Dezagregarea celulară prin ultrasunete a probelor bacteriene
Probele bacteriene ajung rareori sub formă de suspensii cu adevărat unicelulare. Culturile se dezvoltă sub formă de lanțuri și flocoane, izolatele din mediu formează agregate legate de substanțe polimerice extracelulare, iar sedimentele centrifugate rezistă adesea resuspensiei, în ciuda agitării intense cu vortexul. Numărarea celulelor viabile, densitatea optică, citometria în flux și profilarea microbiomului pornesc toate de la premisa că o particulă este egală cu o celulă. Dezagregarea celulară cu ultrasunete rezolvă această problemă: impulsuri scurte și controlate de sonicare separă agregatele în celule individuale fără a le liza.
De ce agregarea celulară afectează rezultatele
Agregarea este o caracteristică biologică, nu o eroare de preparare. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces și multe specii din mediu se dezvoltă sub formă de lanțuri, aglomerări sau fragmente de biofilm, iar ADN-ul extracelular și polizaharidele lipesc celulele între ele în sedimente și în eluații de tampoane. Consecințele analitice sunt sistematice:
- Numărul coloniilor este subestimat, deoarece o aglomerare dă naștere la o singură colonie, indiferent de numărul de celule pe care îl conține.
- Densitatea optică și contoarele de particule înregistrează agregate în loc de celule, ceea ce denaturează curbele de creștere.
- Citometria în flux și sortarea celulară numără greșit evenimentele aglomerate și le exclud din analiză.
- Extracțiile de ADN și proteine cuprind doar celulele de pe suprafața agregatului, ceea ce denaturează datele privind microbiomul și cele omice.
Metodele convenționale sunt lente, incomplete sau produc modificări chimice. Pipetarea energică și agitare cu vortexul lasă în urmă microagregate. Dispersia enzimatică sau pe bază de chelatori modifică suprafața celulară pe care doriți să o analizați. Dezagregarea mecanică prin cavitație controlată acționează în câteva secunde și nu necesită aditivi.
Un agregat este echivalent cu o colonie – și un singur rezultat eronat. Vedeți cum dezagregarea cu ultrasunete produce suspensii cu adevărat unicelulare, fără liză, aerosoli sau manipularea sondelor. Solicitați mai multe informații!
Multi-Tube Sonicator VialTweeter pentru pregătirea probelor fără contact: Desfaceți aglomerările de celule din tuburile sigilate
Cum sonicația dezagregă celulele fără a le liza
Dezagregarea celulară prin ultrasunete se bazează pe o diferență de rezistență mecanică. Agregatele bacteriene sunt menținute împreună de legături intercelulare relativ slabe și de o matrice extracelulară, în timp ce învelișul celular intact rezistă la forțe de forfecare substanțial mai mari. Pe măsură ce ultrasunetele calibrate pătrund în suspensie, cavitația acustică generează microcurenți, impulsuri de presiune și forțe de forfecare care acționează mai întâi la interfețele agregatelor. Agregatele, lanțurile și fragmentele de biofilm sunt separate prin forfecare (deaglomerare) înainte de a se atinge nivelul de energie la care membranele se rup (liză).
Dezagregarea cu ultrasunete a aglomerărilor de celule bacteriene
Dezagregare sau liză – Importanța parametrilor de sonicare
Consecința practică este că dezagregarea și liza reprezintă același instrument utilizat cu parametri diferiți. La o amplitudine moderată, cicluri de impulsuri scurte și temperatură controlată, se obține o suspensie de celule viabile individuale. Creșterea amplitudinii, a timpului de expunere sau a temperaturii probei orientează procesul către distrugerea completă a celulelor pentru ținte intracelulare. Generatoarele Hielscher vă permit să setați cu precizie amplitudinea, puterea, impulsul și energia de intrare și să salvați metoda, astfel încât etapa de dezagregare să fie reproductibilă pentru toate probele, operatorii și ciclurile de lucru.
Sonicare eficientă fără contact
Sonicarea în baie nu poate egala acest nivel de control. Băile și rezervoarele de curățare cu ultrasunete furnizează doar o energie ultrasonică redusă, ceea ce duce la o pregătire incompletă, iar cavitația are loc inegal, astfel încât fiecare tub este tratat în funcție de poziția sa în baie. VialTweeter transmite forțe ultrasonice intense și concentrate direct prin peretele recipientului către până la 10 probe sigilate simultan. Tratamentele care necesită o expunere îndelungată și variabilă într-o baie sunt realizate într-un model de impulsuri standardizat.
