Protocolul testului de concentrație minimă inhibitorie (MIC)

Testul de concentrație minimă inhibitorie (MIC) bazat pe biofilm este o metodă esențială pentru evaluarea eficacității agenților antimicrobieni împotriva microorganismelor asociate biofilmelor, care prezintă o rezistență crescută datorită matricei extracelulare protectoare. O etapă crucială a acestui test este detașarea structurilor de biofilm pentru eliberarea celulelor înglobate, în vederea unei evaluări exacte a viabilității. Sonicatorul pentru plăci cu godeuri multiple UIP400MTP facilitează acest proces prin utilizarea ultrasunetelor focalizate pentru a genera cavitație controlată, desprinzând eficient celulele din biofilm și dispersându-le într-o suspensie uniformă. Această dezagregare precisă și reproductibilă a biofilmului crește fiabilitatea și capacitatea de procesare a testelor MIC, făcând din UIP400MTP un instrument esențial pentru progresul cercetării biofilmelor.

De ce ar trebui să folosesc sonicarea în timpul testelor MIC?

• Date exacte și reproductibile: Obțineți suspensii celulare uniforme care elimină efectul de ecranare al matricei, asigurând că numărătorile de colonii și citirile densității optice reflectă cu adevărat eficacitatea antimicrobiană.
• Eficiență prin capacitate ridicată de procesare: Procesați simultan o placă întreagă cu 96 de godeuri în doar 1–3 minute, înlocuind răzuirea manuală lentă și inconsecventă cu un flux de lucru eficientizat.
• Viabilitate celulară păstrată: Desprindeți delicat celulele înglobate fără deteriorarea fizică provocată de răzuire, menținând rate de supraviețuire mai ridicate pentru calcule MIC/MBEC fiabile.
• Risc zero de contaminare încrucișată: Beneficiați de un design CupHorn fără contact, care tratează uniform toate godeurile, fără ca sondele să atingă probele sau godeurile individuale.
• Conformitate pregătită pentru standarde: Aliniați metodologia dumneavoastră cu protocoale industriale validate, precum ASTM E2799-22, conferind datelor dumneavoastră o credibilitate mai mare în scopuri de reglementare sau de publicare.
• Screening sigur al medicamentelor și tratamentelor: Bazați-vă pe rezultatele de sensibilitate pentru a lua decizii mai inteligente privind eficacitatea antimicrobiană, profilarea rezistenței sau dezvoltarea terapeutică.

Sonicarea pentru detașarea biofilmului

Testul MIC bazat pe biofilm măsoară de obicei viabilitatea bacteriană sau inhibarea creșterii prin metode precum însămânțarea pe plăci, numărarea coloniilor sau măsurători ale densității optice. Sonicarea este o etapă critică în testele MIC bazate pe biofilm atunci când se evaluează sensibilitatea antimicrobiană a microorganismelor asociate biofilmelor. Funcția sa principală este de a detașa și dispersa celulele înglobate în matricea biofilmului într-o suspensie uniformă, pentru o analiză exactă.
Biofilmele sunt semnificativ mai rezistente la agenții antimicrobieni comparativ cu celulele planctonice, ceea ce face ca detașarea corectă să fie critică pentru o analiză exactă. În timpul acestui proces, undele ultrasonice generează cavitație controlată, care dezagregă matricea biofilmului și eliberează celulele înglobate într-o suspensie uniformă în mediul de recuperare. Această etapă permite evaluări precise ale viabilității celulelor dispersate din biofilm prin metode precum însămânțarea pe plăci, diluția și numărarea coloniilor. Dezagregarea corectă a biofilmului prin sonicare împiedică componentele reziduale ale matricei să ecraneze celulele, ceea ce ar putea duce altfel la subestimarea activității antimicrobiene. Sonicatorul pentru plăci cu godeuri multiple UIP400MTP este deosebit de potrivit în acest scop, oferind condiții de sonicare precise și reproductibile pentru a asigura o pregătire fiabilă și cu capacitate ridicată de procesare a plăcilor de testare.

