Pregătirea probelor FFPE cu capacitate mare de procesare: extracția proteinelor și forfecarea acizilor nucleici
Cu ultrasonicatorul cu capacitate mare de procesare UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics răspunde provocărilor pregătirii țesuturilor fixate în formalină și incluse în parafină (FFPE). Aflați cum procesează ultrasonicarea probele FFPE în număr mare pentru deparafinarea FFPE, liza țesuturilor, omogenizare, extracția proteinelor și forfecarea ADN/ARN! Profitați de pregătirea cu ultrasunete a țesuturilor FFPE – procesarea unui număr mare de probe în plăci cu godeuri multiple! Obțineți probe de înaltă calitate și un număr mare de probe pentru rezultate de cercetare fiabile! Și nu în ultimul rând, economisiți timp și bani!
Pregătirea probelor FFPE facilitată de sonicarea cu capacitate mare de procesare
Fixarea în formalină și includerea în parafină (FFPE) reprezintă cea mai comună metodă de conservare și arhivare a țesuturilor solide. Extracția biomoleculelor din probele de țesut FFPE prezintă adesea provocări semnificative din cauza calității probelor stocate. Aceste probe, care reprezintă resurse neprețuite în biologia moleculară și în cercetarea clinică, oferă o sursă bogată de informații biologice pentru studii retrospective și pentru validarea biomarkerilor de diagnostic. Cu toate acestea, procesul de fixare în formalină și includere în parafină, deși conservă arhitectura și morfologia țesutului, complică extracția acizilor nucleici și a proteinelor de înaltă calitate. Formalina induce reticularea acizilor nucleici și a proteinelor, ducând la fragmentare moleculară și modificări chimice. Aflați cum ultrasonicatorul cu capacitate mare de procesare UIP400MTP depășește provocările pregătirii probelor FFPE!
Ultrasonicator pentru pregătirea eficientă a probelor FFPE
- Flux de lucru ușor de utilizat: procese simplificate, prietenoase cu utilizatorul.
- Deparafinare, extracția proteinelor, forfecarea ADN / ARN
- Procesare rapidă cu capacitate mare: manipularea eficientă a plăcilor cu godeuri multiple.
- Deparafinare eficientă: solubilizare îmbunătățită a proteinelor.
- Solvenți netoxici: evită utilizarea solvenților organici nocivi, precum xilenul.
Sonicatorul cu capacitate mare de procesare UIP400MTP pentru procesarea cu capacitate mare a probelor FFPE în plăci cu godeuri multiple
Progrese în tehnicile de extracție a proteinelor din țesutul FFPE
Hielscher Ultrasonics răspunde provocărilor din pregătirea probelor FFPE cu capacitate mare de procesare. Sonicarea folosește unde ultrasonice pentru a genera vibrații mecanice și cavitație focalizată, dezintegrând eficient structurile celulare și îmbunătățind solubilizarea biomoleculelor. Această tehnică a câștigat popularitate datorită capacității sale de a crește eficiența și randamentul extracției acizilor nucleici și a proteinelor din țesuturile FFPE, precum și ale forfecării ADN-ului și ARN-ului pentru pregătirea bibliotecilor. Este foarte important de subliniat că ultrasonicarea cu sonicatorul pentru plăci cu godeuri multiple UIP400MTP menține integritatea acestor biomolecule pentru aplicațiile ulterioare.
Forfecarea acizilor nucleici prin ultrasonicare cu capacitate mare de procesare
Ultrasonicatorul pentru plăci cu godeuri multiple UIP400MTP, destinat utilizării în medii cu capacitate mare de procesare, duce pregătirea probelor FFPE la un nou nivel. Această metodă de sonicare în plăci cu godeuri multiple oferă o soluție eficientă și fiabilă pentru procesarea simultană a mai multor probe. Ea facilitează extracția rapidă și reproductibilă a ADN-ului, ARN-ului și proteinelor, care sunt esențiale pentru diverse tehnici analitice, inclusiv secvențierea de nouă generație (NGS), PCR cantitativ și analizele proteomice. Optimizarea parametrilor de sonicare, precum amplitudinea, durata și temperatura, îmbunătățește suplimentar calitatea și cantitatea biomoleculelor extrase.