Aparatele de sonicare fără contact Hielscher aplică ultrasunete intense și concentrate prin pereții flacoanelor închise. VialTweeter prelucrează simultan până la 10 flacoane la aceeași intensitate, fără sondă în probă, fără contaminare încrucișată și fără eliberare de aerosoli. Atunci când capacitatea de procesare o impune, sonicatoarele pentru microplăci UIP400MTP și UIP550MTP extind același transfer controlat de energie la plăcile cu mai multe godeuri.
The VialTweeter sonichează simultan până la 10 flacoane mai mici și până la 5 eprubete mai mari.
Avantajele dezagregării cu ultrasunete fără contact
- Fără contaminare încrucișată: Deoarece flacoanele rămân închise permanent și nicio sondă nu este scufundată în probă, se evită complet contaminarea încrucișată și pierderea probei. Nu este necesară sterilizarea niciunui element între probe, iar o serie de analize nu poate afecta următoarea.
- Protecție împotriva aerosolilor: Sonicația cu sondă deschisă generează aerosoli infecțioși și contaminează suprafețele instrumentelor. Sonicația cu flacon etanș menține proba în interiorul propriului tub, aspect important atunci când se lucrează cu bacterii patogene, precum Mycobacterium tuberculosis și alți agenți de nivel BSL-2 sau BSL-3.
- Fără pierderi din bacșiș: Sondele din titan pot elibera o cantitate mică de microparticule în probă în timpul funcționării. Aceste particule modifică densitatea optică și numărul de particule în aval. Sonicarea indirectă prin peretele recipientului elimină complet această sursă de particule solide.
- Debit uniform: VialTweeter asigură aceeași intensitate a ultrasunetelor pentru fiecare dintre cele până la 10 flacoane, astfel încât rezultatele sonicației sunt uniforme și reproductibile. Efectele legate de poziție, care afectează băile de sonicare și sondarea unei singure probe, dispar, iar valorile de referință rămân comparabile între repetări.
- Integritatea probei: Tuburile rămân închise pe toată durata procesării, astfel încât proba nu poate fi contaminată, alterată sau volatilizată. Volumele mici pot fi analizate fără diluare, inclusiv sedimentele clinice prețioase care nu permit o etapă suplimentară de transfer.
- Controlul procesului: Amplitudinea este reglabilă între 20 și 100 %, modul de impuls între 0 și 100 %, iar sistemele suportă monitorizarea temperaturii, astfel încât tulpinile și proteinele termosensibile să rămână sub pragurile care pot provoca daune.
Aplicații tipice
- Analiza microbiomului și a conținutului intestinal: dispersarea probelor de Lactobacillus, Bifidobacterium și a probelor fecale înainte de însămânțare pe plăci sau secvențiere, astfel încât numărul de celule să nu fie redus din cauza aglomerărilor.
- Microbiologia alimentelor și a apei: dezagregarea flocoanelor din tampoane, soluții de clătire și medii de îmbogățire pentru determinarea precisă a numărului de colonii și a viabilității.
- Cercetarea în domeniul biofilmului: recuperarea celulelor de pe suporturi și suprafețe sub formă de suspensii de celule individuale, fără tratament enzimatic care ar elimina proteinele de suprafață.
- Diagnostic clinic: resuspendarea sputei, a puroiului și a eluaților din tampoane în condiții de izolare.
- Cultura celulară: separarea agregatelor de celule de mamifere, insecte și CHO înainte de numărare și repictare.
- Pregătirea întregului flux de lucru: același instrument care desface celulele la amplitudine redusă realizează distrugerea completă a celulelor la setări mai ridicate, astfel încât liza, extracția proteinelor și fragmentarea ADN-ului se desfășoară fără transferuri între eprubete.
Sonicator pentru plăci cu mai multe puțuri UIP400MTP pentru deaglomerarea cu randament ridicat a aglomerărilor celulare
Modelele de sonicatoare pentru microplăci UIP400MTP și UIP550MTP nu sunt destinate doar plăcilor cu mai multe godeuri, ci pot prelucra și suporturi de eprubete.
Găsiți sonicatorul potrivit pentru fluxul dvs. de lucru de dezintegrare
VialTweeter Multi-Tube Sonicator
Metoda preferată pentru dezintegrarea conținutului din flacoane sterile și sigilate. Acționat de procesorul UP200St de 200 de wați la 26 kHz cu reglare automată, VialTweeter transmite ultrasunete indirect prin pereții a până la 10 flacoane închise simultan, la o putere de până la 10 W pe flacon, pentru rezultate uniforme și reproductibile, fără contaminare încrucișată și fără pierderi de probă. Sonotrodul VialTweeter din titan este autoclavabil, iar amplitudinea și impulsul sunt reglabile și pot fi salvate, ceea ce reprezintă intervalul de control necesar unui protocol de dezagregare. Sonotrodul standard cu 10 poziții acceptă flacoane pentru autosampler, tuburi de microcentrifugă și tuburi Eppendorf sau Nunc de la 1 la 5 mL. Dispozitivul de prindere VialPress poate gestiona până la 5 recipiente mai mari, cu un diametru de până la 20 mm.
