Deparafinizare și extracție de proteine din FFPE

Facilitați extragerea proteinelor din secțiunile de țesut încorporate în parafină fixate cu formol (FFPE) folosind o combinație optimizată de deparafinare, solubilizare și sonicare cu un ultrasunet cu mai multe tuburi VialTweeter. Acest protocol acceptă proteomica bazată pe spectrometrie de masă în aval și este compatibil cu fluxurile de lucru de curățare și digestie enzimatică SP3.

Acest SOP este destinat personalului de laborator implicat în analiza proteomică a probelor de țesut FFPE folosind sonicare de înaltă performanță. Este optimizat pentru până la zece probe FFPE procesate în paralel folosind VialTweeter Multi-Tube Sonicator.

Protocol: Extragerea proteinelor din probe FFPE folosind VialTweeter

Materiale și reactivi

Reactivi

• Xilenă (grad histologic)
• Etanol (absolut 96%)
• Tampon de liză:

6 M clorhidrat de guanidină
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-carboxietil)fosfină)
40 mM CAA (2-cloroacetamidă)

• Inhibitor de protează (opțional; de exemplu, cOmplete™ mini fără EDTA)

Echipament

• Ultrasunete cu mai multe tuburi VialTweeter
• Tuburi de microcentrifugă cu legare redusă de 1,5 ml sau 2,0 ml
• Bloc termic sau incubator (setări 95°C și 80°C)
• Microcentrifugă
• Termomixer (opțional, dar recomandat)

Exemplu de intrare

• 1-2 secțiuni de țesut FFPE cu grosimea de 10 μm pe probă (adică pe flacon)

sau

• Un total de ~100 μg de țesut per probă (adică per flacon)

Notă: Utilizați lame proaspete pentru microtomie pentru a minimiza contaminarea cu resturi de parafină.

Procedură

1. deparafinizare
   1. Transferați secțiunile FFPE în tuburi de microcentrifugă cu legare scăzută.
   2. Adăugați 1 ml de xilenă, vortex scurt.
   3. Incubați 10 minute la temperatura camerei.
   4. Centrifugați la 14.000 × g timp de 2 minute; renunțați la supranatant.
   5. Repetați spălarea cu xilenă încă o dată (pașii 2-4).
   6. Spălați peletele cu 1 ml de etanol 96%, vortex, apoi centrifugați la 14.000 × g timp de 2 minute. Aruncați supranatantul.
   7. Repetați spălarea cu etanol încă o dată (total de 2 spălări cu etanol).
   8. Uscați peletele la aer timp de 10 minute la temperatura camerei cu capacele deschise pentru a evapora etanolul rezidual.
2. Extracția și sonicarea proteinelor
   1. Adăugați 200 μL tampon de liză la fiecare peletă uscată.
      Notă: Deși sonicatorul găzduiește până la 1 ml, 200 μl este optim pentru prelucrarea în aval.

   2. Amestecați prin vortex sau pipetare ușoară.
3. Prima incubație termică
   1. Incubați tuburile la 95 °C timp de 30 min, cu agitare la 400 rpm folosind un termomixer sau un bloc termic.
   2. Lăsați probele să se răcească la temperatura camerei timp de 5 minute.
4. Prima sonicare cu VialTweeter
   1. Așezați tuburile în VialTweeter.
   2. Setați VialTweeter UP200St la valorile de mai jos și sonicați.
Setări Sonicator
• Setați amplitudinea (A) la 100%
• Setați modul de pulsație (C) la 100%
• Ceas de epocă: Pornit
• La timp: 60 de secunde
• Timp de oprire: 30s
• Valoare limită: 15 min (corespunde la 10 cicluri)
(Notă de calcul: (60 s Pornit + 30 s Oprit) × 10 cicluri = 900 s = 15 min)
5. A doua incubație termică
   Scoateți tuburile și incubați din nou la 95 °C timp de 15 min, 400 rpm.
6. A doua sonicare
   Repetați sonicarea pe VialTweeter folosind aceleași setări (ca mai sus) pentru încă 10 cicluri (15 minute în total).
7. Clarificarea lizatului
   1. Se centrifughează probele la 13.000 × g timp de 10 minute la 23°C (temperatura camerei).
   2. Colectați cu grijă supernatantul într-un nou tub Eppendorf Safe-lock de 2,0 ml. Evitați deranjarea peletei.
8. Procesare în aval
   Lizatul este acum gata pentru curățarea SP3 și digestia enzimatică.

Note și bune practici

1. Riscul de supraîncălzire în timpul sonicării este atenuat prin ciclul programat ON/OFF.
2. Evitați vortexul post-sonicare pentru a preveni agregarea proteinelor.

Eliminarea deșeurilor și siguranța

Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității aproximative de procesare a ultrasonicators noastre de dimensiuni de laborator: