Protocolul testului MBEC cu sonicatorul pentru plăci cu 96 de godeuri UIP400MTP

Testul MBEC este utilizat pentru a determina concentrația de agenți antimicrobieni necesară pentru eliminarea biofilmelor formate pe capacele cu știfturi. Pentru a evalua viabilitatea biofilmului, biofilmele trebuie mai întâi detașate de pe capacele cu știfturi ale unei plăci cu 96 de godeuri. Sonicarea este cea mai fiabilă și eficientă metodă pentru această detașare. Sonicatorul pentru plăci cu godeuri multiple UIP400MTP este conceput special pentru a procesa plăcile de testare cu eficiență și comoditate maxime, eficientizând și accelerând testele MBEC cu capacitate mare de procesare a probelor.

Sonicarea pentru detașarea biofilmului

Sonicarea este o etapă esențială în testele de concentrație minimă de eradicare a biofilmului (MBEC), permițând desprinderea eficientă a celulelor biofilmului de pe suprafața de care sunt atașate. Biofilmele sunt comunități de microorganisme cu o structură intrinsecă, încapsulate într-o matrice extracelulară, ceea ce le face semnificativ mai rezistente la agenții antimicrobieni în comparație cu celulele planctonice. În timpul testelor MBEC, sonicarea folosește unde ultrasonice pentru a genera cavitație controlată, care dezintegrează matricea biofilmului și eliberează celulele înglobate într-o suspensie. Această etapă asigură dispersarea uniformă a celulelor biofilmului în mediul de recuperare, facilitând evaluări precise ale viabilității prin însămânțare pe plăci, diluare sau metode spectrofotometrice. Fără o detașare corespunzătoare a biofilmului, componentele reziduale ale matricei ar putea proteja celulele, ducând la subestimarea eficacității antimicrobiene. Prin urmare, sonicarea este indispensabilă pentru obținerea unor valori MBEC fiabile și reproductibile, care reflectă potențialul real de eradicare al agenților testați. Sonicatorul pentru plăci cu godeuri multiple UIP400MTP permite prepararea facilă a probelor cu capacitate mare de procesare în plăcile de testare.

Protocolul testului de concentrație minimă de eradicare a biofilmului (MBEC)

Etapa 1: Formarea biofilmului

1. Pregătiți suspensia bacteriană:
   Cultivați bacteriile în medii adecvate până la faza de creștere logaritmică.
   Diluați cultura bacteriană până la o densitate optică definită (de exemplu, OD600 ~0,1).
2. Inoculați placa cu 96 de godeuri:
   Adăugați suspensia bacteriană (de exemplu, 150–200 µL) în fiecare godeu al unei plăci de microtitrare standard cu 96 de godeuri.
3. Atașați capacul cu știfturi:
   Așezați capacul cu știfturi pe placa inoculată pentru a permite formarea biofilmului pe suprafețele știfturilor.
4. Incubați placa:
   Incubați ansamblul la o temperatură adecvată (de exemplu, 37°C) timp de 24–48 de ore, fără agitare, pentru a favoriza creșterea biofilmului.

Etapa 2: Tratamentul cu agenți antimicrobieni

• Pregătiți soluțiile antimicrobiene:
  Pregătiți o serie de concentrații antimicrobiene în medii proaspete.
  Expuneți biofilmele la agenții antimicrobieni:
  Scoateți capacul cu știfturi din cultura bacteriană și clătiți-l în ser fiziologic steril sau PBS pentru a îndepărta celulele planctonice.
  Așezați capacul cu știfturi într-o nouă placă cu 96 de godeuri care conține soluțiile antimicrobiene.
• Incubați placa:
  Incubați pentru o perioadă definită (de exemplu, 24 de ore) pentru a permite expunerea antimicrobiană.

