Pregătirea probei FFPE cu randament ridicat: extracția proteinelor și forfecarea acidului nucleic
Cu ultrasonicator de mare randament UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics abordează provocările de fixare formalină și parafină încorporată (FFPE) pregătirea țesutului. Aflați cum procesează ultrasonication eșantionul FFPE în număr mare pentru deparafinizarea FFPE, liza țesuturilor, omogenizarea, extracția proteinelor și forfecarea ADN-ului / ARN-ului! Profitați de pregătirea țesutului FFPE cu ultrasunete – prelucrarea unui număr mare de eșantioane în plăci cu mai multe godeuri! Obțineți probe de înaltă calitate și obțineți un număr mare de eșantioane pentru rezultate fiabile de cercetare! Și nu în ultimul rând, economisiți timp și bani!
Pregătirea probei FFPE facilitată de sonicare cu randament ridicat
Fixarea formalinei și încorporarea parafinei (FFPE) este cea mai comună metodă de conservare și arhivare a țesuturilor solide. Extracția biomoleculelor din probele de țesut FFPE prezintă adesea provocări semnificative din cauza calității probelor stocate. Aceste probe, care sunt active neprețuite în biologia moleculară și cercetarea clinică, oferă o sursă bogată de informații biologice pentru studii retrospective și validarea biomarkerilor diagnostici. Cu toate acestea, procesul de fixare a formalinei și încorporarea parafinei, păstrând în același timp arhitectura și morfologia țesuturilor, complică extracția acizilor nucleici și a proteinelor de înaltă calitate. Formalina induce reticularea acizilor nucleici și a proteinelor, ducând la fragmentare moleculară și modificări chimice. Aflați cum ultrasonicator cu randament ridicat UIP400MTP depășește provocările pregătirii probei FFPE!
Ultrasonicator pentru pregătirea eficientă a probei FFPE
- Flux de lucru ușor de utilizat: procese simplificate care sunt ușor de utilizat.
- Deparafinizare, Extracția proteinelor, Forfecarea ADN / ARN
- Procesare rapidă cu randament ridicat: Manipularea eficientă a plăcilor cu mai multe godeuri.
- Deparafinizare eficientă: solubilizare îmbunătățită a proteinelor.
- Solvenți non-toxici: Evită utilizarea solvenților organici nocivi, cum ar fi xilenul.
UIP400MTP sonicator cu randament ridicat pentru prelucrarea probelor FFPE cu randament ridicat în plăci cu mai multe godeuri
Progrese în tehnicile de extracție a proteinelor din țesutul FFPE
Hielscher Ultrasonics abordează provocările în pregătirea probei FFPE cu randament ridicat. Sonicare utilizează unde ultrasonice pentru a genera vibrații mecanice și cavitație focalizată, perturbând în mod eficient structurile celulare și sporind solubilizarea biomoleculelor. Această tehnică a câștigat popularitate pentru capacitatea sa de a crește eficiența și randamentul extracției acidului nucleic și a proteinelor din țesuturile FFPE, precum și forfecarea ADN și ARN pentru pregătirea bibliotecii. Este foarte important să subliniem că ultrasonication folosind UIP400MTP multiwell placă sonicator menține integritatea acestor biomolecule pentru aplicații în aval.
Forfecarea acidului nucleic folosind ultrasonication cu randament ridicat
Ultrasonicator multi-bine UIP400MTP pentru utilizarea în setări de mare randament aduce pregătirea probelor FFPE la un nou nivel. Această metodă de sonicare multiwell-plate oferă o soluție eficientă și fiabilă pentru prelucrarea simultană a mai multor probe. Facilitează extracția rapidă și reproductibilă a ADN-ului, ARN-ului și proteinelor, care sunt esențiale pentru diferite tehnici analitice, inclusiv secvențierea de generație următoare (NGS), PCR cantitativ și analize proteomice. Optimizarea parametrilor sonicare, ar fi amplitudinea, durata, și temperatura, îmbunătățește în continuare calitatea și cantitatea biomoleculelor extrase.
Sonicatorul UIP400MTP pentru plăcile cu mai multe godeuri oferă avantaje semnificative pentru fragmentarea și forfecarea ADN-ului și ARN-ului din țesutul FFPE. Una dintre caracteristicile remarcabile ale acestui sistem este capacitatea sa de a realiza dimensiuni înguste ale fragmentelor de ADN și ARN, oferind o reglabilitate precisă a intensității sonicării pentru a obține fragmente scurte de 150-200 perechi de baze (bp) sau fragmente mai lungi de 15-20 perechi de kilobaze (kbp). Această versatilitate face ca UIP400MTP să fie indispensabilă atât pentru aplicațiile de secvențiere cu citire scurtă, cât și pentru cele cu citire lungă, asigurând rezultate de înaltă calitate pentru secvențierea de generație următoare (NGS) și secvențierea întregului genom (WGS). Controlul său precis asupra dimensiunii fragmentelor este crucial pentru cercetătorii din toate domeniile genomicii, deoarece permite pregătirea probelor în conformitate cu specificațiile.
