Protocol de cultivare și detașare a biofilmului de Staphylococcus

Metodele standardizate sunt esențiale pentru obținerea unor rezultate de cercetare fiabile. Aici găsiți un protocol de cultivare și detașare pentru biofilmele stafilococice. Acest protocol se concentrează pe pregătirea simplificată a probelor, cu capacitate mare de procesare, folosind sonicatorul pentru plăci multi-godeu UIP400MTP, pentru detașarea eficientă, cu capacitate mare de procesare, a biofilmelor din plăci cu 96 de godeuri. Protocolul conține, de asemenea, etapele-cheie pentru cultivarea, spălarea și vizualizarea biofilmului, cu accent pe minimizarea variabilității și asigurarea reproductibilității.

Biofilmul de Staphylococcus și cercetarea privind antibioticele

Biofilmele de Staphylococcus joacă un rol critic în infecțiile persistente, datorită rezistenței lor la antibiotice și la răspunsurile imune. Formarea biofilmului oferă bacteriilor un mediu protector, ceea ce face ca infecțiile să fie dificil de tratat. Cercetarea biofilmelor se concentrează adesea pe înțelegerea formării, comportamentului și susceptibilității acestora la agenții antimicrobieni, cu accent pe metode cu capacitate mare de procesare, care să simplifice fluxurile de lucru experimentale.
Sonicatorul pentru plăci multi-godeu UIP400MTP oferă un avantaj semnificativ în cercetarea biofilmelor, permițând detașarea rapidă și eficientă a biofilmelor din plăcile cu 96 de godeuri. Acest dispozitiv furnizează energie ultrasonică uniformă tuturor godeurilor, asigurând rezultate consecvente și minimizând totodată variabilitatea.

Protocol pentru cultivarea și detașarea biofilmului de Staphylococcus

Mai jos vă ghidăm, cu instrucțiuni pas cu pas, prin procesul de cultivare și detașare a unui biofilm de stafilococ. Ca etapă analitică exemplificativă, vă arătăm cum să cuantificați spectrofotometric biomasa cultivată prin colorare cu cristal violet.

Cultivarea biofilmului de Staphylococcus

Materiale necesare:

• Plăci de microtitrare sterile din polistiren, cu 96 de godeuri, cu fund plat, tratate pentru culturi tisulare, prevăzute cu capace
• Bulion triptic de soia (TSB) cu 0,25% glucoză
• Hotă de siguranță biologică

Etape:

1. Pregătiți un mediu de lucru steril într-o hotă de siguranță biologică pentru a minimiza contaminarea.
2. Adăugați TSB care conține 0,25% glucoză în godeurile plăcii de microtitrare. TSB fără glucoză nu susține, în general, formarea biofilmului și ar trebui utilizat numai ca control, dacă este necesar.
3. Inoculați godeurile cu tulpini bacteriene pregătite după cum este descris mai jos:
4. Pregătiți suspensiile bacteriene, asigurându-vă că nu există aglomerări celulare preexistente, prin omogenizarea suspensiilor prin sonicare sau prin dezagregarea aglomerărilor cu un ac de 23 gauge și o scurtă agitare pe vortex.
5. Închideți placa cu capacul acesteia și incubați în condiții optime pentru formarea biofilmului (de ex., 37°C timp de 24 de ore).
6. Efectuați experimentul în triplicat pentru fiecare tulpină bacteriană (trei godeuri per tulpină) pentru a asigura fiabilitatea.
7. Alocați șase godeuri per placă pentru controalele negative. Pe o placă cu 96 de godeuri pot fi testate până la 30 de tulpini.

Vizualizarea și spălarea biofilmului

1. După incubare, îndepărtați cu grijă mediul, pentru a evita perturbarea biofilmului.
2. Spălați fiecare godeu de patru ori cu ser fiziologic pentru a îndepărta bacteriile planctonice.
3. Inspectați fundul godeurilor pentru a identifica pete albe care indică prezența biofilmului.

Detașarea biofilmului folosind sonicatorul pentru plăci multi-godeu UIP400MTP

Configurarea dispozitivului și parametri:

• Sonicator pentru plăci multi-godeu UIP400MTP
• Setări de funcționare: amplitudine 60%, mod ciclic cu 60 de secunde pornit / 30 de secunde oprit

Etape:

1. Așezați placa de microtitrare spălată pe platforma UIP400MTP.
2. Sonicați probele la setările recomandate (amplitudine 60%, 60 de secunde pornit, 30 de secunde oprit). Ajustați setările în funcție de tulpina bacteriană.
3. Inițiați procesul de sonicare pentru a detașa biofilmul. Undele ultrasonice perturbă matricea biofilmului, eliberând bacteriile aderente.
4. UIP400MTP asigură o expunere uniformă în toate godeurile, pentru rezultate de detașare consecvente.

Etapă analitică: cuantificarea biomasei biofilmului de Staphylococcus detașat folosind cristal violet (CV)

Materiale necesare:

• Soluție de cristal violet (CV) 0,1%
• Etanol 95% sau acid acetic 30% (pentru solubilizare)
• Cititor de microplăci capabil să citească la 570 nm
• Plăci de microtitrare sterile pentru colorare

Etape:

1. Pregătirea plăcii de colorare: transferați 100 µL din suspensia de biofilm detașat din fiecare godeu al plăcii sonicate în godeurile corespunzătoare ale unei plăci de microtitrare curate și sterile, cu 96 de godeuri. Acest lucru asigură un mediu clar și uniform pentru colorare.
2. Colorarea biofilmului detașat: adăugați 150 µL de soluție de cristal violet 0,1% în fiecare godeu care conține suspensia de biofilm detașat. Pipetați ușor pentru a asigura amestecarea uniformă a suspensiei de biofilm cu cristalul violet.
3. Incubare: lăsați placa să incubeze la temperatura camerei timp de 15 minute, pentru a permite cristalului violet să coloreze eficient biomasa.
4. Spălare: după incubare, îndepărtați cu grijă soluția de cristal violet din godeuri, fără a perturba biomasa. Spălați fiecare godeu de trei ori cu ser fiziologic steril pentru a îndepărta colorantul nelegat.
5. Uscare: lăsați placa să se usuce la aer, la temperatura camerei sau sub o hotă sterilă cu flux de aer. Evitați încălzirea, deoarece aceasta poate modifica rezultatele.
6. Solubilizare: adăugați 200 µL de etanol 95% (sau acid acetic 30%, în funcție de practicile standard ale laboratorului) în fiecare godeu pentru a solubiliza cristalul violet legat. Amestecați ușor prin pipetare sau prin agitarea plăcii timp de 10 minute la temperatura camerei.
7. Măsurare: măsurați densitatea optică (OD) a soluției de cristal violet solubilizate la 570 nm folosind un cititor de microplăci.
8. Analiza datelor: scădeți valoarea medie OD570 a controalelor negative (godeuri cu TSB, dar fără inocul bacterian) din godeurile experimentale, pentru a ține cont de colorarea de fond. Înregistrați și analizați datele.

Notă: efectuați experimentul în triplicat pentru fiecare condiție, pentru a asigura reproductibilitatea. Asigurați manipularea corespunzătoare a cristalului violet și a etanolului, respectând protocoalele de siguranță și de eliminare.

Principalele avantaje ale UIP400MTP pe scurt:

• Procesare cu capacitate mare: Conceput special pentru plăci multi-godeu, permițându-vă să procesați simultan mai multe probe.
• Distribuție ultrasonică uniformă: Asigură o intensitate ultrasonică egală în toate godeurile, oferind rezultate consecvente pentru toate probele.
• Utilizați orice placă standard: UIP400MTP poate procesa orice plăci multi-godeu standard, plăci Petri și suporturi pentru tuburi. Nu sunt necesare plăci proprietare scumpe!
• Interfață ușor de utilizat: Ușor de configurat și de controlat, ceea ce îl face un instrument excelent pentru creșterea productivității laboratorului. Setările programabile și automatizarea facilitează standardizarea proceselor!