De ce este necesară sonicarea în testele de concentrație minimă inhibitorie bazate pe biofilm

Pentru măsurătorile de viabilitate și numărarea celulelor este necesară o detașare și o dispersie completă și fiabilă a celulelor individuale. UIP400MTP favorizează o detașare uniformă și nedistructivă a biofilmului și o dispersie a celulelor pentru rezultate robuste ale testelor.

• Complexitatea biofilmului: Biofilmele sunt comunități microbiene structurate, înglobate într-o matrice de substanțe polimerice extracelulare (EPS), care protejează microorganismele și le face mai rezistente la agenții antimicrobieni.
• Dispersie uniformă: Pentru a măsura cu exactitate viabilitatea celulelor înglobate în biofilm sau sensibilitatea acestora la antimicrobiene, biofilmul trebuie mai întâi desprins și dezagregat într-o suspensie omogenă.

Protocolul testului de concentrație minimă inhibitorie bazat pe biofilm

Testul de concentrație minimă inhibitorie (MIC) determină cea mai mică concentrație a unui agent antimicrobian necesară pentru a inhiba creșterea vizibilă a microorganismelor. Acest protocol este conceput pentru microorganismele asociate biofilmelor și utilizează sonicatorul pentru plăci cu godeuri multiple UIP400MTP pentru dezagregarea biofilmului.

Etapa 1: Pregătirea inoculului bacterian

1. Pregătiți suspensia bacteriană:
   Cultivați bacteriile în medii adecvate până la faza logaritmică medie.
   Diluați cultura pentru a obține o densitate celulară standardizată (de exemplu, standard McFarland 0,5 sau OD600 ~0,1).
2. Pregătiți soluțiile antimicrobiene:
   Diluați agentul antimicrobian într-un mediu adecvat pentru a crea o gamă de concentrații (de exemplu, diluții seriale binare).
3. Distribuiți în placa cu 96 de godeuri:
   Adăugați soluțiile antimicrobiene în godeurile unei plăci standard cu 96 de godeuri, cu un volum final per godeu de ~150–200 µL.
   Includeți controale de creștere (fără antimicrobian) și controale de sterilitate (fără inocul bacterian).

Etapa 2: Formarea biofilmului pe capacul cu pini

• Atașați capacul cu pini:
  Așezați capacul special cu pini pe godeurile inoculate, asigurându-vă că pinii sunt complet scufundați în suspensia bacteriană.
• Incubați placa:
  Incubați la temperatura adecvată (de exemplu, 37°C) pe o durată specificată (de exemplu, 24 de ore), în condiții statice, pentru a permite formarea biofilmului pe pini.

Etapa 3: Expunerea la antimicrobiene

• Clătiți pinii:
  Scoateți capacul cu pini din suspensia bacteriană și clătiți-l ușor în ser fiziologic steril sau PBS pentru a îndepărta celulele planctonice slab atașate.
• Expuneți la antimicrobiene:
  Transferați capacul cu pini într-o nouă placă cu 96 de godeuri care conține diluțiile antimicrobiene pregătite anterior.
  Incubați pe o perioadă definită (de exemplu, 24 de ore), în condiții statice, pentru a permite agentului antimicrobian să acționeze asupra biofilmelor.

Etapa 4: Sonicarea cu sonicatorul pentru microplăci UIP400MTP

Etapa de sonicare este critică pentru detașarea biofilmelor de pe capacele cu pini în vederea evaluării viabilității. Urmați acești pași pentru sonicatorul UIP400MTP:

