Protocol de testare a concentrației minime inhibitorii (MIC)
Testul de concentrație minimă inhibitorie (MIC) bazat pe biofilm este o metodă esențială pentru evaluarea eficacității agenților antimicrobieni împotriva microorganismelor asociate biofilmului, care prezintă o rezistență sporită datorită matricei lor extracelulare protectoare. Un pas crucial în acest test este întreruperea structurilor biofilmului pentru a elibera celule încorporate pentru o evaluare precisă a viabilității. Sonicatorul cu plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP facilitează acest proces prin utilizarea ultrasunetelor focalizate pentru a genera cavitație controlată, detașând eficient celulele biofilmului și dispersându-le într-o suspensie uniformă. Această perturbare precisă și reproductibilă a biofilmului îmbunătățește fiabilitatea și randamentul testelor MIC, făcând din UIP400MTP un instrument esențial în avansarea cercetării biofilmului.
Sonicare pentru detașarea biofilmului
Testul MIC bazat pe biofilm măsoară de obicei viabilitatea bacteriană sau inhibarea creșterii folosind metode precum placarea, numărarea coloniilor sau măsurătorile densității optice. Sonicarea este un pas critic în testele MIC bazate pe biofilm atunci când se evaluează susceptibilitatea antimicrobiană a microorganismelor asociate biofilmului. Funcția sa principală este de a detașa și dispersa celulele încorporate în matricea biofilmului într-o suspensie uniformă pentru o analiză precisă.
Biofilmele sunt semnificativ mai rezistente la agenții antimicrobieni în comparație cu celulele planctonice, ceea ce face ca detașarea adecvată să fie esențială pentru o analiză precisă. În timpul acestui proces, undele ultrasonice generează cavitație controlată, rupând matricea biofilmului și eliberând celulele încorporate într-o suspensie uniformă în mediul de recuperare. Acest pas permite evaluări precise ale viabilității celulelor dispersate în biofilm prin metode precum placarea, diluarea și numărarea coloniilor. Întreruperea adecvată a biofilmului prin sonicare împiedică componentele matricei reziduale să protejeze celulele, ceea ce ar putea duce la o subestimare a activității antimicrobiene. Sonicatorul cu plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP este deosebit de potrivit în acest scop, oferind condiții de sonicare precise și reproductibile pentru a asigura o pregătire fiabilă și de mare randament a plăcilor de testare.
UIP400MTP sonicator pentru microplăci pentru detașarea biofilmului controlabilă cu precizie în testele MIC și MBEC.
De ce este necesară sonicarea în testele de concentrație minimă de inhibitori pe bază de biofilm
Pentru măsurătorile de viabilitate și numărarea celulelor, este necesară o detașare și dispersie completă și fiabilă a celulelor individuale. UIP400MTP promovează o detașare uniformă, nedăunătoare a biofilmului și dispersia celulară pentru rezultate robuste ale testului.
- Complexitatea biofilmului: Biofilmele sunt comunități microbiene structurate încapsulate într-o matrice de substanțe polimerice extracelulare (EPS), care protejează microorganismele și le face mai rezistente la agenții antimicrobieni.
- Dispersie uniformă: Pentru a măsura cu precizie viabilitatea celulelor încorporate în biofilm sau susceptibilitatea lor la antimicrobiene, biofilmul trebuie mai întâi dislocat și descompus într-o suspensie omogenă.
Protocol de testare a concentrației minime inhibitorii pe bază de biofilm
Testul de concentrație minimă inhibitorie (MIC) determină cea mai mică concentrație a unui agent antimicrobian necesară pentru a inhiba creșterea vizibilă a microorganismelor. Acest protocol este conceput pentru microorganisme asociate biofilmului, folosind UIP400MTP sonicator cu plăci cu mai multe godeuri pentru perturbarea biofilmului.
Pasul 1: Pregătirea inoculului bacterian
- Pregătiți suspensia bacteriană:
Creșteți bacterii în medii adecvate până la faza logaritmică medie.