Contactați-ne pentru soluții avansate în țesutul FFPE
Descoperiți UIP400MTP sonicator cu plăci multiwell pentru recuperarea eficientă a biomoleculelor din probele FFPE, menținând integritatea acizilor nucleici și proteinelor extrase și asigurând reproductibilitatea rezultatelor. Această tehnologie se integrează perfect cu alte fluxuri de lucru pregătitoare și analitice, eficientizând și îmbunătățind investigațiile moleculare folosind arhivele de țesuturi FFPE.
Fixativele și efectele lor
Fixarea este un pas crucial în pregătirea probei care păstrează structurile celulare, oprește reacțiile biochimice și previne degradarea. Diferite fixative sunt utilizate în funcție de cerințele experimentale specifice. Cele două fixative cele mai frecvente sunt formaldehida și paraformaldehida, care leagă proteinele și acizii nucleici, păstrând morfologia și antigenicitatea celulelor și țesuturilor. Alte fixative, cum ar fi etanolul, metanolul și glutaraldehida, sunt utilizate pentru aplicații specifice.
Fixativele de formaldehidă și paraformaldehidă formează punți de metilen între grupările amino, ducând la reticularea proteinelor. Acest proces imobilizează eficient componentele celulare, păstrându-le integritatea în timpul etapelor ulterioare de analiză. Efectele acestor fixative pot fi influențate de factori precum concentrația, pH-ul și temperatura, iar optimizarea acestor parametri este crucială pentru a asigura conservarea optimă a structurilor celulare.
Avantajele pregătirii FFPE cu ultrasunete
Ultrasonication este o tehnică puternică pentru perturbarea celulelor și țesuturilor fixate care excelează tehnicile convenționale. Oferă câteva avantaje notabile față de metodele tradiționale de liză:
- Viteză și eficiență: Liza cu ultrasunete asigură întreruperea rapidă a celulelor și țesuturilor, reducând semnificativ timpul de procesare în comparație cu metodele de liză mecanică sau chimică. Undele sonore de înaltă frecvență generate de sonda ultrasonică creează forțe mecanice de forfecare, provocând perturbarea structurilor celulare fixate. Această perturbare rapidă și eficientă permite cercetătorilor să proceseze volume mari de eșantioane într-un interval scurt de timp.
- Delicat și reglabil: Liza cu ultrasunete oferă un mecanism de întrerupere blândă care minimizează deteriorarea biomoleculelor sensibile, ar fi proteinele, acizii nucleici și enzimele. Spre deosebire de metodele mecanice care generează căldură excesivă sau forțe de forfecare, liza cu ultrasunete utilizează cavitația controlată pentru a perturba celulele, păstrând în același timp integritatea și funcționalitatea componentelor intracelulare.
- Versatilitate: Liza cu ultrasunete poate fi aplicată diferitelor fixative, permițând cercetătorilor să lucreze cu o gamă largă de probe fixate. Indiferent dacă se utilizează formaldehidă, paraformaldehidă sau fixative alternative, liza cu ultrasunete oferă în mod constant o întrerupere eficientă, asigurând recuperarea optimă a componentelor celulare.
- Randament ridicat și calitate: Liza cu ultrasunete facilitează randamente ridicate de componente celulare intacte datorită capacității sale de a perturba uniform celulele și țesuturile fixate. Acest lucru permite aplicațiilor din aval, cum ar fi analiza proteinelor, extracția acidului nucleic și testele enzimatice, să producă rezultate fiabile și reproductibile.
- Compatibilitate cu automatizarea: Liza cu ultrasunete poate fi ușor integrată în sistemele automate, permițând procesarea probelor cu randament ridicat. Această compatibilitate permite cercetătorilor să-și eficientizeze fluxul de lucru și să crească productivitatea, în special în studiile la scară largă.
