Protocol de utilizare a sonicatoarelor Hielscher Multi-Sample în biofilm și analiză proteomică

Utilizarea sonicatoarelor cu mai multe probe, cum ar fi VialTweeter Multi-Tube Sonicator și UIP400MTP Microplate Sonicator, eficientizează fluxurile de lucru de laborator pentru aplicații cu randament ridicat. Ambele dispozitive permit procesarea precisă și uniformă cu ultrasunete pe mai multe probe, minimizând variabilitatea și îmbunătățind reproductibilitatea. Acest lucru este deosebit de avantajos în experimentele care necesită liză consistentă a probelor, detașarea biofilmului, extracția proteinelor sau digestia proteolitică, unde metodele manuale sau cu o singură probă sunt mai puțin eficiente și predispuse la inconsecvențe.

Simplificați fluxurile de lucru cu sonicatoare cu mai multe eșantioane

UIP400MTP, de exemplu, permite tratarea simultană cu ultrasunete a godeurilor de microplăci, asigurând detașarea uniformă a biofilmelor sau a materialului celular. Între timp, VialTweeter oferă liză și omogenizare precisă a mai multor probe de tuburi fără contaminare încrucișată. Aceste sonicatoare reduc semnificativ timpii de procesare, îmbunătățesc reproductibilitatea experimentală și mențin o integritate ridicată a probei, făcându-i instrumente indispensabile în cercetarea microbiologiei, proteomicii și biologiei moleculare.
Mai jos este un protocol detaliat care exemplifică utilizarea modelelor Hielscher multi-sample sonicator, VialTweeter Multi-Tube Sonicator și Microplate Sonicator UIP400MTP, într-un studiu care implică formarea biofilmului de E. coli și analiza proteomică ulterioară.

Protocol: formarea biofilmului, detașarea și analiza proteomică folosind sonicatoare Hielscher cu mai multe probe

1. Pregătirea culturii bacteriene

• Cultura bacteriilor E. coli (tulpina W3110) la 30°C, o temperatură favorabilă formării biofilmului de E. coli, în mediu de bulion de triptonă (TB) care conține:
  – 10 g/L triptonă
  – 5 g/l NaCl
• Suplimentați cu antibiotice după cum este necesar pentru a asigura retenția plasmidei.
• Pentru studii de microscopie și activitate a promotorului, utilizați tulpina W3110 E. coli cu un raportor GFP îmbunătățit genomic (eGFP) sub controlul promotorului rplL.
• Utilizați plasmide raportoare GFP pentru diverși promotori (de exemplu, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) pentru a măsura activitățile promotorului.

2. Cultivarea și detașarea biofilmului

• Semănați 1,5 ml de cultură bacteriană diluată pe godeu într-o placă cu 12 godeuri (plăci CellStar cu 12 godeuri, Greiner Bio-One).
• Incubați pentru a permite formarea biofilmului.
• Îndepărtați cu atenție cultura planctonică (neaderentă).

– Se spală fiecare puț cu 500 μL PBS.
– Detașați celulele atașate prin sonicarea plăcii cu 12 godeuri în UIP400MTP sonicator de microplăci. UIP400MTP asigură o detașare uniformă prin furnizarea de energie ultrasonică constantă în toate puțurile.
– Setări de sonicare: 60% amplitudine, mod ciclu: 60 sec ON / 30 sec OFF.

3. Recoltarea și liza celulară

• Centrifugați celulele de biofilm detașate la 4.500 g timp de 5 minute.
• Spălați celulele peletizate cu PBS.
• Resuspendați celulele în 100 μL de lauroil sarcosinat de sodiu 2% (SLS) și incubați la 95°C timp de 15 minute.
• Sonicați folosind VialTweeter Multi-Tube Sonicator pentru a asigura o liză celulară completă.
  – Setări de sonicare: 100% amplitudine, 50 s ON / 10 s OFF timp total de funcționare de 10 minute; păstrați probele pe gheață.

4. Reducere și alchilare

• Se adaugă 5 mM Tris(2-carboxietil)fosfină (TCEP) pentru a reduce legăturile disulfurice și se incubează la 95°C timp de 15 minute.
• Proteine alchilate cu 10 mM iodoacetamidă timp de 30 de minute la 25°C.

5. Cuantificarea și digestia proteinelor

• Centrifugați lizate pentru a curăța resturile.
• Cuantificați conținutul total de proteine folosind kitul de testare a proteinelor Pierce BCA.
• Digerați 50 μg de proteine totale cu 1 μg tripsină într-o soluție care conține 2% SLS și 100 mM bicarbonat de amoniu.
• Incubați reacția de digestie peste noapte la 30°C.

6. Purificarea peptidelor

• Precipitați SLS prin adăugarea de acid trifluoroacetic (TFA) 1,5%, apoi centrifugați.
• Purificați peptidele folosind coloane de microspin C18.
• Peptide purificate uscate și resuspendate în 0,1% TFA.

7. Cromatografie lichidă-spectrometrie de masă (LC-MS/MS)

• Analizați peptidele pe un spectrometru de masă Q-Exactive Plus cuplat cu un nanosistem Ultimate 3000 RSLC.
• Separați peptidele folosind o coloană HPLC în fază inversă (75 μm × 42 cm) ambalată cu rășină C18 (2,4 μm).
• Aplicați un gradient de la 2% la 35% solvent B (acetonitril cu 0,15% acid formic) timp de 140 de minute.
• Obțineți date folosind scanări MS de înaltă rezoluție, urmate de scanări MS/MS în tandem ale celor mai intensi 10 ioni.

8. Analiza datelor

• Procesați datele brute LC-MS folosind software-ul Progenesis.
• Exportați fișiere .mgf și analizați-le cu MASCOT.
• Efectuați cuantificarea peptidelor folosind SafeQuant pentru controlul calității și ajustarea în caz de descoperire falsă.
• Efectuați toate experimentele în duplicate sau triplu exemplare pentru a asigura reproductibilitatea.

Sonicatoare cu mai multe mostre pentru pregătirea probelor de mare randament

Modelele de sonicator cu mai multe probe VialTweeter și UIP400MTP îmbunătățesc semnificativ precizia și eficiența fluxurilor de lucru experimentale, în special în cercetarea biofilmului și proteomică. Capacitatea lor de a procesa mai multe mostre în mod uniform asigură o capacitate de debit ridicată, fără a compromite calitatea datelor. Aceste beneficii, combinate cu fluxurile de lucru simplificate prezentate mai sus, fac din sonicatoarele Hielscher instrumente esențiale pentru cercetarea biologică modernă.

Proiectare, fabricație și consultanță – Calitate Made in Germany

Hielscher ultrasonicators sunt bine-cunoscute pentru cele mai înalte standarde de calitate și design. Robustețea și funcționarea ușoară permit integrarea fără probleme a ultrasonicators noastre în instalații industriale. Condiții dure și medii solicitante sunt ușor de manipulat de ultrasonicators Hielscher.

Hielscher Ultrasonics este o companie certificată ISO și pune un accent deosebit pe ultrasonicators de înaltă performanță cu tehnologie de ultimă oră și ușurință în utilizare. Desigur, ultrasonicators Hielscher sunt conforme CE și îndeplinesc cerințele UL, CSA și RoHs.