Sunt disponibile modele VialTweeter dedicate, cu un singur tub, pentru tuburile Falcon și pentru flacoane individuale, adaptate la dimensiunea recipientului. Dacă se demontează sonotrodul în bloc, unitatea centrală UP200St funcționează ca un sonicator cu sondă convențional pentru tratarea directă a probelor de dimensiuni mici până la medii.
Sonicatoare pentru microplăci
Extinderea la pregătirea probelor cu randament ridicat prin sonicare cu plăci cu mai multe godeuri: Pentru fluxurile de lucru bazate pe plăci, sonicatoarele pentru microplăci UIP400MTP și UIP550MTP extind sonicarea uniformă, fără contact, de la zece tuburi la o placă întreagă.
Aparatul UIP400MTP de 400 de wați este destinat tratării plăcilor standard de microtitrare și a celor cu mai multe godeuri, inclusiv a celor cu 96 de godeuri, oferind un control precis al amplitudinii, puterii și pulsării, precum și un cronometru, o sondă de temperatură și un sistem de răcire cu baie de apă. Îndepărtarea biofilmului și prelucrarea culturilor bacteriene sunt aplicații consacrate ale sonicatorului pentru microplăci UIP400MTP.
Modelul UIP550MTP, de 550 de wați, este opțiunea cea mai puternică – ideal pentru aplicații mai exigente.
Ambele sisteme de sonicare fără contact procesează în mod fiabil plăci cu 6, 12, 24, 48, 96 și 384 de godeuri, precum și suporturi pentru eprubete și vase Petri. Sonicatoarele pentru microplăci Hielscher funcționează cu orice placă standard, evitând consumabilele proprietare costisitoare. Datorită limitelor de temperatură programabile, sonicația se oprește automat la temperatura maximă a probei și se reia după răcire, protejând viabilitatea în cicluri repetate. Pregătirea inteligentă și fiabilă a probelor cu randament ridicat pentru rezultate repetabile.
Tabelul de mai jos vă oferă o imagine de ansamblu asupra capacității aproximative de procesare a sonicatoarelor noastre de laborator utilizate în științele vieții, genomică, proteomică și diagnosticare:
| Dispozitive recomandate | Volumul lotului | Debitul |
|---|---|---|
| VialTweeter Multi-Tube Sonicator | 0flacoane de 0,5 până la 1,5 ml | n.a. |
| Sonicator pentru plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP (440 wați) | plăci multi-godeu / microtitrare | n.a. |
| Sonicator pentru plăci cu mai multe godeuri UIP550MTP (550 wați) | plăci multi-godeu / microtitrare | n.a. |
| CupHorn cu ultrasunete | CupHorn pentru flacoane sau pahar | n.a. |
| UP100H – sonicator de tip sondă, de 100 de wați | 1 până la 500 ml | 10 până la 200 ml/min |
| UP200Ht, UP200St Modele de sonicatoare de tip sondă de 200 de wați | 10 până la 1000 ml | 20 până la 200 ml / min |
| UP400St – sonicator cu sondă de 400 de wați | 10 până la 2000 ml | 20 până la 400 ml / min |
| GDmini2 | reactor cu micro-debit ultrasonic steril | n.a. |
| Agitator cu sită cu ultrasunete | n.a. | n.a. |
Întrebări frecvente despre dezagregarea celulară cu ultrasunete
Care este diferența dintre dezagregarea celulară și liza celulară?
Dezagregarea, denumită și deaglomerare, separă celulele aglomerate într-o suspensie de celule individuale, celulele rămânând intacte și viabile. Liza rupe învelișul celular și eliberează conținutul intracelular. Ambele procese sunt determinate de forța de forfecare generată de cavitație, iar diferența constă în cantitatea de energie aplicată. Cu setări optimizate ale amplitudinii, impulsurilor și temperaturii, sonicația realizează dezagregarea sub pragul de liză.
De ce băile cu ultrasunete nu sunt potrivite pentru dezagregarea standardizată?
Băile furnizează doar o cantitate redusă de energie ultrasonică, ceea ce duce la o preparare incompletă, iar cavitația se dezvoltă foarte inegal în interiorul rezervorului, astfel încât fiecare probă este tratată diferit în funcție de poziția sa. Numărările microbiologice și studiile comparative depind de comparabilitate. Sonicatoarele fără contact, precum sonicatorul multitub VialTweeter, precum și modelele de sonicatoare pentru microplăci UIP400MTP și UIP550MTP, tratează toate recipientele în condiții ultrasonice ajustate, ceea ce îmbunătățește reproductibilitatea între replici.