1. Pregătiți configurația:
   Umpleți fiecare godeu al unei plăci noi cu 96 de godeuri cu mediu de recuperare (de exemplu, bulion de neutralizare sau mediu de creștere steril).
2. Transferați capacul cu pini:
   Scoateți capacul cu pini din placa de tratament antimicrobian.
   Clătiți capacul cu pini în ser fiziologic steril sau PBS pentru a îndepărta agenții antimicrobieni reziduali.
3. Poziționați placa în sonicator:
   Atașați capacul cu pini la placa cu mediu de recuperare.
   Așezați placa cu mediu de recuperare în sonicatorul UIP400MTP, asigurându-vă că placa stă centrată și stabil, așa cum este descris în manual.
4. Ajustați parametrii de sonicare:
   Setați parametrii de sonicare la UIP400MTP (setările pot fi ajustate în funcție de biofilm):
   Amplitudine: 70–100%.
   Timp de sonicare: 1–3 minute (ajustați în funcție de structura biofilmului) în modul ciclic.
5. Sonicați:
   Porniți procesul de sonicare. Undele ultrasonice vor dezagrega matricea biofilmului și vor desprinde celulele în mediul de recuperare.
6. Monitorizați procesul:
   Utilizați senzorul de temperatură conectabil pentru a monitoriza temperatura probelor din godeuri. UIP400MTP poate fi conectat la un răcitor de laborator pentru răcire.
7. Manipularea după sonicare:
   Transferați imediat mediul de recuperare care conține biofilmele detașate într-o placă sterilă nouă pentru analizele ulterioare.

(A) Placă ce conține TSB cu 2% glucoză, utilizată pentru formarea biofilmului, recuperarea celulelor și determinarea MIC și MBEC; (B) Capac cu pini pentru formarea biofilmelor stafilococice.
Celulele de biofilm formate pe pini au fost desprinse prin sonicare (Hielscher Ultrasound Technology) timp de 5 min în plăci cu 96 de godeuri care conțin mediu de cultură proaspăt pentru recuperarea celulelor.
(Imagine și studiu: ©de Oliveira et al., 2016)

Etapa 4: Evaluarea viabilității

Însămânțați și cultivați biofilmele detașate:

1. Efectuați diluții seriale ale mediului de recuperare și însămânțați pe agar pentru a număra unitățile formatoare de colonii (CFU).
2. Evaluați MIC:
   Determinați MIC ca fiind cea mai mică concentrație de antimicrobian care inhibă complet creșterea microbiană vizibilă în mediul de recuperare.

MIC Concentrația minimă inhibitorie: exemplu de microplacă de titrare și de interpretare a rezultatelor microdiluției.
(Studiu și imagine: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Cine beneficiază de sonicare în timpul testelor MIC?

• Producătorii de dispozitive medicale: Pentru a testa eficacitatea acoperirilor de suprafață și a valida protocoalele de curățare pentru dispozitivele predispuse la formarea de biofilm.
• Microbiologii clinicieni: Pentru a diagnostica cu exactitate infecțiile asociate implanturilor (precum PJI) prin recuperarea bacteriilor de pe componentele medicale.
• Dezvoltatorii de produse farmaceutice: Pentru a evalua eficacitatea noilor agenți antimicrobieni împotriva agenților patogeni rezilienți înglobați în biofilm.
• Cercetătorii din mediul academic: Pentru a realiza studii reproductibile, cu capacitate ridicată de procesare, privind biologia biofilmelor și mecanismele de rezistență antimicrobiană.
• Echipele de control al calității industriale: Pentru a evalua biofoulingul și eficacitatea dezinfectanților în mediile industriale (de exemplu, utilizând standardele ASTM E2799-22).

Proiectare, fabricație și consultanță – Calitate Made in Germany

Ultrasonicatoarele Hielscher sunt bine cunoscute pentru cele mai înalte standarde de calitate și design. Robustețea și operarea ușoară permit integrarea fără probleme a ultrasonicatoarelor noastre în instalațiile industriale. Condițiile dificile și mediile solicitante sunt gestionate cu ușurință de sonicatoarele Hielscher.

Hielscher Ultrasonics este o companie certificată ISO și pune un accent deosebit pe ultrasonicatoarele de înaltă performanță, care îmbină tehnologia de ultimă generație cu ușurința în utilizare. Desigur, ultrasonicatoarele Hielscher sunt conforme CE și îndeplinesc cerințele UL, CSA și RoHs.

Citiți aici cum este utilizat UIP400MTP pentru detașarea biofilmului în protocolul ASTM E2799 – Testarea eficacității dezinfectanților împotriva biofilmului de Pseudomonas aeruginosa utilizând testul MBEC.