96-bine placă sonicator UIP400MTP Pentru sonicarea plăcilor de microtitrare și multiwell
Liza cu ultrasunete a revoluționat perturbarea celulelor și țesuturilor fixate, oferind numeroase avantaje față de metodele tradiționale de liză. Viteza, eficiența, selectivitatea, versatilitatea, randamentul ridicat și compatibilitatea cu automatizarea îl fac un instrument indispensabil în biologia moleculară și cercetarea biotehnologiei. Oferind sonicatori non-contact, precum și sonicator de tip sondă, Hielscher Ultrasonics oferă omogenizator cu ultrasunete cel mai potrivit pentru aplicația dumneavoastră de știință a vieții. Indiferent dacă doriți să procesați probe unice, mai multe probe sau numere foarte mari de probe simultan, vă vom oferi cel mai bun sonicator care se potrivește cerințelor dumneavoastră de cercetare și diagnostic.
Citiți mai multe despre Hielscher sonicatoare non-contact pentru multi-eșantion și pregătirea probei de mare capacitate!
- investiție unică
- utilizați propriile consumabile
- fără costuri recurente pentru accesorii și consumabile proprietare
- randament ridicat
- control de precizie
- tehnologie de ultimă generație
- fiabilitate & robustețe
- control reglabil și precis al procesului
- Calitate industrială: poate fi operată continuu 24/7
- ușor și sigur de operat
- întreținere redusă
Citiți mai multe despre aplicațiile sonicatorilor în știința vieții!
Placă sonicator UIP400MTP pentru orice plăci cu 96 de godeuri, plăci de microtitrare și plăci cu mai multe godeuri.
Proiectare, fabricație și consultanță – Calitate Made in Germany
Hielscher ultrasonicators sunt bine-cunoscute pentru cele mai înalte standarde de calitate și design. Robustețea și funcționarea ușoară permit integrarea fără probleme a ultrasonicators noastre în instalații industriale. Condiții dure și medii solicitante sunt ușor de manipulat de ultrasonicators Hielscher.
Hielscher Ultrasonics este o companie certificată ISO și pune un accent deosebit pe ultrasonicators de înaltă performanță cu tehnologie de ultimă oră și ușurință în utilizare. Desigur, ultrasonicators Hielscher sunt conforme CE și îndeplinesc cerințele UL, CSA și RoHs.
Contactează-ne! / Întreabă-ne!
UIP400MTP Ultrasonicator: Pregătirea probei FFPE cu randament ridicat în farfurie cu mai multe puțuri
FAQ
Mai jos, răspundem la întrebări frecvente, care sunt relevante pentru pregătirea țesutului FFPE și ultrasonication a probelor FFPE.
Cum se prepară țesutul FFPE?
Pași pentru pregătirea țesuturilor FFPE: Manipularea și prelucrarea meticuloasă a țesuturilor proaspete sunt esențiale pentru generarea de probe FFPE de înaltă calitate. Asigurarea conservării arhitecturii celulare, a acizilor nucleici și a proteinelor este esențială pentru o analiză precisă în aval. Fiecare etapă – de la colectare la încorporare – necesită precizie pentru a menține integritatea probei pentru diferite analize, inclusiv examen histologic, imunohistochimie și studii moleculare. Executat corect, acest proces de fixare și încorporare asigură că țesutul conservat reflectă cu exactitate starea in vivo, permițând rezultate fiabile de diagnostic și cercetare.
Vă prezentăm cei 6 pași majori ai procesului de încorporare a probelor de țesut FFPE.
- Colectarea țesuturilor
Biopsiile de la mamifere vii și culturile de țesuturi sunt ambele surse viabile pentru obținerea de țesut proaspăt pentru prepararea probei FFPE.
Este important să utilizați o tehnică aseptică: utilizați instrumente sterile și mănuși pentru a evita contaminarea. În mod ideal, colectați țesuturile într-un mediu steril, cum ar fi o suită chirurgicală sau o hotă cu flux laminar.
Deoarece specimenul este foarte fragil, manipularea sa sensibilă este esențială: minimizați întârzierile în procesare și începeți imediat prelucrarea ulterioară a țesuturilor după excizie. Acest lucru este crucial pentru a preveni autoliza și degradarea. Păstrați țesutul la temperatura camerei; Evitați înghețarea, deoarece poate provoca formarea cristalelor de gheață și deteriorarea țesuturilor. - Fixarea țesuturilor
În primul rând, țesutul este tratat cu o soluție fixativă: utilizați 10% formalină tamponată neutru (NBF), care este echivalentă cu 4% formaldehidă în apă, tamponată la un pH neutru.