Sonicarea poate deteriora celulele?
Da, dacă parametrii nu sunt controlați. Sonicația excesivă sau încălzirea necontrolată pot deteriora celulele, iar ADN-ul eliberat face ca probele să devină vâscoase și favorizează re-agregarea. De aceea, procesul trebuie dezvoltat în mod deliberat: amplitudinea moderată, ciclurile pulsate, răcirea și instrumentele cu temperatură limitată mențin tratamentul în zona de dezagregare a curbei.
Toate sonicatoarele digitale Hielscher oferă parametri controlabili cu precizie, senzori de temperatură conectabili, setări programabile și înregistrarea automată a datelor, pentru o pregătire fiabilă a probelor.
Este necesar ca proba să fie transferată într-un alt recipient?
Nu. Fiolele și plăcile sunt prelucrate în recipientele lor originale, închise. Sonicarea indirectă evită atât pierderile prin transfer, cât și contaminarea încrucișată asociată cu manipularea sondei.
Ce tipuri de flacoane poate prelucra VialTweeter?
Sonotrodul standard cu 10 poziții acceptă flacoane pentru autosampler, tuburi de microcentrifugă și tuburi Eppendorf sau Nunc cu capacitate de la 1 la 5 ml. Accesoriul VialPress poate găzdui până la 5 recipiente mai mari, cu diametrul de până la 20 mm. Sunt disponibile modele dedicate VialTweeter cu o singură eprubetă pentru tuburile Falcon și pentru formate personalizate cu o singură eprubetă sau de dimensiuni mai mari.
Pot să desfac și să lizez cu un singur instrument?
Da. Aceeași configurație care realizează dezagregarea la o amplitudine moderată produce distrugerea completă a celulelor la o amplitudine mai mare și o durată de expunere mai lungă, astfel încât suspensia de celule individuale și extracția ulterioară pot fi efectuate consecutiv, fără a fi necesară schimbarea platformelor.
Se utilizează sonicația în testele MBEC?
Sonicarea este o etapă consacrată și, în mare măsură, standard. În testul MBEC cu capac cu țepușe, după ce biofilmele sunt cultivate pe țepușe de polistiren și expuse la antibiotic, țepușele sunt transferate într-un mediu proaspăt și supuse agitării cu vortex plus sonicare pentru a desprinde și dezagrega celulele biofilmului aderente într-o suspensie planctonică înainte de diluarea în serie și numărarea celulelor viabile (MBEC se interpretează ca fiind cea mai mică concentrație care reduce numărul de celule recuperate cu ≥3 log10 față de biofilmul netratat). Sonicația îmbunătățește semnificativ calitatea dispersiei: eliberarea incompletă a celulelor încorporate din matricea EPS subestimează eradicarea și umflă valorile MBEC. Sonicarea țintită a godeurilor cu suport de pini de pe plăcile de testare cu ajutorul sonicatorului pentru microplăci UIP400MTP depășește punctele slabe tradiționale ale sonicării în baie – și anume distribuția inegală a energiei, încălzirea și riscul de contaminare cu aerosoli sau contaminare încrucișată.
Aflați cum sonicatorul fără contact pentru microplăci UIP400MTP facilitează realizarea testelor MBEC!
Se utilizează sonicația în testele de determinare a concentrației minime inhibitoare (CMI)?
Sonicația este aplicată în diferite fluxuri de lucru adiacente CMI pentru a îmbunătăți eficiența și reproductibilitatea:
- micobacteriologia, unde sputa și alte probe vâscoase sunt decontaminate și omogenizate în mod obișnuit, uneori prin sonicare, înainte de testarea sensibilității, iar inoculurile micobacteriene care formează aglomerări beneficiază de o scurtă dispersie pentru obținerea unor valori precise ale CMI;
- organisme cu tendință de agregare (de exemplu, streptococi, stafilococi sub formă de aglomerate), în cazul cărora microagregatele denaturează densitatea inoculului; și
- metode combinate de diagnostic, cum ar fi sonicația implantului și cultura de lichid, urmate de testarea sensibilității în cazul infecțiilor articulațiilor protetice (o aplicație de tip MBEC, nu o metodă clasică de determinare a concentrației minime inhibitoare (CMI)).
Literatură / Referințe
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Alege-ți propria farfurie! Sonicatorul pentru microplăci UIP550MTP descompune probele bacteriene în orice placă standard cu mai multe godeuri.
Modele Hielscher Multi-Sample Sonicator UIP400MTP pentru microplaci, VialTweeter și Cuphorn: preparare de probe de mare viteză și de mare capacitate