Protocol de testare MBEC folosind sonicatorul cu plăci cu 96 de godeuri UIP400MTP

Testul MBEC este utilizat pentru a determina concentrația de agenți antimicrobieni necesari pentru a elimina biofilmele formate pe capacele de prindere. Pentru a evalua viabilitatea biofilmului, biofilmele trebuie mai întâi detașate de capacele unei plăci cu 96 de godeuri. Sonicarea este cea mai fiabilă și eficientă metodă pentru această detașare. Sonicatorul de plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP este special conceput pentru a procesa plăcile de testare cu eficiență și confort maxim, eficientizând și accelerând testele MBEC de mare randament.

Sonicare pentru detașarea biofilmului

Sonicarea este un pas crucial în testele de concentrație minimă de eradicare a biofilmului (MBEC), permițând dislocarea eficientă a celulelor biofilmului din atașarea lor de suprafață. Biofilmele sunt comunități structurate inerent de microorganisme încapsulate într-o matrice extracelulară, ceea ce le face semnificativ mai rezistente la agenții antimicrobieni în comparație cu celulele planctonice. În timpul testelor MBEC, sonicarea folosește unde ultrasonice pentru a genera cavitație controlată, perturbând matricea biofilmului și eliberând celulele încorporate într-o suspensie. Acest pas asigură că celulele biofilmului sunt dispersate uniform în mediul de recuperare, facilitând evaluări precise ale viabilității prin metode de placare, diluare sau spectrofotometrică. Fără o detașare adecvată a biofilmului, componentele matricei reziduale ar putea proteja celulele, ceea ce duce la subestimarea eficacității antimicrobiene. Prin urmare, sonicarea este indispensabilă pentru obținerea unor valori MBEC fiabile și reproductibile, reflectând adevăratul potențial de eradicare al agenților testați. Sonicatorul cu plăci cu mai multe godeuri permite UIP400MTP pregătirea ușoară a probelor de mare randament în plăcile de testare.

Protocol de testare a concentrației minime de eradicare a biofilmului (MBEC)

Pasul 1: Formarea biofilmului

1. Pregătiți suspensia bacteriană:
   Creșteți bacteriile în medii adecvate creșterii în fază logaritmică.
   Diluați cultura bacteriană la o densitate optică definită (de exemplu, OD600 ~ 0,1).
2. Inoculați placa cu 96 de godeuri:
   Adăugați suspensia bacteriană (de exemplu, 150-200 μL) în fiecare godet al unei plăci standard de microtitrare cu 96 de godeuri.
3. Atașați capacul cuiului:
   Așezați capacul cuiului pe placa inoculată pentru a permite formarea biofilmului pe suprafețele cuiului.
4. Incubați farfuria:
   Incubați configurația la o temperatură adecvată (de exemplu, 37 ° C) timp de 24-48 de ore fără agitare pentru a promova creșterea biofilmului.

Pasul 2: Tratamentul cu agenți antimicrobieni

• Pregătiți soluții antimicrobiene:
  Pregătiți o gamă de concentrații antimicrobiene în medii proaspete.
  Expunerea biofilmelor la agenți antimicrobieni:
  Scoateți capacul din cultura bacteriană și clătiți-l cu soluție salină sterilă sau PBS pentru a îndepărta celulele planctonice.
  Așezați capacul cuiului într-o nouă placă cu 96 de godeuri care conține soluțiile antimicrobiene.
• Incubați farfuria:
  Incubați pentru o perioadă definită (de exemplu, 24 de ore) pentru a permite expunerea la antimicrobiene.

Pasul 3: Sonicarea cu sonicatorul cu plăci cu 96 de godeuri UIP400MTP

Etapa de sonicare este esențială pentru detașarea biofilmelor de capacele pentru a evalua viabilitatea. Urmați acești pași pentru sonicatorul UIP400MTP:

1. Pregătiți configurarea:
   Umpleți o farfurie proaspătă cu 96 de godeuri cu mediu de recuperare (de exemplu, bulion neutralizant sau mediu de creștere proaspăt) în fiecare godul.
2. Transferați capacul cuiului:
   Scoateți capacul cuiului de pe placa de tratament antimicrobian.
   Clătiți capacul cu soluție salină sterilă sau PBS pentru a elimina agenții antimicrobieni reziduali.
3. Poziționați placa și sonicatorul:
   Atașați capacul cuiului la placa mediului de recuperare.
   Așezați placa mediului de recuperare pe platforma UIP400MTP sonicatorului, asigurându-vă că placa este centrată și stabilă.
4. Reglați parametrii de sonicare:
   Setați parametrii de sonicare la UIP400MTP (setările pot fi ajustate la biofilm):
   Amplitudine: 70-100%.
   Timp de sonicare: 1-3 minute (reglați în funcție de robustețea biofilmului) în modul ciclu.
5. Sonicate:
   Începeți procesul de sonicare. Vibrația cu ultrasunete va disloca biofilmele de pe suprafețele cuiului în mediul de recuperare.
6. Monitorizați procesul:
   Utilizați senzorul de temperatură conectabil pentru a monitoriza temperatura probei în godeuri. UIP400MTP poate fi conectat la un răcitor de laborator pentru răcire.
7. Manipularea post-sonicare:
   Transferați imediat mediul de recuperare (care conține acum biofilme detașate) într-o placă sterilă proaspătă pentru analiză în aval.

(A) Placă care conține TSB cu glucoză 2% utilizată pentru formarea biofilmului, recuperarea celulară șideterminarea MIC și MBCB; (B) Capac cu știfturi pentru formarea biofilmelor stafilococice. determinarea MIC și MBCB; (B) Capac cu știfturi pentru formarea biofilmelor stafilococice.Celulele de biofilm formate pe pini au fost dislocate prin sonicare (Hielscher Ultrasound Technology) timp de 5 minute în plăci cu 96 de godeuri care conțin mediu de cultură proaspăt pentru recuperarea celulelor.(Imagine și studiu: ©de Oliveira et al., 2016)

Pasul 4: Evaluarea viabilității

Biofilme detașate pe placă și cultură:

1. Efectuați diluții în serie ale mediului de recuperare și ale plăcii pe agar pentru a enumera unitățile formatoare de colonii (UFC).
   Alternativ, utilizați un test de viabilitate colorimetric sau bazat pe fluorescență.
2. Rezultate înregistrați:
   Determinați MBEC ca fiind cea mai mică concentrație de antimicrobian care a eradicat viabilitatea biofilmului detectabil.

Proiectare, fabricație și consultanță – Calitate Made in Germany

Ultrasunetele Hielscher sunt binecunoscute pentru cele mai înalte standarde de calitate și design. Robustețea și operarea ușoară permit integrarea fără probleme a ultrasonicatoarelor noastre în instalațiile industriale. Condițiile dificile și mediile solicitante sunt ușor de gestionat de sonicatoarele Hielscher.

Hielscher Ultrasonics este o companie certificată ISO și pune un accent deosebit pe ultrasonicators de înaltă performanță cu tehnologie de ultimă oră și ușurință în utilizare. Desigur, ultrasonicators Hielscher sunt conforme CE și îndeplinesc cerințele UL, CSA și RoHs.

Citiți aici cum este utilizat UIP400MTP pentru detașarea biofilmului ca etapă de pregătire a probei în timpul protocolului ASTM E2799 pentru testarea eficacității dezinfectantului împotriva biofilmului Pseudomonas aeruginosa folosind testul MBEC.