Protocol de utilizare a sonicatoarelor Hielscher pentru probe multiple în analiza biofilmelor și analiza proteomică

Utilizarea sonicatoarelor pentru probe multiple, precum sonicatorul pentru tuburi multiple VialTweeter și sonicatorul pentru microplăci UIP400MTP, eficientizează fluxurile de lucru din laborator pentru aplicațiile cu capacitate mare de procesare a probelor. Ambele dispozitive permit procesarea ultrasonică precisă și uniformă a mai multor probe, minimizând variabilitatea și îmbunătățind reproductibilitatea. Acest lucru este deosebit de avantajos în experimentele care necesită liza constantă a probelor, detașarea biofilmului, extracția proteinelor sau digestia proteolitică, unde metodele manuale sau cele pentru o singură probă sunt mai puțin eficiente și predispuse la inconsecvență.

Eficientizați fluxurile de lucru cu sonicatoare pentru probe multiple

UIP400MTP, de exemplu, permite tratarea ultrasonică simultană a godeurilor microplăcilor, asigurând detașarea uniformă a biofilmelor sau a materialului celular. Totodată, VialTweeter oferă liza și omogenizarea precisă a mai multor probe din tuburi, fără contaminare încrucișată. Aceste sonicatoare reduc semnificativ timpii de procesare, îmbunătățesc reproductibilitatea experimentală și mențin o integritate ridicată a probelor, ceea ce le face instrumente indispensabile în cercetarea din microbiologie, proteomică și biologie moleculară.
Mai jos este prezentat un protocol detaliat care exemplifică utilizarea modelelor de sonicatoare Hielscher pentru probe multiple, sonicatorul pentru tuburi multiple VialTweeter și sonicatorul pentru microplăci UIP400MTP, într-un studiu privind formarea biofilmului de E. coli și analiza proteomică ulterioară.

Protocol: formarea biofilmului, detașarea acestuia și analiza proteomică cu ajutorul sonicatoarelor Hielscher pentru probe multiple

1. Pregătirea culturii bacteriene

• Cultivați bacteriile E. coli (tulpina W3110) la 30°C, o temperatură favorabilă formării biofilmului de E. coli, în mediu bulion cu triptonă (TB) care conține:
  – 10 g/L triptonă
  – 5 g/L NaCl
• Suplimentați cu antibiotice, după caz, pentru a asigura menținerea plasmidelor.
• Pentru studiile de microscopie și de activitate a promotorilor, utilizați tulpina E. coli W3110 cu un reporter genomic GFP îmbunătățit (eGFP) aflat sub controlul promotorului rplL.
• Utilizați plasmide reporter GFP pentru diverși promotori (de ex., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) pentru a măsura activitățile promotorilor.

2. Cultivarea și detașarea biofilmului

• Însămânțați 1,5 mL de cultură bacteriană diluată per godeu într-o placă cu 12 godeuri (plăci CellStar cu 12 godeuri, Greiner Bio-One).
• Incubați pentru a permite formarea biofilmului.
• Îndepărtați cu atenție cultura planctonică (neaderentă).

– Spălați fiecare godeu cu 500 µL PBS.
– Detașați celulele atașate prin sonicarea plăcii cu 12 godeuri în sonicatorul pentru microplăci UIP400MTP. UIP400MTP asigură o detașare uniformă prin furnizarea unei energii ultrasonice constante în toate godeurile.
– Setări de sonicare: amplitudine 60%, mod ciclic: 60 sec pornit / 30 sec oprit.

3. Recoltarea și liza celulelor

• Centrifugați celulele de biofilm detașate la 4.500 g timp de 5 minute.
• Spălați celulele sedimentate cu PBS.
• Resuspendați celulele în 100 µL de lauroil sarcozinat de sodiu (SLS) 2% și incubați la 95°C timp de 15 minute.
• Sonicați folosind sonicatorul pentru tuburi multiple VialTweeter pentru a asigura liza completă a celulelor.
  – Setări de sonicare: amplitudine 100%, 50 s pornit / 10 s oprit, pentru un timp total de funcționare de 10 min; mențineți probele pe gheață.

4. Reducerea și alchilarea

• Adăugați 5 mM Tris(2-carboxietil)fosfină (TCEP) pentru a reduce legăturile disulfidice și incubați la 95°C timp de 15 minute.
• Alchilați proteinele cu 10 mM iodoacetamidă timp de 30 de minute la 25°C.

5. Cuantificarea și digestia proteinelor

• Centrifugați lizatele pentru a îndepărta resturile.
• Cuantificați conținutul total de proteine folosind Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Digerați 50 µg de proteină totală cu 1 µg de tripsină într-o soluție care conține 2% SLS și 100 mM bicarbonat de amoniu.
• Incubați reacția de digestie peste noapte la 30°C.

6. Purificarea peptidelor

• Precipitați SLS prin adăugarea de acid trifluoroacetic (TFA) 1,5%, apoi centrifugați.
• Purificați peptidele folosind coloane microspin C18.
• Uscați peptidele purificate și resuspendați-le în TFA 0,1%.

7. Cromatografie de lichide cuplată cu spectrometrie de masă (LC-MS/MS)

• Analizați peptidele pe un spectrometru de masă Q-Exactive Plus cuplat cu un sistem Ultimate 3000 RSLC nano.
• Separați peptidele folosind o coloană HPLC cu fază inversă (75 µm × 42 cm) umplută cu rășină C18 (2,4 µm).
• Aplicați un gradient de la 2% la 35% solvent B (acetonitril cu 0,15% acid formic) pe parcursul a 140 de minute.
• Achiziționați datele folosind scanări MS de înaltă rezoluție, urmate de scanări MS/MS în tandem ale celor mai intenși 10 ioni.

8. Analiza datelor

• Procesați datele brute LC-MS folosind software-ul Progenesis.
• Exportați fișierele .mgf și analizați-le cu MASCOT.
• Efectuați cuantificarea peptidelor folosind SafeQuant pentru controlul calității și ajustarea ratei de descoperiri false.
• Efectuați toate experimentele în duplicat sau triplicat pentru a asigura reproductibilitatea.

Sonicatoare pentru probe multiple pentru pregătirea probelor cu capacitate mare de procesare

Modelele de sonicatoare pentru probe multiple VialTweeter și UIP400MTP îmbunătățesc semnificativ precizia și eficiența fluxurilor de lucru experimentale, în special în cercetarea biofilmelor și în proteomică. Capacitatea lor de a procesa uniform mai multe probe asigură o capacitate mare de procesare a probelor fără a compromite calitatea datelor. Aceste avantaje, combinate cu fluxurile de lucru eficientizate descrise mai sus, fac din sonicatoarele Hielscher pentru probe multiple instrumente esențiale pentru cercetarea biologică modernă.

Proiectare, producție și consultanță – calitate Made in Germany

Ultrasonicatoarele Hielscher sunt bine-cunoscute pentru calitatea și standardele lor de design de cel mai înalt nivel. Robustețea și operarea ușoară permit integrarea fără probleme a ultrasonicatoarelor noastre în instalațiile industriale. Condițiile dificile și mediile solicitante sunt gestionate cu ușurință de ultrasonicatoarele Hielscher.

Hielscher Ultrasonics este o companie certificată ISO și pune un accent deosebit pe ultrasonicatoare de înaltă performanță, dotate cu tehnologie de ultimă generație și ușor de utilizat. Desigur, ultrasonicatoarele Hielscher sunt conforme CE și îndeplinesc cerințele UL, CSA și RoHs.