Sonicatorul UIP400MTP pentru plăci cu godeuri multiple oferă avantaje semnificative pentru fragmentarea și forfecarea ADN-ului și ARN-ului din țesutul FFPE. Una dintre caracteristicile remarcabile ale acestui sistem este capacitatea sa de a obține un interval îngust al dimensiunilor fragmentelor de ADN și ARN, oferind o reglare precisă a intensității sonicării pentru a obține fragmente scurte de 150–200 de perechi de baze (bp) sau fragmente mai lungi de 15–20 de kiloperechi de baze (kbp). Această versatilitate face ca UIP400MTP să fie indispensabil atât pentru aplicațiile de secvențiere cu citiri scurte, cât și pentru cele cu citiri lungi, asigurând rezultate de înaltă calitate pentru secvențierea de nouă generație (NGS) și secvențierea întregului genom (WGS). Controlul său precis asupra dimensiunii fragmentelor este crucial pentru cercetătorii din toate domeniile genomicii, deoarece permite pregătirea probelor conform specificațiilor.
Contactați-ne pentru soluții avansate pentru țesutul FFPE
Descoperiți sonicatorul pentru plăci cu godeuri multiple UIP400MTP pentru recuperarea eficientă a biomoleculelor din probele FFPE, menținând integritatea acizilor nucleici și a proteinelor extrase și asigurând reproductibilitatea rezultatelor. Această tehnologie se integrează perfect cu alte fluxuri de lucru preparative și analitice, eficientizând și îmbunătățind investigațiile moleculare care utilizează arhivele de țesuturi FFPE.
Fixatorii și efectele lor
Fixarea este o etapă crucială în pregătirea probelor, care conservă structurile celulare, oprește reacțiile biochimice și previne degradarea. Se utilizează diverși fixatori, în funcție de cerințele experimentale specifice. Cei mai comuni doi fixatori sunt formaldehida și paraformaldehida, care reticulează proteinele și acizii nucleici, conservând morfologia și antigenicitatea celulelor și țesuturilor. Alți fixatori, precum etanolul, metanolul și glutaraldehida, sunt utilizați pentru aplicații specifice.
Fixatorii pe bază de formaldehidă și paraformaldehidă formează punți de metilen între grupările amino, ducând la reticularea proteinelor. Acest proces imobilizează eficient componentele celulare, conservându-le integritatea în etapele ulterioare de analiză. Efectele acestor fixatori pot fi influențate de factori precum concentrația, pH-ul și temperatura, iar optimizarea acestor parametri este crucială pentru a asigura conservarea optimă a structurilor celulare.
Avantajele pregătirii FFPE cu ultrasunete
Ultrasonicarea este o tehnică puternică pentru dezintegrarea celulelor și țesuturilor fixate, care depășește tehnicile convenționale. Ea oferă mai multe avantaje notabile față de metodele tradiționale de liză:
- Viteză și eficiență: Liza cu ultrasunete asigură dezintegrarea rapidă a celulelor și țesuturilor, reducând semnificativ timpul de procesare în comparație cu metodele de liză mecanice sau chimice. Undele sonore de înaltă frecvență generate de sonotroda ultrasonică creează forțe mecanice de forfecare, provocând dezintegrarea structurilor celulare fixate. Această dezintegrare rapidă și eficientă le permite cercetătorilor să proceseze volume mari de probe într-un interval scurt de timp.
- Delicată și reglabilă: Liza cu ultrasunete oferă un mecanism de dezintegrare delicat, care minimizează deteriorarea biomoleculelor sensibile, precum proteinele, acizii nucleici și enzimele. Spre deosebire de metodele mecanice care generează căldură sau forțe de forfecare excesive, liza cu ultrasunete utilizează cavitația controlată pentru a dezintegra celulele, conservând în același timp integritatea și funcționalitatea componentelor intracelulare.