Scufundați țesutul complet în formalină. Asigurați un raport fixativ-volum țesut de cel puțin 10: 1. Timpul de fixare variază de obicei între 6 și 24 de ore, în funcție de tipul și dimensiunea țesutului. Este important ca fixativul să poată pătrunde bine în țesut. Cu toate acestea, supra-fixarea poate duce la reticulare care complică recuperarea antigenului, în timp ce sub-fixarea poate duce la conservarea slabă a țesuturilor. - Decuparea țesuturilor
În al doilea rând, tăiați țesutul la o grosime de aproximativ 3-5 mm pentru a permite penetrarea adecvată a fixativului. Asigurați orientarea corectă a țesutului pentru a capta structurile histologice relevante. Acest lucru facilitează procesul de extracție atunci când țesutul este ulterior utilizat pentru analiză. - Prelucrarea probei fixate
Acum, țesutul fix trebuie să fie deshidratat: După fixare, țesutul trebuie să fie deshidratat pentru a asigura penetrarea completă a cerii de parafină. Treceți țesutul printr-o serie gradată de etanol (70%, 80%, 90% și 100%) pentru a îndepărta apa.
Curățarea cu xilen: Ceara de parafină este insolubilă în apă, dar solubilă în xilen. Prin urmare, apa din țesut trebuie înlocuită cu xilen. Cu toate acestea, xilenul în sine este insolubil în apă, dar solubil în alcool, necesitând o etapă intermediară în care apa este înlocuită mai întâi cu alcool. Se scufundă țesutul în xilen sau într-un înlocuitor de xilen pentru a îndepărta etanolul și se pregătește țesutul pentru infiltrarea cu parafină.
Infiltrarea folosind parafină: Încorporați țesutul în ceară de parafină topită, asigurând infiltrarea completă. Această etapă implică de obicei mai multe modificări ale parafinei pentru a asigura impregnarea completă. - Încorporarea țesutului
În această etapă, țesutul este modelat într-un bloc de țesut: Așezați țesutul într-o matriță cu orientarea dorită și turnați parafină topită peste el. Se lasă parafina să se solidifice prin răcire la temperatura camerei sau pe o placă rece. - Secționare și montare
Microtomie: Pentru a tăia țesutul încorporat, utilizați un microtom pentru a tăia secțiuni subțiri (de obicei 4-5 micrometri) din blocul de parafină. Apoi eșantionul este montat, plasând secțiunile pe lame de sticlă pentru colorare ulterioară și analiză microscopică.
În cele din urmă, verificați calitatea histologiei: Evaluați primele secțiuni sub microscop pentru a asigura fixarea și prelucrarea corespunzătoare. Ajustați protocoalele după cum este necesar, în funcție de tipul de țesut și de calitatea observată.
Țesuturile FFPE pot fi utilizate pentru a recupera ARN, ADN și proteine, precum și pentru a descoperi semne de cancer sau alte boli. Acestea pot fi stocate ani de zile și sunt o parte esențială a modului în care cercetătorii și medicii folosesc probele de țesut pentru diagnostic și cercetare.
Care sunt problemele și provocările comune cu țesutul FFPE?
Probele de țesut fixate în formalină, încorporate în parafină (FFPE) sunt utilizate pe scară largă în cercetare și diagnosticare, dar prezintă mai multe provocări și probleme comune:
- Degradarea biomoleculelor: Fixarea prelungită poate duce la degradarea ADN-ului, ARN-ului și proteinelor, ceea ce face dificilă extragerea acizilor nucleici de înaltă calitate sau a proteinelor pentru aplicații în aval. Fixarea corectă (evitând sub- și supra-fixarea) este esențială pentru conservarea țesuturilor.
- Mascarea antigenului: Procesul de fixare poate masca situsurile antigenice, reducând eficacitatea legării anticorpilor în imunohistochimie și alte teste imunologice. Acest lucru necesită adesea recuperarea antigenului, o procedură prin care mascarea unui epitop este inversată și legarea epitop-anticorp este restabilită. Cu toate acestea, antigenicitatea completă nu poate fi întotdeauna restabilită.
- Calitate fixare variabilă: Diferențele în ceea ce privește timpii și condițiile de fixare pot duce la o calitate inconsecventă a probei, afectând reproductibilitatea și comparabilitatea rezultatelor. Utilizați protocoale de fixare fiabile și evitați sub- și supra-fixarea.
- Deteriorarea și fragmentarea ADN-ului: Fixarea formalinei probelor FFPE poate provoca diferite tipuri de leziuni ale ADN-ului, inclusiv dezaminarea citozinei (mutații C la T), leziuni oxidative (de exemplu, 8-oxo-guanină care duce la mutații G la T), precum și perturbări fizice, cum ar fi crestături, goluri și situsuri abazice care împiedică activitatea ADN-polimerazei. Procesul de fixare a formalinei poate provoca fragmentarea ADN-ului, complicând analizele genetice și genomice, cum ar fi PCR și secvențierea.
