné sonikovanie mnohých vzoriek PMCA na mikroplatničkách (napr. 6-, 24- alebo 96-jamkové platne) alebo injekčných liekovkách v stojane na skúmavky.

Protokol pre vysokovýkonnú cyklickú amplifikáciu nesprávneho skladania proteínov (PMCA)

Nasledujúci protokol umožňuje efektívne spracovanie vysokého počtu vzoriek za presne rovnakých podmienok pre robustné výsledky výskumu.

Príprava vzorky

Východiskový materiál:
Pripravte vzorky:

• Resuspendovanie extrakcií sarkosylu v substráte PMCA.
• Priame nanášanie mozgových homogenátov alebo vzoriek krvi priónovými semenami.

Substrát:

• Použite 10% (hmotnostný/obj.) mozgový homogenát pripravený z transgénnych myší s nadmernou expresiou PrP^C (napr. myši Tg).
• Homogenizujte mozgové tkanivo v:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Až do použitia skladujte substrát pri teplote -80 ° C.

Nastavenie vzorky v mikroplatničkách alebo skúmavkách:
Rúrky:

• Pridajte 90 μl substrátu mozgového homogenátu a nasejte 10 μl vzorky (napr. krv, mozgový homogenát alebo sarkosylová peleta).
• Do každej 0,2 ml skúmavky vložte 3 teflónové guľôčky (priemer 1,59 mm alebo 2,38 mm).
• Namontujte trubice do stojana kompatibilného s UIP400MTP sonikátorom.

6-jamková mikroplatňa:

• Pridajte 5 ml mozgového homogenátového substrátu a nasejte 500 μl vzorky na jamku.
• Do každej jamky pridajte 3 teflónové guľôčky.

Postup PMCA

Umiestnenie:
Umiestnite stojan na skúmavky alebo 6-jamkovú mikroplatňu do UIP400MTP sonikátora podľa pokynov výrobcu.

Cyklistický program:
Vykonajte 144 cyklov PMCA nasledovne:

• Inkubácia: 29 minút a 30 sekúnd pri 37 °C.
• Sonikácia: 30 sekúnd pri 60% amplitúde.
• Monitorovanie teploty: Pomocou zásuvného snímača teploty monitorujte sample teplota a naprogramujte UIP400MTP na max. teplota 48–50 °C.

Nasledujúce kolá:
Po dokončení prvého kola 144 cyklov preneste alikvotnú časť amplifikovaného materiálu:

• Zrieďte 10-násobne na čerstvý transgénny substrát homogenátu mozgu myší.
• Vykonajte 96 cyklov PMCA pre nasledujúce kolá pri zachovaní rovnakých parametrov sonikácie.
• Pokračujte požadovaným počtom kol (zvyčajne až 5).

Detekcia PrP^Sc

1. Trávenie proteinázy K:
   – Vzorky ošetrujte proteinázou K (50 μg/ml) pri 37 °C počas 1 hodiny.
   – Ukončite rozklad pridaním tlmivého roztoku na vzorku SDS a varením 10 minút.
2. Analýza Western Blot:
   – Analyzujte narastené vzorky pomocou:
   – 6H4 alebo PRC1 anti-PrP protilátky.
   – Vykonajte SDS-PAGE a preneste na PVDF membrány na detekciu.

 

 

Spracujte viac vzoriek pre robustnejšie výsledky

Viacjamkový sonikátor UIP400MTP výrazne zvyšuje účinnosť a škálovateľnosť cyklickej amplifikácie nesprávneho skladania proteínov (PMCA), čím rieši tradične časovo náročnú povahu postupu. Tým, že systém umožňuje súčasné spracovanie až 96 vzoriek v 96-jamkovej platni, zefektívňuje pracovné postupy PMCA pri zachovaní presných a jednotných podmienok sonikácie vo všetkých jamkách. Táto vysokovýkonná schopnosť minimalizuje ručnú manipuláciu, znižuje kroky náročné na prácu a zaisťuje reprodukovateľnosť, čo z neho robí nepostrádateľný nástroj pre výskum priónov. Či už ide o skúmanie chronického chradnutia alebo Creutzfeldt-Jakobovej choroby, UIP400MTP umožňuje rozsiahle štúdie s vyššou účinnosťou a umožňuje výskumníkom splniť požiadavky moderných diagnostických a vedeckých aplikácií.

---

---

Literatúra / Referencie

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.