- Versatilitate: Liza cu ultrasunete poate fi aplicată în cazul diverșilor fixatori, permițând cercetătorilor să lucreze cu o gamă largă de probe fixate. Fie că se utilizează formaldehidă, paraformaldehidă sau fixatori alternativi, liza cu ultrasunete asigură constant o dezintegrare eficientă, garantând recuperarea optimă a componentelor celulare.
- Randament și calitate ridicate: Liza cu ultrasunete facilitează randamente ridicate de componente celulare intacte datorită capacității sale de a dezintegra uniform celulele și țesuturile fixate. Acest lucru permite ca aplicațiile ulterioare, precum analiza proteinelor, extracția acizilor nucleici și testele enzimatice, să ofere rezultate fiabile și reproductibile.
- Compatibilitate cu automatizarea: Liza cu ultrasunete poate fi integrată cu ușurință în sisteme automatizate, permițând procesarea probelor cu capacitate mare. Această compatibilitate le permite cercetătorilor să își eficientizeze fluxul de lucru și să își crească productivitatea, în special în studiile la scară largă.
Sonicatorul pentru plăci cu 96 de godeuri UIP400MTP pentru sonicarea plăcilor de microtitrare și a plăcilor cu godeuri multiple
Liza cu ultrasunete a revoluționat dezintegrarea celulelor și țesuturilor fixate, oferind numeroase avantaje față de metodele tradiționale de liză. Viteza, eficiența, selectivitatea, versatilitatea, randamentul ridicat și compatibilitatea cu automatizarea o transformă într-un instrument indispensabil în cercetarea din biologia moleculară și biotehnologie. Oferind atât sonicatoare fără contact, cât și sonicatoare cu sondă, Hielscher Ultrasonics vă pune la dispoziție cel mai potrivit omogenizator cu ultrasunete pentru aplicația dumneavoastră din domeniul științelor vieții. Fie că doriți să procesați probe individuale, mai multe probe sau un număr foarte mare de probe simultan, vă vom oferi cel mai bun sonicator, adaptat cerințelor dumneavoastră de cercetare și diagnostic.
Citiți mai multe despre sonicatoarele fără contact Hielscher pentru pregătirea mai multor probe și pregătirea probelor cu capacitate mare de procesare!
- investiție unică
- folosiți propriile dumneavoastră consumabile
- fără costuri recurente pentru accesorii și consumabile proprietare
- capacitate mare de procesare
- control precis
- tehnologie de ultimă generație
- fiabilitate și robustețe
- control al procesului reglabil și precis
- calitate industrială: poate funcționa continuu 24/7
- operare ușoară și sigură
- întreținere redusă
Citiți mai multe despre aplicațiile sonicatoarelor în științele vieții!
Sonicator pentru plăci UIP400MTP pentru orice plăci cu 96 de godeuri, plăci de microtitrare și plăci cu godeuri multiple.
Proiectare, fabricație și consultanță – calitate Made in Germany
Ultrasonicatoarele Hielscher sunt bine cunoscute pentru standardele lor de cea mai înaltă calitate și de design. Robustețea și operarea ușoară permit integrarea fără probleme a ultrasonicatoarelor noastre în instalațiile industriale. Condițiile dificile și mediile solicitante sunt gestionate cu ușurință de ultrasonicatoarele Hielscher.
Hielscher Ultrasonics este o companie certificată ISO și pune un accent deosebit pe ultrasonicatoare de înaltă performanță, care îmbină tehnologia de ultimă generație cu ușurința în utilizare. Desigur, ultrasonicatoarele Hielscher sunt conforme CE și îndeplinesc cerințele UL, CSA și RoHs.
Contactați-ne! / Întrebați-ne!