- Calitatea ARN: ARN-ul extras din țesuturile FFPE este adesea fragmentat și modificat chimic, ceea ce face dificilă efectuarea analizelor transcriptomice de înaltă calitate.
- Modificări ale proteinelor: Formalina poate induce modificări chimice în proteine, afectând structura și funcția acestora, ceea ce poate interfera cu analizele proteomice.
- Artefacte de procesare a probelor: În timpul procesului de încorporare și secționare, stresul mecanic și căldura pot introduce artefacte și pot provoca daune suplimentare țesutului.
- Variabilitatea de la lot la lot: Variațiile protocoalelor de fixare și încorporare între diferite loturi pot duce la o variabilitate semnificativă a rezultatelor, complicând comparațiile dintre studii.
- Probleme de stocare: Depozitarea pe termen lung a blocurilor FFPE poate duce la degradarea suplimentară și pierderea integrității acidului nucleic în timp, afectând viabilitatea probelor de arhivă pentru studii retrospective.
Reticulare: Fixarea formalinei provoacă reticulare a proteinelor și acizilor nucleici, ceea ce poate împiedica analiza moleculară și poate afecta acuratețea imunohistochimiei și a altor teste.
Utilizarea protocoalelor optimizate, manipularea atentă a probelor și aplicarea tehnicilor avansate ajută la îmbunătățirea calității și fiabilității datelor obținute din țesuturile FFPE.
Care este diferența dintre FFPE și țesutul înghețat?
Țesutul FFPE (fixat în formalină, încorporat în parafină) este conservat folosind formalină pentru fixarea țesutului și apoi încorporat în ceara de parafină, permițând depozitarea pe termen lung la temperatura camerei, menținând în același timp morfologia țesutului. În schimb, țesutul înghețat este conservat rapid prin înghețare, ceea ce menține mai bine integritatea acizilor nucleici și a proteinelor, dar necesită depozitare la temperaturi foarte scăzute.
Ce substanțe chimice sunt utilizate pentru încorporarea FFPE?
Produsele chimice utilizate pentru încorporarea FFPE includ în mod normal formalina pentru fixare și ceara de parafină pentru încorporare. Pentru încorporarea FFPE, țesuturile sunt de obicei fixate folosind fie formalină tamponată neutră (FA) 10% (v/v), fie o soluție de formaldehidă (PFA) 4% (g/v) proaspăt preparată, obținută din pulbere de paraformaldehidă. Formalina, care este o soluție de formaldehidă în apă, este tamponată la un pH neutru pentru a păstra morfologia țesuturilor și pentru a preveni reticularea excesivă. Soluția pe bază de paraformaldehidă asigură, de asemenea, o fixare eficientă prin reticulare a proteinelor, stabilizând astfel structura țesutului pentru încorporarea ulterioară în ceara de parafină. Aceste substanțe chimice sunt esențiale pentru menținerea integrității și morfologiei țesuturilor în timpul procesului de fixare și încorporare.
Cum se elimină parafina din probele de FFPE?
Pentru a elimina parafina din probele de FFPE, secțiunile de țesut sunt de obicei supuse unei serii de spălări de xilen, urmate de rehidratare printr-o serie gradată de alcooli și, în final, apă. Deoarece xilenul este foarte toxic, prezentând riscuri pentru sănătate, cum ar fi probleme respiratorii, iritații ale pielii și potențiale efecte pe termen lung cu expunere repetată, îndepărtarea cu ultrasunete a parafinei apare ca o alternativă promițătoare în multe laboratoare. Această metodă utilizează unde ultrasonice intense pentru a îndepărta eficient și în siguranță parafina fără a fi nevoie de solvenți toxici precum xilenul, reducând astfel riscul pentru personalul de laborator și creând un mediu de lucru mai sigur.
Cât timp ar trebui să-mi fixez țesuturile pentru o calitate bună a probei FFPE?
Recomandările generale pentru durata fixării sugerează de obicei fixarea probelor de țesut în formol timp de 24 până la 48 de ore. Această durată este, în general, suficientă pentru a păstra morfologia țesuturilor și structurile celulare, reducând în același timp suprafixarea, ceea ce poate duce la reticulare excesivă și degradarea acizilor nucleici și a proteinelor. Cu toate acestea, timpul optim de fixare poate varia în funcție de dimensiunea și tipul de țesut, probele mai mici sau mai delicate necesitând timpi de fixare mai scurți. Este esențial să se echilibreze fixarea adecvată pentru a preveni autoliza și degradarea țesuturilor, evitând în același timp fixarea prelungită care ar putea complica analizele moleculare din aval.