Etapa 3: Sonicarea cu sonicatorul pentru plăci cu 96 de godeuri UIP400MTP

Etapa de sonicare este esențială pentru detașarea biofilmelor de pe capacele cu știfturi în vederea evaluării viabilității. Urmați acești pași pentru sonicatorul UIP400MTP:

1. Pregătiți ansamblul:
   Umpleți fiecare godeu al unei plăci noi cu 96 de godeuri cu mediu de recuperare (de exemplu, bulion neutralizant sau mediu de creștere proaspăt).
2. Transferați capacul cu știfturi:
   Scoateți capacul cu știfturi de pe placa de tratament antimicrobian.
   Clătiți capacul cu știfturi în ser fiziologic steril sau PBS pentru a îndepărta agenții antimicrobieni reziduali.
3. Poziționați placa și sonicatorul:
   Atașați capacul cu știfturi la placa cu mediu de recuperare.
   Așezați placa cu mediu de recuperare pe platforma sonicatorului UIP400MTP, asigurându-vă că placa este centrată și stabilă.
4. Ajustați parametrii de sonicare:
   Setați parametrii de sonicare la UIP400MTP (setările pot fi ajustate în funcție de biofilm):
   Amplitudine: 70–100%.
   Timp de sonicare: 1–3 minute (ajustați în funcție de robustețea biofilmului) în modul ciclic.
5. Sonicați:
   Porniți procesul de sonicare. Vibrația ultrasonică va desprinde biofilmele de pe suprafețele știfturilor în mediul de recuperare.
6. Monitorizați procesul:
   Utilizați senzorul de temperatură conectabil pentru a monitoriza temperatura probelor din godeuri. UIP400MTP poate fi conectat la un răcitor de laborator pentru răcire.
7. Manipularea după sonicare:
   Transferați imediat mediul de recuperare (care conține acum biofilmele detașate) într-o placă sterilă nouă pentru analizele ulterioare.

(A) Placă ce conține TSB cu 2% glucoză, utilizată pentru formarea biofilmului, recuperarea celulelor și
determinarea MIC și MBCB; (B) Capac cu pini pentru formarea biofilmelor stafilococice. determinarea MIC și MBCB; (B) Capac cu pini pentru formarea biofilmelor stafilococice.
Celulele biofilmului formate pe pini au fost desprinse prin sonicare (Hielscher Ultrasound Technology) timp de 5 min în plăci cu 96 de godeuri care conțineau mediu de cultură proaspăt pentru recuperarea celulelor.
(Imagine și studiu: ©de Oliveira et al., 2016)

Etapa 4: Evaluarea viabilității

Însămânțați și cultivați biofilmele detașate:

1. Efectuați diluții seriale ale mediului de recuperare și însămânțați pe agar pentru a număra unitățile formatoare de colonii (UFC).
   Alternativ, utilizați un test de viabilitate colorimetric sau bazat pe fluorescență.
2. Înregistrați rezultatele:
   Determinați MBEC ca fiind cea mai mică concentrație de agent antimicrobian care a eradicat viabilitatea detectabilă a biofilmului.

Proiectare, fabricație și consultanță – calitate fabricată în Germania

Ultrasonicatoarele Hielscher sunt bine cunoscute pentru cele mai înalte standarde de calitate și design. Robustețea și operarea ușoară permit integrarea fără probleme a ultrasonicatoarelor noastre în instalațiile industriale. Condițiile dificile și mediile solicitante sunt gestionate cu ușurință de sonicatoarele Hielscher.

Hielscher Ultrasonics este o companie certificată ISO și pune un accent deosebit pe ultrasonicatoare de înaltă performanță, dotate cu tehnologie de ultimă generație și ușor de utilizat. Desigur, ultrasonicatoarele Hielscher sunt conforme CE și îndeplinesc cerințele UL, CSA și RoHs.

Citiți aici cum este utilizat UIP400MTP pentru detașarea biofilmului ca etapă de preparare a probelor în cadrul protocolului ASTM E2799 pentru testarea eficacității dezinfectanților împotriva biofilmului de Pseudomonas aeruginosa folosind testul MBEC.