Ultrasonicatorul UIP400MTP: Pregătirea probelor FFPE cu capacitate mare de procesare în plăci cu godeuri multiple
Întrebări frecvente
Mai jos răspundem la întrebările frecvente relevante pentru pregătirea țesuturilor FFPE și ultrasonicarea probelor FFPE.
Cum se pregătește țesutul FFPE?
Etapele pregătirii țesutului FFPE: Manipularea și procesarea meticuloasă a țesutului proaspăt sunt critice pentru obținerea unor probe FFPE de înaltă calitate. Asigurarea conservării arhitecturii celulare, a acizilor nucleici și a proteinelor este esențială pentru o analiză ulterioară precisă. Fiecare etapă – de la recoltare la includere – necesită precizie pentru a menține integritatea probei pentru diverse analize, inclusiv examinarea histologică, imunohistochimia și studiile moleculare. Executat corect, acest proces de fixare și includere asigură faptul că țesutul conservat reflectă cu acuratețe starea in vivo, permițând obținerea unor rezultate fiabile în diagnostic și cercetare.
Vă prezentăm pe rând cele 6 etape majore ale procesului de includere a probelor de țesut FFPE.
- Recoltarea țesutului
Biopsiile de la mamifere vii și culturile de țesut sunt ambele surse viabile pentru obținerea de țesut proaspăt pentru pregătirea probelor FFPE.
Este important să utilizați o tehnică aseptică: folosiți instrumente și mănuși sterile pentru a evita contaminarea. În mod ideal, recoltați țesuturile într-un mediu steril, cum ar fi o sală de operație sau o hotă cu flux laminar.
Deoarece specimenul este foarte fragil, manipularea sa atentă este esențială: reduceți la minimum întârzierile în procesare și începeți imediat procesarea ulterioară a țesutului după excizie. Acest lucru este crucial pentru a preveni autoliza și degradarea. Păstrați țesutul la temperatura camerei; evitați congelarea, deoarece aceasta poate provoca formarea de cristale de gheață și deteriorarea țesutului. - Fixarea țesutului
Mai întâi, țesutul este tratat cu o soluție fixatoare: utilizați formalină tamponată neutră 10% (NBF), care echivalează cu formaldehidă 4% în apă, tamponată la un pH neutru.
Scufundați complet țesutul în formalină. Asigurați un raport de volum fixator/țesut de cel puțin 10:1. Durata fixării variază de obicei între 6 și 24 de ore, în funcție de tipul și dimensiunea țesutului. Este important ca fixatorul să poată pătrunde complet în țesut. Totuși, suprafixarea poate duce la o reticulare care complică recuperarea antigenică, în timp ce subfixarea poate duce la o conservare slabă a țesutului. - Tăierea țesutului
În al doilea rând, tăiați țesutul la o grosime de aproximativ 3–5 mm pentru a permite pătrunderea adecvată a fixatorului. Asigurați orientarea corectă a țesutului pentru a surprinde structurile histologice relevante. Acest lucru facilitează procesul de extracție atunci când țesutul este utilizat ulterior pentru analiză. - Procesarea probei fixate
Acum, țesutul fixat trebuie deshidratat: după fixare, țesutul trebuie deshidratat pentru a asigura pătrunderea completă a cerii de parafină. Treceți țesutul printr-o serie gradată de etanol (70%, 80%, 90% și 100%) pentru a îndepărta apa.
Clarificarea cu xilen: ceara de parafină este insolubilă în apă, dar solubilă în xilen. Prin urmare, apa din țesut trebuie înlocuită cu xilen. Totuși, xilenul însuși este insolubil în apă, dar solubil în alcool, ceea ce necesită o etapă intermediară în care apa este mai întâi înlocuită cu alcool. Imersați țesutul în xilen sau într-un substitut de xilen pentru a îndepărta etanolul și a pregăti țesutul pentru infiltrarea cu parafină.
