Deparafinarea și extracția proteinelor din FFPE

Facilitați extracția proteinelor din secțiuni de țesut fixat în formalină și inclus în parafină (FFPE) printr-o combinație optimizată de deparafinare, solubilizare și sonicare cu un ultrasonicator multi-tub VialTweeter. Acest protocol susține analizele proteomice ulterioare bazate pe spectrometrie de masă și este compatibil cu fluxurile de lucru de purificare SP3 și digestie enzimatică.

Acest SOP este destinat personalului de laborator implicat în analiza proteomică a probelor de țesut FFPE prin sonicare de înaltă performanță. Este optimizat pentru până la zece probe FFPE procesate în paralel cu sonicatorul multi-tub VialTweeter.

Protocol: extracția proteinelor din probe FFPE cu ajutorul VialTweeter

Materiale și reactivi

Reactivi

• Xilen (grad histologic)
• Etanol (absolut 96%)
• Tampon de liză:

6 M clorhidrat de guanidină
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (tris(2-carboxietil)fosfină)
40 mM CAA (2-cloroacetamidă)

• Inhibitor de protează (opțional; de ex. cOmplete™ mini EDTA-free)

Echipamente

• Ultrasonicator multi-tub VialTweeter
• Tuburi de microcentrifugă cu legare redusă (low-binding) de 1,5 mL sau 2,0 mL
• Bloc de încălzire sau incubator (setări de 95°C și 80°C)
• Microcentrifugă
• Termomixer (opțional, dar recomandat)

Cantitatea de probă

• 1–2 secțiuni de țesut FFPE cu grosimea de 10 µm per probă (adică per flacon)

SAU

• Un total de ~100 µg de țesut per probă (adică per flacon)

Notă: utilizați lame noi pentru microtomie, pentru a reduce la minimum contaminarea cu resturi de parafină.

Procedură

1. Deparafinare
   1. Transferați secțiunile FFPE în tuburi de microcentrifugă cu legare redusă.
   2. Adăugați 1 mL de xilen și agitați scurt pe vortex.
   3. Incubați 10 minute la temperatura camerei.
   4. Centrifugați la 14.000 × g timp de 2 minute; îndepărtați supernatantul.
   5. Repetați încă o dată spălarea cu xilen (pașii 2–4).
   6. Spălați peletul cu 1 mL de etanol 96%, agitați pe vortex, apoi centrifugați la 14.000 × g timp de 2 minute. Îndepărtați supernatantul.
   7. Repetați încă o dată spălarea cu etanol (în total 2 spălări cu etanol).
   8. Uscați peletul la aer timp de 10 minute la temperatura camerei, cu capacele deschise, pentru a evapora etanolul rezidual.
2. Extracția proteinelor și sonicarea
   1. Adăugați 200 µL de tampon de liză la fiecare pelet uscat.

      Notă: deși sonicatorul permite volume de până la 1 mL, 200 µL este volumul optim pentru procesarea ulterioară.

   2. Amestecați prin vortexare sau pipetare ușoară.
3. Prima incubare termică
   1. Incubați tuburile la 95 °C timp de 30 min, cu agitare la 400 rpm, folosind un termomixer sau un bloc de încălzire.
   2. Lăsați probele să se răcească la temperatura camerei timp de 5 min.
4. Prima sonicare cu VialTweeter
   1. Introduceți tuburile în VialTweeter.
   2. Setați VialTweeter UP200St la valorile de mai jos și sonicați.
Setările sonicatorului
• Setați amplitudinea (A) la 100%
• Setați modul de pulsație (C) la 100%
• Ceas de perioadă: pornit
• Timp ON: 60s
• Timp OFF: 30s
• Valoare limită: 15 min (corespunde la 10 cicluri)
(Notă de calcul: (60 s ON + 30 s OFF) × 10 cicluri = 900 s = 15 min)
5. A doua incubare termică
   Scoateți tuburile și incubați-le din nou la 95 °C timp de 15 min, la 400 rpm.
6. A doua sonicare
   Repetați sonicarea în VialTweeter cu aceleași setări (ca mai sus) pentru încă 10 cicluri (15 min în total).
7. Clarificarea lizatului
   1. Centrifugați probele la 13.000 × g timp de 10 min la 23°C (temperatura camerei).
   2. Colectați cu atenție supernatantul într-un tub Eppendorf Safe-lock nou de 2,0 mL. Evitați perturbarea peletului.
8. Procesarea ulterioară
   Lizatul este acum pregătit pentru purificarea SP3 și digestia enzimatică.

Note și bune practici

1. Riscul de supraîncălzire în timpul sonicării este atenuat prin ciclarea programată ON/OFF.
2. Evitați vortexarea după sonicare, pentru a preveni agregarea proteinelor.

Eliminarea deșeurilor și siguranța

Tabelul de mai jos vă oferă o indicație privind capacitatea aproximativă de procesare a ultrasonicatoarelor noastre de laborator: