Protocolul de cultivare și detașare a biofilmului Staphylococcus

Metodele standardizate sunt esențiale pentru rezultate fiabile ale cercetării. Aici puteți găsi un protocol de cultivare și detașare pentru biofilmele stafilococice. Acest protocol se concentrează pe pregătirea simplificată a probelor cu randament ridicat folosind UIP400MTP sonicator cu plăci cu mai multe godeuri pentru detașarea eficientă a biofilmului în plăci cu 96 de godeuri. Protocolul conține, de asemenea, pași cheie pentru cultivarea, spălarea și vizualizarea biofilmului, cu accent pe minimizarea variabilității și asigurarea reproductibilității.

Biofilmul stafilococului și cercetarea antibioticelor

Biofilmele Staphylococcus joacă un rol critic în infecțiile persistente datorită rezistenței lor la antibiotice și răspunsuri imune. Formarea biofilmului oferă un mediu protector pentru bacterii, ceea ce face ca infecțiile să fie dificil de tratat. Cercetarea biofilmelor se concentrează adesea pe înțelegerea formării, comportamentului și susceptibilității lor la antimicrobiene, cu accent pe metode de mare randament pentru a eficientiza fluxurile de lucru experimentale.
Sonicatorul cu plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP oferă un avantaj semnificativ în cercetarea biofilmului, permițând detașarea rapidă și eficientă a biofilmelor din plăcile cu 96 de godeuri. Acest dispozitiv oferă energie ultrasonică uniformă tuturor puțurilor, asigurând rezultate consistente, minimizând în același timp variabilitatea.

Protocol pentru cultivarea și detașarea biofilmului Staphylococcus

Mai jos, vă ghidăm cu instrucțiuni pas cu pas prin procesul de cultivare și detașare a unui biofilm de stafilococ. Ca etapă analitică exemplară, vă arătăm cum să cuantificați spectrofotometric biomasa cultivată prin colorare violet cristalin.

Cultivarea biofilmului Staphylococcus

Materiale necesare:

• Plăci sterile de microtitrare tratate cu cultură de țesut din polistiren cu 96 de godeuri, cu capace
• Bulion de soia triptic (TSB) cu glucoză 0,25%
• Dulap de securitate biologică

Paşi:

1. Pregătiți un mediu de lucru steril într-un cabinet de securitate biologică pentru a minimiza contaminarea.
2. Se adaugă TSB care conține 0,25% glucoză în godeurile plăcii de microtitrare. TSB fără glucoză nu susține în general formarea biofilmului și trebuie utilizat ca control numai dacă este necesar.
3. Inoculați pudeurile cu tulpini bacteriene preparate după cum este descris mai jos:
4. Pregătiți suspensiile bacteriene, asigurându-vă că nu există clustere celulare preexistente prin omogenizarea suspensiilor folosind sonicarea sau prin ruperea clusterelor cu un ac de calibru 23 și un vortex scurt.
5. Sigilați placa cu capacul și incubați în condiții optime pentru formarea biofilmului (de exemplu, 37°C timp de 24 de ore).
6. Efectuați experimentul în trei exemplare pentru fiecare tulpină bacteriană (trei godeuri pe tulpină) pentru a asigura fiabilitatea.
7. Alocați șase godeuri pe placă pentru controalele negative. Pot fi testate până la 30 de tulpini pe placă cu 96 de godeuri.

Vizualizarea și spălarea biofilmului

1. După incubație, aruncați mediul cu atenție pentru a evita perturbarea biofilmului.
2. Spălați fiecare puț de patru ori cu soluție salină fiziologică pentru a elimina bacteriile planctonice.
3. Inspectați fundul puțurilor pentru pete albe care indică prezența biofilmului.

Detașarea biofilmului folosind sonicatorul cu plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP

Configurarea și parametrii dispozitivului:

• UIP400MTP sonicator cu plăci cu mai multe godeuri
• Setări de funcționare: 60% amplitudine, mod ciclu cu 60 de secunde ON / 30 de secunde OFF

Paşi:

1. Așezați placa de microtitrare spălată pe platforma UIP400MTP.
2. Sonicați sample-urile la setările recomandate (60% amplitudine, 60 de secunde ON, 30 de secunde OFF). Reglați setările pentru tulpina bacteriilor.
3. Inițiați procesul de sonicare pentru a detașa biofilmul. Undele ultrasonice perturbă matricea biofilmului, eliberând bacteriile aderente.
4. UIP400MTP asigură o expunere uniformă în toate godeurile pentru rezultate consistente de detașare.

Etapa analitică: Cuantificarea biomasei biofilmului de stafilococ detașat folosind violet de cristal (CV)

Materiale necesare:

• 0Soluție de violet cristal (CV) de 1%
• 95% etanol sau 30% acid acetic (pentru solubilizare)
• Cititor de microplăci capabil să citească la 570 nm
• Plăci sterile de microtitrare pentru colorare

Paşi:

1. Pregătirea plăcii de colorare: Transferați 100 μL din suspensia de biofilm detașată din fiecare godeu al plăcii sonicate în godeurile corespunzătoare ale unei plăci de microtitru curate și sterile cu 96 de godeuri. Acest lucru asigură un mediu clar și uniform pentru colorare.
2. Colorarea biofilmului detașat: Adăugați 150 μL de soluție de violet cristalin 0,1% în fiecare godeu care conține suspensia de biofilm detașată. Pipetați ușor pentru a asigura amestecarea uniformă a suspensiei de biofilm și a violetului cristal.
3. Incubație: Lăsați placa să incubeze la temperatura camerei timp de 15 minute pentru a permite violetului de cristal să coloreze biomasa în mod eficient.
4. Spălare: După incubație, aruncați cu grijă soluția violet cristalin din puțuri fără a deranja biomasa. Spălați fiecare puț de trei ori cu soluție salină fiziologică sterilă pentru a îndepărta pata nelegată.
5. Uscare: Lăsați placa să se usuce la aer la temperatura camerei sau sub o hota sterilă cu flux de aer. Evitați încălzirea, deoarece acest lucru poate modifica rezultatele.
6. Solubilizare: Adăugați 200 μL de etanol 95% (sau 30% acid acetic, în funcție de practicile standard de laborator) în fiecare puț pentru a solubiliza violetul de cristal legat. Se amestecă ușor pipetând sau agitând placa timp de 10 minute la temperatura camerei.
7. Măsurare: Măsurați densitatea optică (OD) a soluției cristaline violet solubilizate la 570 nm folosind un cititor de microplăci.
8. Analiza datelor: Scădeți valoarea medie OD570 a martorilor negativi (godeuri cu TSB, dar fără inocul bacterian) din godeurile experimentale pentru a ține cont de colorarea de fond. Înregistrați și analizați datele.

Notă: Efectuați experimentul în trei exemplare pentru fiecare afecțiune pentru a asigura reproductibilitatea. Asigurați manipularea corectă a violetului cristal și a etanolului, respectând protocoalele de siguranță și eliminare.
 

Principalele beneficii ale UIP400MTP dintr-o privire:

• Procesare cu randament ridicat: Proiectat special pentru plăci cu mai multe godeuri, permițându-vă să procesați mai multe probe simultan.
• Distribuție uniformă cu ultrasunete: Asigură o intensitate egală a ultrasunetelor în toate godeurile, oferind rezultate consistente pe toate probele.
• Utilizați orice placă standard: UIP400MTP poate gestiona orice plăci standard cu mai multe godeuri, vase Petri și rafturi pentru tuburi. Nu sunt necesare plăci brevetate scumpe!
• Interfață ușor de utilizat: Ușor de configurat și controlat, ceea ce îl face un instrument excelent pentru creșterea productivității laboratorului. Setările programabile și automatizarea facilitează standardizarea proceselor!