Infiltrarea cu parafină: includeți țesutul în ceară de parafină topită, asigurând infiltrarea completă. Această etapă implică de obicei mai multe schimbări ale parafinei pentru a asigura o impregnare completă. - Includerea țesutului
În această etapă, țesutul este turnat într-un bloc tisular: așezați țesutul într-o matriță cu orientarea dorită și turnați parafină topită peste el. Lăsați parafina să se solidifice prin răcire la temperatura camerei sau pe o placă rece. - Secționarea și montarea
Microtomia: pentru a secționa țesutul inclus, utilizați un microtom pentru a tăia secțiuni subțiri (de obicei 4–5 micrometri) din blocul de parafină. Apoi proba este montată, prin plasarea secțiunilor pe lame de sticlă pentru colorarea și analiza microscopică ulterioare.
În final, verificați calitatea histologiei: evaluați primele secțiuni la microscop pentru a vă asigura că fixarea și procesarea sunt corespunzătoare. Ajustați protocoalele după cum este necesar, în funcție de tipul de țesut și de calitatea observată.
Țesuturile FFPE pot fi utilizate pentru recuperarea ARN-ului, ADN-ului și proteinelor, precum și pentru descoperirea semnelor de cancer sau ale altor boli. Ele pot fi stocate ani de zile și reprezintă o parte esențială a modului în care cercetătorii și medicii valorifică probele de țesut pentru diagnostic și cercetare.
Care sunt problemele și provocările frecvente ale țesutului FFPE?
Probele de țesut fixate în formalină și incluse în parafină (FFPE) sunt utilizate pe scară largă în cercetare și diagnostic, dar prezintă mai multe provocări și probleme frecvente:
- Degradarea biomoleculelor: Fixarea prelungită poate duce la degradarea ADN-ului, ARN-ului și proteinelor, îngreunând extracția acizilor nucleici sau a proteinelor de înaltă calitate pentru aplicațiile ulterioare. Fixarea corectă (evitarea subfixării și a suprafixării) este esențială pentru conservarea țesutului.
- Mascarea antigenelor: Procesul de fixare poate masca situsurile antigenice, reducând eficacitatea legării anticorpilor în imunohistochimie și în alte teste imunologice. Acest lucru necesită adesea recuperarea antigenică, o procedură prin care mascarea unui epitop este inversată și legarea epitop-anticorp este restabilită. Totuși, este posibil ca antigenicitatea completă să nu fie întotdeauna restabilită.
- Calitatea variabilă a fixării: Diferențele dintre duratele și condițiile de fixare pot duce la o calitate inconsecventă a probelor, afectând reproductibilitatea și comparabilitatea rezultatelor. Utilizați protocoale de fixare fiabile și evitați subfixarea și suprafixarea.
- Deteriorarea și fragmentarea ADN-ului: Fixarea în formalină a probelor FFPE poate provoca diverse tipuri de deteriorări ale ADN-ului, inclusiv dezaminarea citozinei (mutații C în T), deteriorări oxidative (de exemplu, 8-oxo-guanine, care duce la mutații G în T), precum și perturbări fizice, cum ar fi rupturi monocatenare (nicks), goluri și situsuri abazice, care împiedică activitatea ADN-polimerazei. Procesul de fixare în formalină poate provoca fragmentarea ADN-ului, complicând analizele genetice și genomice, precum PCR și secvențierea.
- Calitatea ARN-ului: ARN-ul extras din țesuturile FFPE este adesea fragmentat și modificat chimic, ceea ce face dificilă efectuarea unor analize transcriptomice de înaltă calitate.
- Modificările proteinelor: Formalina poate induce modificări chimice ale proteinelor, afectându-le structura și funcția, ceea ce poate interfera cu analizele proteomice.
- Artefacte de procesare a probelor: În timpul procesului de includere și secționare, stresul mecanic și căldura pot introduce artefacte și pot provoca deteriorări suplimentare ale țesutului.
