PMCA na vysoko priepustnú detekciu priónov pomocou sonifikátora UIP400MTP

Sonifikátor viacdôlkovej platne UIP400MTP ponúka mocné riešenie pre prípravu vzoriek s vysokou priepustnosťou pri cyklickej amplifikácii nesprávne zložených proteínov (PMCA). Dodávaním rovnomerného rozloženia energie do viacerých dôlkov a udržiavaním presných parametrov sonifikácie tento systém umožňuje simultánne spracovanie mnohých vzoriek s výnimočnou reprodukovateľnosťou. Tieto schopnosti sú kritické pre optimalizáciu PMCA na detekciu priónov pri nízkych koncentráciách v náročných biologických vzorkách, ako sú sliny, kde inhibítory stanovenia môžu zakryť výsledky.

Prionové choroby, ako je chronická choroba hubnutia (CWD) u jelenovitých a Creutzfeldt-Jakobova choroba (CJD) u ľudí, sú neurodegeneratívne poruchy spôsobené nesprávne zloženými priónovými proteínmi (PrP^Sc). Tieto choroby často zahŕňajú nízke hladiny infekčných priónov v telesných tekutinách, ako sú sliny, krv a moč, čo komplikuje diagnostiku a výskum. Horizontálny prenos CWD prostredníctvom priónov vylúčených v environmentálnych matriciach má obzvlášť významné dôsledky pre manažment voľne žijúcich živočíchov a ekologické zdravie. Podobne, pri chorobách ako Creutzfeldt-Jakobova choroba, je spoľahlivá amplifikácia nesprávne zložených priónových proteínov z ľudských vzoriek kľúčová pre pokrok v diagnostike a pochopenie progresie choroby.

Aplikácia modifikovaného protokolu PMCA umožňuje obísť bežné inhibítory stanovenia (napr. mucíny v slinách) a dosiahnuť vysokú citlivosť pri detekcii priónov, ktoré by boli inak nedetekovateľné alebo nejednoznačné pomocou techník, ako je konverzia indukovaná trasením v reálnom čase (RT-QuIC). Tieto pokroky zvyšujú detekciu priónov pre rôzne choroby, čím robia PMCA nepostrádateľným nástrojom pre výskum priónov a diagnostiku. Sonifikátor viacdôlkovej platne UIP400MTP uľahčuje PMCA s vysokou priepustnosťou sonifikáciou mnohých vzoriek v mikrotitračných platniach (napr. 6-, 24- alebo 96-dôlkových platniach) alebo skúmavkách v stojane na skúmavky.

Protokol pre cyklickú amplifikáciu nesprávne zložených proteínov (PMCA) s vysokou priepustnosťou

Nasledujúci protokol umožňuje efektívne spracovanie veľkého počtu vzoriek pod presne rovnakými podmienkami pre robustné výskumné výsledky.

Príprava vzoriek

Počiatočný materiál:
Pripravte vzorky:

• Resuspendovaním peletov extrakcie sarkosylom v substráte PMCA.
• Priamym pridaním priónových semien do homogenátov mozgu alebo krvných vzoriek.

Substrát:

• Použite 10% (hm./obj.) homogenát mozgu pripravený z transgenných myší nadmerne exprimujúcich PrP^C (napr. Tg myši).
• Homogenizujte mozgové tkanivo v:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Uchovávajte substrát pri -80 ºC až do použitia.

Nastavenie vzoriek v mikrotitračnej platni alebo skúmavkách:
Skúmavky:

• Pridajte 90 μL substrátu homogenátu mozgu a zaočkujte 10 μL vzorky (napr. krv, homogenát mozgu alebo pelet sarkosylu).
• Do každej 0,2 mL skúmavky vložte 3 teflónové guľôčky (priemer 1,59 mm alebo 2,38 mm).
• Umiestnite skúmavky do stojana kompatibilného so sonifikátorom UIP400MTP.

6-dôlková mikrotitračná platňa:

• Pridajte 5 mL substrátu homogenátu mozgu a zaočkujte 500 μL vzorky na dôlku.
• Do každej dôlky pridajte 3 teflónové guľôčky.

Postup PMCA

Umiestnenie:
Umiestnite stojan na skúmavky alebo 6-dôlkovú mikrotitračnú platňu do sonifikátora UIP400MTP podľa pokynov výrobcu.

Program cyklovania:
Vykonajte 144 cyklov PMCA nasledovne:

• Inkubácia: 29 minút a 30 sekúnd pri 37 °C.
• Sonifikácia: 30 sekúnd pri 60% amplitúde.
• Monitorovanie teploty: Použite odpojitelný teplotný senzor na monitorovanie teploty vzorky a naprogramujte UIP400MTP na max. teplotu 48–50 °C.

Následné kolá:
Po dokončení prvého kola 144 cyklov preneste alikvot amplifikovaného materiálu:

• Zrieďte 10-násobne do čerstvého substrátu homogenátu mozgu transgenných myší.
• Vykonajte 96 cyklov PMCA pre následné kolá, pričom udržiavajte rovnaké parametre sonifikácie.
• Pokračujte pre požadovaný počet kôl (zvyčajne až 5).

Detekcia PrP^Sc

1. Trávenie proteinázou K:
   – Ošetrite vzorky proteinázou K (50 μg/mL) pri 37 °C po dobu 1 hodiny.
   – Ukončite trávenie pridaním SDS-vzorkového pufra a varom po dobu 10 minút.
2. Analýza Western blot:
   – Analyzujte trávené vzorky pomocou:
   – protilátok 6H4 alebo PRC1 anti-PrP.
   – Vykonajte SDS-PAGE a prenos na PVDF membrány pre detekciu.

 

Hielscher UIP400MTP je najuniverzálnejší sonikátor pre vaše viacjamkové platničky, PCR platničky alebo skúmavky na vzorky. S nepretržitým sonikačným výkonom 400 wattov je určený na aplikácie, ako sú lýza buniek, emulgácia, extrakcia proteínov, fragmentácia DNA / RNA, deaglomerácia, extrakcia zo vzoriek FFPE, uvoľňovanie buniek a biofilmov alebo emulgácia. UIP400MTP nie je ultrazvukový kúpeľ. Je to ultrazvukový rezonátor miskového typu s vysokou intenzitou na cielenú sonikáciu. Tento výkonný bezkontaktný sonikátor zabezpečuje rovnomernú sonikáciu vo všetkých jamkách štandardnej mikrotitračnej platničky. Umožňuje presné ovládanie amplitúdy, výkonu a pulzného režimu. Zabudovaný časovač a teplotná sonda zabezpečujú konzistentné výsledky. Platničkový sonikátor UIP400MTP chladí vzorky vo vodnom kúpeli s voliteľným externým chladičom.

 

Spracujte viac vzoriek pre robustnejšie výsledky

Sonifikátor viacdôlkovej platne UIP400MTP výrazne zvyšuje účinnosť a škálovateľnosť cyklickej amplifikácie nesprávne zložených proteínov (PMCA), čím rieši tradične časovo náročnú povahu postupu. Umožnením simultánneho spracovania až 96 vzoriek v 96-dôlkovej platni systém zefektívňuje workflow PMCA, pričom udržiava presné a rovnomerné podmienky sonifikácie vo všetkých dôlkoch. Táto schopnosť vysokej priepustnosti minimalizuje manuálnu manipuláciu, znižuje pracné kroky a zabezpečuje reprodukovateľnosť, čím sa stáva nepostrádateľným nástrojom pre výskum priónov. Či už sa skúma chronická choroba hubnutia alebo Creutzfeldt-Jakobova choroba, UIP400MTP uľahčuje rozsiahle štúdie s väčšou účinnosťou, čo umožňuje výskumníkom splniť požiadavky modernej diagnostiky a vedeckých aplikácií.

---

---

Literatúra / Referencie

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.