Se diluează cultura pentru a obține o densitate celulară standardizată (de exemplu, 0,5 standard McFarland sau OD600 ~ 0,1). - Pregătiți soluții antimicrobiene:
Diluați agentul antimicrobian într-un mediu adecvat pentru a crea o gamă de concentrații (de exemplu, diluții în serie duble). - Se distribuie în placa cu 96 de godeuri:
Adăugați soluțiile antimicrobiene în godeurile unei plăci standard cu 96 de godeuri, cu un volum final de ~150-200 μL.
Includeți controale de creștere (fără antimicrobiene) și controale ale sterilității (fără inocul bacterian).
Pasul 2: Formarea biofilmului pe capacul Peg
- Atașați capacul cuiului:
Așezați capacul specializat pe godeurile inoculate, asigurându-vă că știfturile sunt complet scufundate în suspensia bacteriană. - Incubați farfuria:
Incubați la temperatura adecvată (de exemplu, 37 ° C) pentru o durată specificată (de exemplu, 24 de ore) în condiții statice pentru a permite formarea biofilmului pe cuie. - Clătiți cuiele:
Scoateți capacul cuiului din suspensia bacteriană și clătiți ușor cu soluție salină sterilă sau PBS pentru a îndepărta celulele planctonice slab atașate. - Expuneți la antimicrobiene:
Transferați capacul cuiului într-o nouă placă cu 96 de godeuri care conține diluțiile antimicrobiene preparate anterior.
Incubați pentru o perioadă definită (de exemplu, 24 de ore) în condiții statice pentru a permite agentului antimicrobian să acționeze asupra biofilmelor.
Pasul 3: Expunerea la antimicrobiene
Sonicator cu plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP pentru prepararea probelor cu randament ridicat
Pasul 4: Sonicarea cu Microplate Sonicator UIP400MTP
Etapa de sonicare este esențială pentru detașarea biofilmelor de capacele pentru a evalua viabilitatea. Urmați acești pași pentru sonicatorul UIP400MTP:
- Pregătiți configurarea:
Umpleți o farfurie proaspătă cu 96 de godeuri cu mediu de recuperare (de exemplu, bulion neutralizant sau mediu de creștere steril) în fiecare godea. - Transferați capacul cuiului:
Scoateți capacul cuiului de pe placa de tratament antimicrobian.
Clătiți capacul cu soluție salină sterilă sau PBS pentru a elimina agenții antimicrobieni reziduali. - Poziționați placa în sonicator:
Atașați capacul cuiului la placa mediului de recuperare.
Așezați placa mediului de recuperare în sonicatorul UIP400MTP, asigurându-vă că placa este centrată și stabilă ca în manualul descris. - Reglați parametrii de sonicare:
Setați parametrii de sonicare la UIP400MTP (setările pot fi ajustate la biofilm):
Amplitudine: 70-100%.
Timp de sonicare: 1-3 minute (reglați în funcție de structura biofilmului) în modul ciclu. - Sonicate:
Începeți procesul de sonicare. Undele ultrasonice vor perturba matricea biofilmului și vor disloca celulele în mediul de recuperare. - Monitorizați procesul:
Utilizați senzorul de temperatură conectabil pentru a monitoriza temperatura probei în godeuri. UIP400MTP poate fi conectat la un răcitor de laborator pentru răcire. - Manipularea post-sonicare:
Transferați imediat mediul de recuperare care conține biofilme detașate într-o placă sterilă proaspătă pentru analiză ulterioară.
(A) Placă care conține TSB cu glucoză 2% utilizată pentru formarea biofilmului, recuperarea celulară și determinarea MIC și MBEC; (B) Capac cu știfturi pentru formarea biofilmelor stafilococice.
Pasul 4: Evaluarea viabilității
Biofilme detașate pe placă și cultură:
- Efectuați diluții în serie ale mediului de recuperare și ale plăcii pe agar pentru a enumera unitățile formatoare de colonii (UFC).
- Evaluați MIC:
Determinați MIC ca fiind cea mai mică concentrație antimicrobiană care inhibă complet creșterea microbiană vizibilă în mediul de recuperare.
Concentrația minimă inhibitorie MIC: Exemplu de placă de microtitrare și interpretarea rezultatelor microdiluției.
Proiectare, fabricație și consultanță – Calitate Made in Germany
Ultrasunetele Hielscher sunt binecunoscute pentru cele mai înalte standarde de calitate și design. Robustețea și operarea ușoară permit integrarea fără probleme a ultrasonicatoarelor noastre în instalațiile industriale. Condițiile dificile și mediile solicitante sunt ușor de gestionat de sonicatoarele Hielscher.
Hielscher Ultrasonics este o companie certificată ISO și pune un accent deosebit pe ultrasonicators de înaltă performanță cu tehnologie de ultimă oră și ușurință în utilizare. Desigur, ultrasonicators Hielscher sunt conforme CE și îndeplinesc cerințele UL, CSA și RoHs.
Eficientizați pregătirea probelor în plăci cu 96 de godeuri și plăci de testare folosind sonicatorul cu plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP
Literatură? Referințe
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Întrebări frecvente
Ce este testul MIC?
Testul de concentrație minimă inhibitorie (MIC) este un test standardizat utilizat pentru a determina cea mai mică concentrație a unui agent antimicrobian necesară pentru a inhiba creșterea vizibilă a unui microorganism. Se efectuează în mod obișnuit folosind metode de microdiluare a bulionului sau de diluare agar, unde microorganismele sunt expuse la diluții în serie ale agentului antimicrobian. Testele MIC sunt esențiale pentru evaluarea eficacității antimicrobiene, ghidarea tratamentului clinic și evaluarea nivelurilor de rezistență atât la microorganismele planctonice, cât și la cele asociate biofilmului.
Care este diferența dintre testul de concentrație minimă inhibitorie bazat pe biofilm și testul MBIC?
Testul de concentrație minimă inhibitorie (MIC) bazat pe biofilm și testul de concentrație minimă inhibitorie a biofilmului (MBIC) sunt înrudite, dar distincte în scopul și metodologia lor.
Testul MIC bazat pe biofilm evaluează cea mai mică concentrație a unui agent antimicrobian necesar pentru a inhiba creșterea sau viabilitatea vizibilă a biofilmului, concentrându-se mai degrabă pe celulele asociate cu biofilmul decât pe bacteriile planctonice. În schimb, testul MBIC măsoară în mod specific capacitatea unui agent antimicrobian de a preveni formarea biofilmului, mai degrabă decât tratarea biofilmelor preformate. În timp ce ambele teste se ocupă de bacterii asociate biofilmului, testul MIC bazat pe biofilm se adresează tratamentului, iar testul MBIC pune accentul pe prevenție, făcându-le instrumente complementare pentru studierea eficacității antimicrobiene împotriva biofilmelor.
Ce biofilme sunt utilizate în testele MIC?
Biofilmele microbiene și celulele planctonice sunt ambele utilizate în testele de concentrație minimă inhibitorie (MIC) pentru a studia eficacitatea antimicrobiană în diferite condiții.
- Celule planctonice:
Celulele planctonice sunt celule microbiene unice care plutesc liber, care servesc drept model standard pentru testele MIC tradiționale. Microorganismele comune includ Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus și Candida albicans. Aceste teste determină CMI necesar pentru a inhiba creșterea celulelor libere și sunt esențiale pentru screeningul antimicrobian inițial. - Celule asociate biofilmului:
Celulele biofilmului sunt microorganisme încorporate într-o matrice extracelulară, ceea ce le crește semnificativ rezistența la antimicrobiene. Testele MIC cu biofilm includ adesea:- Bacterii Gram-negative: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa și Klebsiella pneumoniae, cunoscute pentru formarea biofilmului în infecții și medii industriale.
- Bacterii gram-pozitive: Staphylococcus aureus (inclusiv MRSA), Staphylococcus epidermidis și Enterococcus faecalis, implicate în mod obișnuit în infecțiile legate de dispozitiv.
- Ciuperci: Candida albicans și specii înrudite, importante în infecțiile fungice legate de biofilm.
- Biofilme cu specii mixte: Acestea sunt uneori folosite pentru a reproduce biofilmele polimicrobiene naturale, cum ar fi cele găsite în rănile cronice sau în biovegetația industrială.
Prin compararea valorilor MIC pentru celulele planctonice și celulele asociate biofilmului, cercetătorii pot evalua rezistența sporită a biofilmelor și pot identifica agenți eficienți împotriva acestor comunități microbiene mai rezistente.
Care este diferența dintre MIC și MBEC?
Concentrația minimă inhibitorie (MIC) este cea mai mică concentrație a unui agent antimicrobian necesară pentru a preveni formarea biofilmului, în timp ce concentrația minimă de eradicare a biofilmului (MBEC) este cea mai mică concentrație necesară pentru a eradica un biofilm stabilit. MIC se concentrează pe prevenirea biofilmului, în timp ce MBEC evaluează eficacitatea tratamentului împotriva biofilmelor mature.
Ce plăci sunt utilizate în mod obișnuit pentru testele MBEC?
Plăcile de microtitru utilizate în mod obișnuit pentru testele MBEC sunt de obicei plăci cu 96 de godeuri din polistiren sau polipropilenă. Aceste materiale oferă o suprafață adecvată pentru formarea biofilmului și sunt rezistente chimic la agenții antimicrobieni testați în timpul testului. Plăcile de polistiren sunt preferate pe scară largă datorită clarității lor optice, care este avantajoasă pentru analizele din aval, cum ar fi măsurătorile spectrofotometrice sau bazate pe fluorescență. Designul acestor plăci include capace detașabile, care sunt esențiale pentru testare, deoarece biofilmele se formează pe cuiele care sunt scufundate în godeurile care conțin medii de creștere. Plăcile standardizate, cum ar fi cele conforme cu protocolul de testare MBEC, sunt special proiectate pentru a asigura reproductibilitatea și compatibilitatea cu sonicatorul UIP400MTP sau alte echipamente de procesare.
Ce sunt plăcile PEG-Capac?
Plăcile cu capac PEG sunt sisteme specializate de plăci cu mai multe godeuri în care capacul este echipat cu mici știfturi sau știfturi de polietilen glicol (PEG) care se extind în fiecare puț. Aceste cârlige oferă o suprafață pentru formarea biofilmului microbian în condiții controlate, imitând creșterea biofilmului din lumea reală. Designul permite biofilmelor să se dezvolte pe cuie, în timp ce godeurile conțin medii de creștere sau agenți antimicrobieni, permițând testarea cu randament ridicat a susceptibilității biofilmului la tratamente, cum ar fi în testele MBEC, MBIC și MIC.
Care este avantajul dislocării biofilmului cu ultrasunete în comparație cu răzuirea celulelor?
Dislocarea biofilmului cu ultrasunete oferă un avantaj semnificativ față de răzuirea celulară, oferind o metodă non-invazivă, uniformă și extrem de eficientă pentru îndepărtarea biofilmelor de pe suprafețe. Spre deosebire de răzuire, care poate fi inconsecventă și poate deteriora suprafața sau celulele subiacente, undele ultrasonice pătrund în matricea biofilmului, rupându-l fără a compromite integritatea structurilor adiacente. Această metodă asigură reproductibilitatea, minimizează riscul de contaminare și este deosebit de eficientă pentru aplicațiile care necesită îndepărtarea precisă a biofilmului, cum ar fi studiile microbiologice sau testarea dispozitivelor medicale. Citiți mai multe cum UIP400MTP Sonicator excelează în răzuirea celulelor!
Hielscher Ultrasonics produce omogenizatoare cu ultrasunete de înaltă performanță de la Laborator spre dimensiunea industrială.