- Variabilitatea de la un lot la altul: Variațiile protocoalelor de fixare și includere între loturi diferite pot duce la o variabilitate semnificativă a rezultatelor, complicând comparațiile între studii.
- Probleme de stocare: Stocarea pe termen lung a blocurilor FFPE poate duce, în timp, la degradare suplimentară și la pierderea integrității acizilor nucleici, afectând viabilitatea probelor de arhivă pentru studiile retrospective.
Reticularea: Fixarea în formalină provoacă reticularea proteinelor și a acizilor nucleici, ceea ce poate împiedica analiza moleculară și poate afecta acuratețea imunohistochimiei și a altor teste.
Utilizarea unor protocoale optimizate, manipularea atentă a probelor și aplicarea unor tehnici avansate contribuie la îmbunătățirea calității și fiabilității datelor obținute din țesuturile FFPE.
Care este diferența dintre țesutul FFPE și țesutul congelat?
Țesutul FFPE (fixat în formalină și inclus în parafină) este conservat prin fixarea țesutului cu formalină și apoi inclus în ceară de parafină, ceea ce permite stocarea pe termen lung la temperatura camerei, menținând în același timp morfologia țesutului. În schimb, țesutul congelat este conservat rapid prin congelare, ceea ce menține mai bine integritatea acizilor nucleici și a proteinelor, dar necesită stocare la temperaturi foarte scăzute.
Ce substanțe chimice se utilizează pentru includerea FFPE?
Substanțele chimice utilizate pentru includerea FFPE cuprind în mod normal formalina pentru fixare și ceara de parafină pentru includere. Pentru includerea FFPE, țesuturile sunt de obicei fixate folosind fie formalină tamponată neutră 10% (v/v) (FA), fie o soluție de formaldehidă 4% (w/v) proaspăt preparată (PFA) din pulbere de paraformaldehidă. Formalina, care este o soluție de formaldehidă în apă, este tamponată la un pH neutru pentru a conserva morfologia țesutului și a preveni reticularea excesivă. Soluția pe bază de paraformaldehidă asigură, de asemenea, o fixare eficientă prin reticularea proteinelor, stabilizând astfel structura țesutului pentru includerea ulterioară în ceară de parafină. Aceste substanțe chimice sunt esențiale pentru menținerea integrității și morfologiei țesutului în timpul procesului de fixare și includere.
Cum se îndepărtează parafina din probele FFPE?
Pentru a îndepărta parafina din probele FFPE, secțiunile de țesut sunt de obicei supuse unei serii de spălări cu xilen, urmate de rehidratare printr-o serie gradată de alcooli și, în final, apă. Deoarece xilenul este foarte toxic, prezentând riscuri pentru sănătate precum probleme respiratorii, iritații ale pielii și posibile efecte pe termen lung în cazul expunerii repetate, îndepărtarea parafinei cu ultrasunete se conturează ca o alternativă promițătoare în multe laboratoare. Această metodă utilizează unde ultrasonice intense pentru a îndepărta parafina eficient și sigur, fără a fi nevoie de solvenți toxici precum xilenul, reducând astfel riscul pentru personalul de laborator și creând un mediu de lucru mai sigur.
Cât timp ar trebui să îmi fixez țesuturile pentru o calitate bună a probelor FFPE?
Recomandările generale privind durata fixării sugerează de obicei fixarea probelor de țesut în formalină timp de 24 până la 48 de ore. Această durată este în general suficientă pentru a conserva morfologia țesutului și structurile celulare, reducând la minimum suprafixarea, care poate duce la reticulare excesivă și la degradarea acizilor nucleici și a proteinelor. Totuși, durata optimă de fixare poate varia în funcție de dimensiunea și tipul țesutului, probele mai mici sau mai delicate necesitând durate de fixare mai scurte. Este crucial să se echilibreze fixarea adecvată, pentru a preveni autoliza și degradarea țesutului, cu evitarea fixării prelungite, care ar putea complica analizele moleculare ulterioare.